一株糞腸球菌hew-a131及其應用的製作方法

2023-06-07 19:50:01

一株糞腸球菌hew-a131及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株耐熱性強、耐酸鹼範圍寬泛、抗逆性、益生性更強的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131，該菌株已於2014年6月17日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.9353，分類命名為糞腸球菌Enterococcus faecalis。糞腸球菌HEW-A131具有優良的微生物學特性、顯著的益生性及抗逆性和超強的發酵性能，不但可以提高動物的飼料利用效率，節約成本，而且大大改善了動物體內消化道內環境的穩態，促進營養的吸收利用，促進動物生長，顯著提高了動物的生產性能、免疫性能和繁殖性能，降低了生產成本，提高了經濟效益。
CGMCC NO.9353
2014.06.17
【專利說明】-株糞腸球菌HEW-A131及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及糞腸球菌，特別涉及一株糞腸球菌（Enterococcus faecalis) HEW-Al 31及其應用。

【背景技術】
[0002] 乳酸菌是一類重要的益生菌，是動物腸道中一類重要的優勢菌群。乳酸菌製劑作 為一種新型的綠色動物微生態製劑，因其無毒、無抗藥性、無殘留、無副作用而備受飼料界 的廣泛關注。採用乳酸菌作為益生菌飼餵動物，除了由於乳酸菌具有一定的營養作用和對 腸道的粘附作用外，主要在於乳酸菌對於一些腐敗菌和有害菌具有抑制作用。第一，乳酸菌 可以產生乳酸，創造酸性環境抑制有害菌及不耐酸的腐敗菌生長；第二，乳酸菌產生H 2O2, 激活過氧化氫酶-硫氰酸系統，抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過氧化氫酶陽性細菌等；第三， 部分乳酸菌可以產生抑菌性的細小蛋白質或肽類，稱為細菌素，對大腸桿菌等致病菌有拮 抗作用。而且，有了產生抑菌蛋白的乳酸菌，就可以生產細菌素，可以替代抗生素，使動物生 產更安全。分離篩選可以產生細菌素的乳酸菌成為現在益生菌開發的研究熱點。
[0003] 糞鏈球菌又叫糞腸球菌(^Enterococcus faecalis)，其菌體形態為鏈球或球狀，菌 體直徑大小〇. 3 y m?0. 7 y m，無芽孢；稀釋後在肉湯瓊脂平板上形成的菌落圓形、乳白色， 表面凸起溼潤，有光澤，邊緣整齊，大多數成雙或短鏈狀排列，通常不運動。糞鏈球菌是目 前微生物青貯接種劑主要菌種之一，它經過系列工藝製成的微生物製劑直接投餵養殖動物 後，有利於改善腸道內微生態平衡，防治動物腸道菌叢區系紊亂，還能分解蛋白質為小肽、 合成B族維生素等功效。它也能增強巨嗜細胞的活性，促進動物的免疫反應，提高抗體水 平。糞鏈球菌的生理特性有如下幾點：（1)糞鏈球菌分泌的乳酸為L型乳酸，又稱為自然乳 酸或生理乳酸，可全被動物吸收利用。乳酸桿菌分泌的乳酸L型和D型都有，但D型則不能 被動物吸收利用。在動物的腸道裡。糞鏈球菌可在腸內形成生物薄膜附著在腸道黏膜上，可 以在腸道內發育、生長、繁殖，繁殖時問很短，19min分裂一次。糞鏈球菌還可把部分蛋白質 分解成醯胺和胺基酸，把大部分的碳水化合物的無氮浸出物轉化為乳酸，而且能使飼料裡 的纖維變軟，所以飼料的轉化吸收率就比較高。糞鏈球菌分解的這些特殊營養成分彌補了 常規餌料的營養缺陷，對各種養殖動物幼體起到了十分重要的營養強化和促生長作用。（2) 糞鏈球菌產生的抗菌物質大多是肽或蛋白質，被稱為細菌素。糞鏈球菌可分泌兩類細菌素， 一類僅只是對相關的菌有抑制作用，抗菌譜較窄，可阻礙病原微生物接觸腸黏膜細胞；另一 類具有廣譜抗菌活性，它們對致病菌如：沙門氏菌、致賀氏病和假單孢菌都有很好的抑制 作用。所以，長期在飼料中添加糞鏈球菌可以減少養殖動物腸炎等疾病的發生。糞鏈球菌 在生長和代謝過程中產生對養殖動物有益的營養物質，如乳酸、胺基酸、維生素、酶及抑菌 物質。在畜禽養殖過程中，添加了糞鏈球菌不僅有利於提高飼料的消化率，同時也相應降低 了排洩物中的氨態氮的濃度，減少了排洩物的不消化物，改善了飼養環境，減少了汙染，既 有防腐作用又增加飼料的風味，促進養殖動物的食慾。（3)由於飼料中餅柏、麥麩等農副產 品中的植酸磷含量較高，對鈣等礦物質元素利用造成影響，而在糞鏈球菌的生理作用下通 過催化、水解等反應分泌出的L-乳酸，它可以對鈣質合成L-乳酸鈣，促進養殖動物對鈣質 的吸收。所以飼料中添加糞鏈球菌可減少養殖中有機物和礦物質排洩量有效地減少水質汙 染。
[0004] 屎腸球菌（Enterococcus faecium)屬於腸球菌中的一種，是兼性厭氧的乳酸菌， 它不僅是人和動物腸道中常見的正常菌種，還用於改善食品、飼料的質量。屎腸球菌相對於 嚴格厭氧、培養保存條件苛刻的雙歧桿菌、乳桿菌來說，它是便於生產和使用的首選菌種。 1989年美國FDA就公布它為可直接用於動物的菌種之一。大量實驗證明，由屎腸球菌組成 的益生素可提高幼年畜禽的體增重，改善飼料報酬，減少腹瀉率，降低死亡率。另外，屎腸球 菌代謝產生有機酸、雙乙醯、過氧化氫、細菌素等物質，這些物質具有抑制病原菌和腐敗菌、 提高免疫力、改善畜產品品質等生理功效。因此，屎腸球菌在畜牧生產中有著廣泛的應用發 展前景。其特性主要有以下幾點：（1)耐胃酸：新生仔豬胃內的PH值在5?6之間，出生後 由於高產酸細菌定植而逐漸下降，數小時後PH值可降到4,然後緩慢下降，在2月齡前pH值 仍保持在3左右。屎腸球菌由於其耐胃酸因此它能通過胃而存活下來。（2)耐膽鹽：哺乳仔 豬膽囊內膽汁分泌量很少，膽汁量在出生後3周內緩慢增加，小腸內膽鹽濃度在0. 03%? 0.30%範圍內波動。大量試驗表明，篩選得到的屎腸球菌可耐受1.0%的膽鹽濃度，甚至高 達3. 0%和5%?6. 5% NaCl高鹽。可見，屎腸球菌具有良好的耐膽鹽性能及對胃腸道逆 性環境的耐受性，具備了在小腸定植的基本條件。（3)具有良好的粘附力：屎腸球菌在消化 道中的粘附力僅次乾酪乳桿菌。屎腸球菌能順利通過胃腸不利環境，在腸壁上的粘附是其 定植並大量繁殖變成優勢種群的前提，另外，其對腸上皮細胞有較強的粘附力是其作為益 生菌菌株的重要前提之一。（4)耐藥性與抑菌作用：屎腸球菌具有對廣譜抗生素的耐藥性。 有試驗表明，屎腸球菌對飼料添加劑中大多數常用抗生素都具有耐藥性。除了對抗生素具 有耐藥性外，還對常見病原菌、強毒菌株有較強的抑制作用，這與是屎腸球菌代謝過程中產 生乳酸、乙酸、異丁酸、乙醇、2, 3- 丁二醇、細菌素等物質有關，這些物質具有抑制病原菌和 腐敗菌的作用。（5)耐熱性：屎腸球菌不僅能抵抗動物胃腸道不利的環境，而且能耐受飼料 制粒過程中的高溫，但後者往往是許多益生菌無法達到的，這就阻礙了益生菌在顆粒飼料 中的廣泛利用。
[0005] 產生細菌素的乳酸菌來源很多，購買的工業菌株和標準菌株，有很多也可以產生 細菌素，環境、土壤、泡菜、酸奶中都可以分離乳酸菌。然而益生菌最後要飼餵動物，那麼相 對於其他來源的菌株，動物無疑是乳酸菌的最好來源。來自動物腸道的乳酸菌可以適應動 物腸道環境，耐受動物的胃酸和膽鹽的消化，無疑是最好的益生菌來源。可見，通過從動物 腸道分離和篩選能夠產生細菌素的乳酸菌將是動物用益生菌篩選的重要研究方向。
[0006] 中國專利 CN 102031235 B 公開了 一 種奠腸球菌（Enterococcus faecium) ANSE228,其保藏編號為CGMCC No. 4082。還提供上述糞腸球菌ANSE228在抑制雞白痢沙門 氏菌和/或大腸桿菌和/或金黃色葡萄球菌中的應用。所述糞腸球菌ANSE228是通過反覆 分離、純化、復壯等工藝得到，具有生物活性強、益生性顯著並且抗逆性能好等優點。中國專 利CN 103074281 A公開了一株奠腸球菌（Enterococcus faecalis)FJL19,其保藏編號為 CGMCC No. 6995。同時還提供了上述糞腸球菌FJL19具有抑制雞腸道中大腸桿菌生長、促進 雛雞生長的作用。從籠養成年蛋雞空腸中分離出糞腸球菌FJL19,此菌株生長旺盛，18小時 培養菌數就可達5. I X 109CfU/ml，且具有抑菌作用，可以利用培養基生產抑菌蛋白，降低雛 雞腸道大腸桿菌數量；通過此乳酸菌製備菌製劑飼餵雛雞，可以提高雛雞的生長；因此糞 腸球菌F幾19在動物飼養尤其是家禽新型飼料添加劑開發和抗生素替代品研究上具有重 大的社會意義和經濟價值。
[0007] 上述公開專利中的糞腸球菌耐熱性、耐酸鹼性、發酵性能、抑菌性能等還不太理 想，不能適應日益發展的工業化需求，尤其離目前飼料工業及畜牧養殖業目標還有一定差 距，因此，分離、純化更加適合畜牧業發展需求的益生糞腸球菌菌株仍是本領域技術人員的 責任和追求。


【發明內容】

[0008] 本發明所解決的技術問題是克服現有糞腸球菌的缺陷，提供一株耐熱性強、耐酸 鹼範圍寬泛、抗逆性、益生性更強的糞腸球菌（Enterococcus faecalis)HEW_A131。
[0009] 本發明提供的糞腸球菌（Enterococcus faecalis)HEW_A131是從籠養成年蛋雞盲 腸內容物中分離的乳酸菌菌株，經過菌落形態觀察、發酵性能測試、抑菌性能測試等篩選得 到的目標菌株，該菌株耐熱性強、耐酸鹼範圍寬泛、抗逆性、益生性更加顯著。
[0010] 本發明提供的奠腸球菌（Enterococcus faecalis)HEW-A131 已於 2014 年 6 月 17 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝 陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏編號為CGMCC NO. 9353,分類命名為奠腸球菌 Enterococcus faecalis。
[0011] 本發明提供的糞腸球菌（Enterococcus faecalis)HEW_A131具有以下微生物學特 徵：糞腸球菌HEW-A131是革蘭氏陽性菌，在腸球菌瓊脂培養基上生長迅速，35°C培養24h 形成白色、圓形、邊緣光滑整齊、凸起、直徑為1?1.5mm的菌落，並且周圍有藍黑色環帶， 菌落形態如圖1，顯微鏡下菌體呈卵圓形、成對成鏈存在、無芽孢，兼性厭氧生長，經革蘭氏 染色後菌株形態如圖2 ;糞腸球菌HEW-A131生長適宜溫度範圍：4°C -65°C，最適生長溫度： 20°C -45°C ;生長適宜pH 1. 5-11，最適pH值為6-8。部分生理生化特性如表1。
[0012] 本發明中所述糞腸球菌HEW-A131的培養方法如下：
[0013] 取糞腸球菌HEW-A131種子液l-5mL(種子液是挑取的單個菌落在種子液培養基中 培養的，其活菌濃度以10 9CFU/mL計；種子液的培養基和培養條件與發酵的培養基和培養條 件相同），接種到300mL培養基中，進行搖瓶發酵培養。
[0014] 所述培養基由如下組分組成：蔗糖1-5%，大豆蛋白腖0.5-2. 5%，酵母提取物 0? 1-1. 0%，MgSO4 ? 7H200. 05-0. 2%，MnSO4 ? 4H200. 01-1. 0%，NaClO. 1-2. 0%，檸檬酸二銨 0. 1-0. 5%，CaC030. 1-1.0%，餘量為水，pH7. 0±0. 2 ;其中，優選為：鹿糖2. 5%，大豆蛋白腖 1. 8%，酵母提取物 0? 4%，MgSO4 ? 7H200. 2%，MnSO4 ? 4H20 0? 045%，NaClO. 2%，檸檬酸二 銨 0? 2 %，CaCO3O. 6 %，餘量為水，pHL 0 ±〇2。
[0015] 所述搖瓶發酵的條件為：發酵溫度30-45°C，發酵時間5-20h，pH值6. 5-7. 5,轉速 為100-300r/m ;優選為：發酵溫度為35°C、pH值7. 0、攪拌轉速180r/m，發酵時間7h。
[0016] 50L發酵罐中試培養基與搖瓶發酵培養基相同。50L發酵罐中試發酵條件為：裝 液量為20-40L培養基，接種量為200-600mL搖瓶種子液，發酵溫度為30-45°C，發酵時間 5-20h，pH值6. 5-7. 5,攪拌轉速100-300r/min。其中，優選為：裝液量為30L培養基，接種 量為300mL，發酵溫度為35°C，發酵時間8h，pH值7. 0,攪拌轉速110r/min。
[0017] 本發明糞腸球菌HEW-A131具有顯著的益生性，可有效抑制大腸桿菌 (Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、沙門氏菌（Salmonella sp.)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae)、志賀氏菌屬（Shigella sp.)、韋榮氏球 菌（Veillonella sp.)、綠胺桿菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)的生長繁殖。
[0018] 本發明糞腸球菌HEW-A131具有較強的抗逆性，可以耐受模擬胃酸、模擬膽鹽以及 高溫環境，並且能保持90%以上的活菌存活率。
[0019] 本發明糞腸球菌HEW-A131可有效維持動物腸道菌群平衡，改善腸道性能，提高動 物生產性能。
[0020] 本發明糞腸球菌HEW-A131的益生性的檢驗方法如下：
[0021] 在無菌操作臺上，將病原菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、肺炎克雷 伯氏菌、志賀氏菌屬、韋榮氏球菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、多殺性巴氏桿菌）濃度為 IO 9CFUAiL的菌懸液IOmL與90mL與冷卻至45°C的NA固體培養基（滅菌後）混勻，製備成 厚度4mm左右的病原菌NA平板，將滅菌的牛津杯（內徑6mm、外徑8mm、高IOmm的圓形小 管，管的兩端要光滑）放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，待數分鐘後， 分別向各小管中滴加200 y L的本發明製備的發酵液，勿使其外溢，30°C _40°C培養20-36h， 然後測量抑菌圈直徑。每個實驗三個重複，取平均值。
[0022] 其中，所述病原菌NA平板是將121°C高溫滅菌後的NA培養基與病原菌菌懸液混勻 後，倒入滅菌後的平板，冷卻後形成表面光滑的4mm厚的病原菌NA平板。所述NA固體培養 基的配方為：蛋白腖1%，牛肉膏0.3%，瓊脂2%，NaCl 0.5%，餘量為水，pH 7. 2±0. 2。
[0023] 本發明糞腸球菌HEW-A131抗逆性的檢驗方法如下：
[0024] 1、高溫耐受試驗：取IOmL本發明製備得到的發酵液注入到試管1中，採用十倍逐 級稀釋，取ImL稀釋液在平板上，將滅菌後冷卻至45°C的MRS瓊脂培養基傾注在平板（滅 菌）上，迅速搖勻。再將裝有IOmL本發明製備得到的發酵液的試管2置於80°C水浴鍋中加 熱15min，取加熱後的糞腸球菌HEW-A131發酵液進行十倍逐級稀釋，取ImL稀釋液在平板 上，將滅菌後冷卻至45°C的MRS瓊脂培養基傾注在平板（滅菌）上並迅速搖勻。最後將加 熱前和加熱後的平板均在35°C條件下培養24h，計算糞腸球菌HEW-A131加熱前後的數量。
[0025] 2、模擬胃液及腸液的耐受試驗：取100g/L的鹽酸16. 4mL加蒸餾水稀釋，使pH值 分別為I. 5、2. 5和3. 5,取IOOmL稀鹽酸溶液，分別加入Ig胃蛋白酶，使其充分溶解，得模擬 胃液，微孔濾膜除菌（〇. 22 ii m)備用。取磷酸二氫鉀6. 8g，加水500mL使溶解，用0. ImoL/ L氫氧化鈉溶液調節pH值至6. 8 ;另取胰蛋白酶10g，加水適量使溶解，將兩液混合後，加水 稀釋至1000ml，得模擬腸液，微孔濾膜除菌（0. 22 ii m)備用。取ImL糞腸球菌HEW-A131發 酵液加入到9mL的模擬胃液中（即十倍逐級稀釋），並迅速在振蕩器上充分混勻，然後置於 30-45°C靜置培養2-4h。分別在lh、2h、3h、4h的時候取出培養液並立即計數殘存活菌數，與 原活菌數進行比較。
[0026] 3、模擬膽鹽的耐受試驗：用胰液素製成lg/L的溶液，並在溶液中加入0. 3%的豬 膽鹽，用10%的NaOH調整pH為8. 0,然後用0. 45 ii m微濾膜過濾並除菌。將0. 5mL糞腸球 菌HEW-A131發酵液接種到4. 5mL模擬膽鹽中，培養24h後得到培養液，計數殘存糞腸球菌 HEW-A131的活菌數，與原活菌數進行比較。
[0027] 模擬胃液及腸液和模擬膽鹽耐受試驗中的計數方法：
[0028] 樣品用無菌生理鹽水十倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度用於計數。取ImL稀釋液 於滅菌平板上，將滅菌後冷卻至45°C的MRS瓊脂培養基傾注在平板上，迅速搖勻，待平板凝 固後在35°C培養24h。
[0029] 本發明糞腸球菌HEW-A131維持和改善腸道性能的檢驗方法：
[0030] 選取普通昆明小白鼠60隻，雌雄各半，18-20g，常規詞養。從中隨機挑選40隻，每 天早晨9:00灌胃鹽酸林可黴素0. 2mL (20mg) /只，其它作為對照組，每天同一時間灌胃等量 滅菌生理鹽水，連續一周，製備腸道菌群失調的小鼠模型。模型組小鼠飲食下降，未出現死 亡和明顯的腹瀉現象，排軟糞，外形正常含水分較多，墊料潮溼。將40隻腸道菌群失調小 鼠，隨機分為2組，一組20隻作為糞腸球菌HEW-A131治療組，每天灌胃本發明製備的發酵 液0. 5ml (2X IOltlCfVmL)/只，另20隻作為自然恢復組，與對照組相同處理，每天同一時間 灌胃等量滅菌生理鹽水，連續兩周。整個試驗期21天，每天觀察小白鼠的生長和排便情況， 於第8、21天對菌株治療組和自然恢復組的小鼠進行稱重，計算各組體重平均增長率；每5 天測各組小鼠糞便大腸桿菌數量，取小鼠糞便約〇. lg，於無菌操作臺內加入3粒玻璃珠（以 〇. Ig糞樣加〇. 5mL稀釋液），稀釋並接種麥康凱瓊脂培養基，計算每克溼便中的大腸桿菌 數。
[0031] 本發明另一目的是所述糞腸球菌HEW-A131在微生態製劑的製備及畜禽養殖 過程的應用，所述微生態製劑是將發酵力強、益生性顯著並且抗逆性能良好的糞腸球菌 HEW-A131，經過液體深層發酵等生產工藝得到發酵液，然後經離心、乾燥後製得。
[0032] 有益效果：
[0033] 1.本發明的糞腸球菌HEW-A131耐熱性強（生長適宜溫度：4°C _65°C，最適生長溫 度：201：-45°〇;耐酸鹼範圍寬泛（生長適宜？111.5-11，最適？11值為6-8) ;發酵力強、生 長旺盛；經發酵工藝改進和培養基優化，35°C發酵8h，發酵液活菌數可達到I. IXIOiciCFU/ mL，更加適合飼料工業和畜禽養殖業發展的迫切需要，為今後應用過程中降低生產成本、提 高經濟效益奠定了堅實的菌種基礎。
[0034] 2.本發明的糞腸球菌HEW-A131具有顯著的益生性，能顯著抑制大腸桿菌 (Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、沙門氏菌（Salmonella sp.)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae)、志賀氏菌屬（Shigella sp.)、韋榮氏球 菌（Veillonella sp.)、綠胺桿菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)等病原菌的生長繁殖，具有廣譜 抑菌性。
[0035] 3.本發明的糞腸球菌HEW-A131具有較強的抗逆性，能夠耐受模擬胃酸、模擬膽鹽 以及高溫環境，並且能保持較高的活菌存活率，其活菌存活率可達到93-99 %，更加適合飼 料工業和畜牧養殖業的要求。
[0036] 4.本發明中糞腸球菌HEW-A131可有效維持動物腸道菌群平衡，改善腸道性能，提 高動物生產性能。經小鼠腸道性能試驗，HEW-A131治療組小鼠體重平均增長率（44. 78% ) 顯著高於自然恢復組（32. 14%);飼餵HEW-A131益生菌後腸道大腸桿菌數量顯著下降，降 低73. 32%，顯著低於自然恢復組（24. 78% )，表明HEW-A131在小白鼠腸道內迅速定植，形 成優勢菌群，並有效抑制大腸桿菌等病原菌的生長繁殖。
[0037] 5.本發明的糞腸球菌HEW-A131具有優良的微生物學特性、顯著的益生性及抗逆 性和超強的發酵性能，不但可以提高動物的飼料利用效率，節約成本，而且大大改善了動物 體內消化道內環境的穩態，促進營養的吸收利用，促進動物生長，顯著提高了動物的生產性 能、免疫性能和繁殖性能，降低了生產成本，提高了經濟效益。在其用量較少，例如在飼料 中僅為l〇 6CFU/kg時即可發揮顯著作用，具體表現在：1)可顯著提高種雞的生產性能及繁 殖性能：與對照組相比，試驗組料蛋比降低24. 81 %，死淘率降低57. 14%，種蛋合格率提高 2. 02 %，種蛋受精率提高2. 5 %，健雛率提高2. 49 %。2)可顯著提高了肉雞的生產性能及免 疫性能，與對照組相比，料肉比降低35. 77%，死淘率降低56%。3)可顯著提高蛋雞的生產 性能、免疫性和雞蛋品質，有效替代抗生素添加劑，適合大規模推廣使用。其中，料蛋比抗生 素組降低14. 98%，比普通組降低25. 11% ;死淘率比抗生素組降低13. 54%，比普通組降低 34. 65% ;雞蛋質量指標光澤、蛋殼厚度、哈氏單位、蛋黃顏色明顯優於抗生素組和普通組。 4)可顯著提高仔豬的生產性能、免疫性能和豬舍環境質量，能有效替代抗生素添加劑，適合 大規模推廣使用。與抗生素組和普通組相比，其中料重比分別降低13. 73%和25. 84% ;腹 瀉率分別降低43%和66. 14% ;死淘率分別降低99. 19%和99. 59 ;發病率分別降低4. 5% 和21. 75% ;試驗組比普通組豬舍環境指標顯著提高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1是糞腸球菌HEW-A131在腸球菌瓊脂培養基上的菌落形態；
[0039] 圖2是糞腸球菌HEW-A131經革蘭氏染色顯微鏡下的菌株形態；
[0040] 圖3是糞腸球菌HEW-A131發酵液不同處理後的抑菌效果；
[0041] 圖中CK為培養液，1為溶解液，2為上清液，3為酶解液；
[0042] 圖4是糞腸球菌HEW-A131的生長曲線。

【具體實施方式】
[0043] 下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段 均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的 範圍，本發明的實質和範圍僅由權利要求書所限定。對於本領域技術人員而言，在不背離本 發明實質和範圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬於本發明的保護範圍。
[0044] 實施例1糞腸球菌HEW-A131的分離篩選、鑑定及保藏
[0045] 1、乳酸菌的分離純化：
[0046] 在無菌條件下採集健康籠養成年蛋雞盲腸腸道內容物lg，置於盛有4. 5mL滅菌生 理鹽水的離心管中，充分震蕩混勻，然後吸取0. 5mL混合液於盛有4. 5mL滅菌生理鹽水的離 心管中，此稀釋度為1〇_2,重複以上過程做10倍梯度稀釋，至1〇_6稀釋濃度，選擇1〇_ 4?1〇_6 三個稀釋度，吸取〇. ImL塗布於腸球菌培養基（腸球菌固體培養基）平板上，平板塗布後採 用厭氧培養法（5% CO2)，將塗好的平板於35°C培養24h後，用接種環挑取有藍黑色環帶且 形態不同的菌落在MRS固體培養基平板上進行劃線分離培養，經48h培養後，挑取分離效果 較好的菌落，用接種環轉接於MRS斜面培養基上作純培養，重複傳代純培養3次，而後置於 4 °C冰箱保存備用。
[0047] 2、菌落形態的觀察
[0048] 將步驟1保存的斜面菌種，經2-3次活化，取乾淨的載玻片，滴一滴無菌水於載玻 片上，然後挑取1-2接種環的上述活化菌種，塗勻，乾燥後固定。革蘭氏染色：先用草酸銨結 晶紫染液染色l_2min，用水衝洗，接著滴加盧氏碘液覆蓋l-2min，用水衝洗，然後滴加95% 乙醇至乙醇液不再呈現紫色時停止約30s，最後用番紅染液復染2-3min，水洗。鏡檢選取革 蘭氏染色為陽性的球狀菌株作為備用。
[0049] 3、抑菌性乳酸菌的篩選：
[0050] (1)產酸能力測定：將步驟2篩選出的革蘭氏陽性球狀菌株活化2-3代後，按1% (v/v)的接種量各自接至新鮮的MRS液體培養基中，35°C厭氧培養，分別0h、24h兩個時間點 用酸度計測各實驗菌株5mL發酵液的pH值。每個實驗菌株發酵液作3個重複，取平均值。 用0h、24h兩個時間點各實驗菌株發酵液的pH值變化，S卩A pH來衡量乳酸菌的產酸能力。 選取產酸能力高的乳酸菌發酵液進行下一步測定。
[0051] (2)抑菌試驗：取致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯氏 菌、志賀氏菌屬、韋榮氏球菌、綠膿桿菌、嗜水氣單胞菌、多殺性巴氏桿菌）濃度為IO 9CFUAiL 的菌懸液50mL與等體積冷卻至45°C的NA固體培養基（滅菌後）混勻，製備成4mm左右的 病原菌NA平板若干個，每個病原菌NA平板在無菌條件下用無菌鑷子夾取4個滅菌牛津杯 (內徑6_、外徑8_、高IOmm的圓形小管，管的兩端要光滑）對稱放在平皿上，輕輕加壓，使 其與培養基接觸無空隙，待數分鐘後，然後分別吸取200 ii L步驟（1)產酸能力高的乳酸菌 發酵液於3個牛津杯中，另一個牛津杯中加入等量的MRS培養基作為對照，於35°C下恆溫培 養28h。每個乳酸菌發酵液做2個重複，用遊標卡尺測其抑菌圈直徑的大小，取平均值，選 擇抑菌圈大的乳酸菌9株，並分別標號為HEW-A13-1、HEW-A13-2、HEW-A13-3、HEW-A13-4、 HEW-A13-5、HEW-A13-6、HEW-A13-7、HEW-A13-8、HEW-A13-9。用接種環轉接於 MRS 斜面上作 純培養，重複傳代純培養3次，而後置於4°C冰箱保存備用，進行下一步的研究。
[0052] 4、產細菌素乳酸菌的篩選
[0053] 1)目標菌株的確定：將步驟3中篩選獲得的9個乳酸菌於MRS斜面培養基上進行 菌種活化3-4次，取1-2環轉接於裝有300mLMRS液體培養基的搖瓶中35°C培養18h，轉速為 180r/m，對培養液用lmol/L NaOH溶液調節pH值至6. 8,然後分別吸取200 ii L培養液替代 上述步驟（2)中的產酸能力高的乳酸菌發酵液，採用上述步驟（2)的抑菌試驗方法，選擇抑 菌圈最大的乳酸菌HEW-A13-1為本發明篩選的目標乳酸菌，暫時命名為乳酸菌HEW-A131。
[0054] 2)抑菌蛋白的確認：將步驟1)HEW-A13-1培養液中加入硫酸銨至到培養液中不再 有沉澱析出，收集沉澱和上清液，將沉澱透析、去鹽後溶於與上清液等體積的超純水，均勻 混合，得溶解液，取適量溶解液加入〇. lmg/mL的蛋白酶37°C酶解2h。取培養液、上清液、溶 解液、酶解液做抑菌試驗，結果如圖3所示。進一步確定乳酸菌HEW-A131發酵產生的抑菌 物質為抑囷蛋白。
[0055] 所述腸球菌固體培養基組成為：胰蛋白腖1. 7%，牛肉膏0. 3,酵母膏0. 5%，牛膽 粉（鹽）1%，氯化鈉0.5%，檸檬酸三鈉0. 1%，七葉苷（靈）0. 1%，檸檬酸鐵銨0.05%，疊 氮化鈉0. 025%，瓊脂1. 8%，餘量為水，pH7. 1±0. 2。
[0056] 所述MRS固體或斜面培養基組成為：葡萄糖2%，蛋白腖1%，酵母提取物0.5%， 檸檬酸二銨 〇? 2 %，醋酸鈉 0? 5 %，牛肉膏 1 %，吐溫-80 0? 1 %，K2HPO4O. 2 %，MgSO4 ? 7H20 0? 0058%，MnSO4 ? 4H200. 025%，瓊脂粉 I. 5%，餘量為水，pH 7. 0±0. 2。
[0057] 所述MRS液體培養基組成為：葡萄糖2 %，蛋白腖I %，酵母提取物0. 5 %，檸檬酸 二銨 0? 2 %，醋酸鈉 0? 5 %，牛肉膏 1 %，吐溫-80 0? 1 %，K2HPO4O. 2 %，MgSO4 ? 7H200. 0058 %， MnSO4 ? 4H200. 025%，餘量為水，pH 7. 0±0. 2。
[0058] 所述NA固體培養基組成為：蛋白腖1%，牛肉膏0.3%，瓊脂2%，NaCl 0.5%，餘 量為水，pH7. 2±0. 2。
[0059] 5、菌株屬的鑑定
[0060] 對HEW-A131菌株進行生理生化鑑定，過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液 化試驗、吲哚試驗和硫化氫試驗均為陰性,表明HEW-A131菌株為乳酸菌屬。通過馬尿酸鹽 水解試驗、精氨酸水解試驗、4°C和65°C生長試驗，及各類糖發酵試驗，結果與《常見細菌系 統鑑定手冊》和《乳酸細菌的分類鑑定》對照。鑑定結果顯示HEW-A131菌株為糞腸球菌。
[0061] 表1糞腸球菌HEW-A131部分生理生化特性
[0062]

【權利要求】
1. 一株糞腸球菌（Enterococcus faecalis)HEW-A131，其保藏編號為 CGMCC NO. 9353。
2. -種如權利要求1所述的糞腸球菌HEW-A131的培養方法，其特徵在於，取糞腸球菌 HEW-A131種子液l-5mL，接種到300mL培養基中進行搖瓶發酵培養。
3. 如權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述培養基由如下組分組成：蔗 糖 1-5 %，大豆蛋白腖 0· 5-2. 5 %，酵母提取物 0· 1-1. 0 %，MgS04 · 7Η200· 05-0. 2 %， MnS04 · 4Η200· 01-1. 0%，NaClO. 1-2. 0%，檸檬酸二銨 0· 1-0. 5%，CaC030. 1-1. 0%，餘量為 水，ρΗ7· 0±0· 2。
4. 如權利要求2所述的培養方法，其特徵在於，所述搖瓶發酵的條件為：發酵溫度 30-45°C，發酵時間 5-20h，pH 值 6. 5-7. 5,轉速為 100-300r/m。
5. 如權利要求1所述的糞腸球菌HEW-A131在微生態製劑的製備及畜禽養殖過程的應 用。
【文檔編號】C12N1/20GK104293696SQ201410476303
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】李雪平 申請人:李雪平