氨基葡糖和從微生物質中製備氨基葡糖的方法

2023-06-08 10:02:31

專利名稱：氨基葡糖和從微生物質中製備氨基葡糖的方法
技術領域：
本發明涉及氨基葡糖組合物和製造氨基葡糖組合物的方法。
背景技術：
氨基葡糖是已被證明可明顯治療性減輕關節炎和關節痛的營養補 劑(nutraceutical supplement)。儘管機制尚不完全清楚，但相信 氨基葡糖的功能是幫助恢復軟骨以減輕關節的炎症，因此對病人有明 顯的益處。
目前，氨基葡糖基本來源於獲取的天然原料，例如甲殼類動物和 其它水生生物。用不同的生產技術把這些生物的殼和外骨骼組分轉化 成氨基葡糖。對一些應用來說可以用這些天然原料生產氨基葡糖，但 是它們是有些限制的。這些限制包括野生甲殼類由於天然生長在不受 控制的環境中使得它們在組分上有明顯變異。甲殼類動物根據生長條 件及其品種在其大小和組分上有差異。同樣，在沒有控制的生長條件
下，甲殼類動物暴露在環境汙染中，包括重金屬，它將滯留在氨基葡 糖或其它從甲殼類動物生產的產品中。曱殼類動物的收穫經常是季節 性的，因此甲殼類動物的供應和價格會因時間明顯變化。
對來源於甲殼類動物的氨基葡糖的進一步憂慮是很大一部分人群 對甲殼類動物過敏並且不能使用包含來自甲殼類動物成分的產品。經 過高度處理的材料，例如氨基葡糖，如果適當製備就不會產生任何過 敏的危險；但依然憂慮是高度過敏的個體甚至對來源於天然曱殼類動 物的微小痕量過敏原仍會過敏。即使如果不存在這種過敏原，來源於
甲殼類動物的氨基葡糖也會引起某些對甲殼類動物過敏個體的憂慮， 因為這些個體消費者不一定知道是否所有的過敏原均被去除。
跟甲殼類動物來源的氨基葡糖現有來源相關的另一個問題是一些 甲殼類動物的供應是從世界上的大海或大洋中收穫的。過度捕撈甲殼 類動物對環境會有很大的負面影響。因此，相信某些消費者更喜歡使 用那些不是捕撈自海洋生命的氨基葡糖。即使如果捕撈甲殼類動物對 環境的影響不是負面的，仍擔心年年野生甲殼類動物供應數量上的限 制和數量不一致的限制。
因此，就要建立安全的、 一致的和高質量的氨基葡糖來源，它是 經濟的並且對環境的影響是最小的。

發明內容
本發明涉及氨基葡糖，包括適合於人或動物用(consumption) 的含有氨基葡糖的材料。本發明的氨基葡糖來源於包含幾丁質的發酵 的真菌生物質。適合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如 來源於麴黴屬(J^7erg///i^ s/7.)、 青黴屬(屍e/7/c/77/"/7 M.)、毛黴屬(M/cor ".)的真菌源和它們的組合。真菌生物質的 使用產生高質量的產品，其通常產生僅有低水平的雜質的相同的氨基 葡糖。本發明的氨基葡糖通常有相對低的灰分含量，和低的重金屬含 量。除此之外，做為真菌生物質產品，所述的氨基葡糖不會對那些對 甲殼類動物過敏的人產生危險。
本發明也涉及通過發酵的真菌生物質的酸水解來產生氨基葡糖的 方法。從微生物質得到氨基葡糖的方法包括在酸性溶液中反應包含幾 丁質的生物質，特別是在升高溫度下，在酸中反應包含幾丁質的生物 質。
從本發明詳述和權利要求書中可明顯看出本發明別的其它特徵和 優點。上面公開內容的原則概述不是描述本公開內容的每一個說明的 實施方案或每一個實施例。下面的詳述部分利用這裡公開的原則對某 些實施方案進行更具體地舉例說明。


參照下面的附圖更全面地解釋本發明，其中
圖1中的表顯示按照本發明製備氨基葡糖的示例方法的隨時間變 化的氨基葡糖的產量百分比。
圖2是按照本發明製備的氨基葡糖的層析圖譜。
圖3是按照本發明製備的氨基葡糖的層析圖譜。
同時，本發明的原則可以有不同的修改和不同的形式，通過實施 例詳述其細節。然而應該理解本發明不限於描述的特定實施方案。相 反，在公開內容的精神和範圍內，意圖是包括所有的修改、等價物 (equivalents)和改變。
本發明涉及氨基葡糖，包括適合於人或動物用的含有氨基葡糖的 材料。氨基葡糖來源於存在於多種真菌生物質的幾丁質。幾丁質是天 然的多糖，結構是2-乙醯氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(N-乙醯基-D-氨基 葡 糖 ) ( 2-acetoamido-2-deoxy—D—glucose (N-acetyl-D-glucosamine))的無支鏈的多聚體。通過通用的重複結構描繪這一分 子式
幾丁質是典型的無定形固體，幾乎不溶於水，稀酸和鹼。儘管幾 丁質有多種商業應用，但是更大的商業應用是通過把多聚體結構轉化 成單個的2-乙醯氨基-2-脫氧-D-葡萄糖組分，這就是已知的氨基葡 糖。在結構上，氨基葡糖是用氨基取代第二位碳(C-2)上的OH基的 修飾的葡萄糖。通用的結構是HQH2、 ^
發明詳述
formula see original document page 6
如上所述，本發明的氨基葡糖來源於包含幾丁質的發酵的真菌生 物質。適合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如來自於曲
黴屬(y4s/ ejr^.77ws早)、青黴屬(戶e/7i"7hw 印，),毛黴屬 (M/cor s/7.)和它們的組合的真菌源。真菌生物質的使用產生高質 量的產品，其產生僅有低水平的雜質的基本相同的氨基葡糖。本發明 的氨基葡糖通常有相對低的灰分含量，和低的重金屬含量。除此之 外，做為真菌生物質產品，氨基葡糖不會對那些對甲殼類動物過敏的 人產生危險。
現在更詳細地描述氨基葡糖組成、原材料和生產方法。 A. 氨基葡糖
本發明的氨基葡糖來源於相對相同的真菌生物質源，因此一般有 基本相同的組成。根據純化氨基葡糖或所希望的氨基葡糖鹽的方法； 產生的包含氨基葡糖的組合物有不同水平的純度，包括超過95%的純 度、98%的純度和甚至99.8%的純度的組合物。氨基葡糖組合物也包 含另外的成分，例如另外的鹽。在此情形下，希望組分的總純度相對 於不希望的雜質能夠維持在超過95%、 98%甚至99. 8%的純度水平。
本發明的氨基葡糖有如下通式formula see original document page 7
這個通式依氨基葡糖不同鹽的存在而不同，包括檸檬酸鹽、醋酸 鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、乳酸鹽和葡糖酸鹽等。同樣，在不脫 離本發明範圍的情況下氨基葡糖可以被取代或修飾。因此，這裡使用 的術語氨基葡糖是指不同形式的氨基葡糖，包括鹽複合物和取代的氨
這個通式依氨基葡糖不同鹽的存在而不同，包括檸檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、乳酸鹽和葡糖酸鹽等。同樣，在不脫 離本發明範圍的情況下氨基葡糖可以被取代或修飾。因此，這裡使用 的術語氨基葡糖是指不同形式的氨基葡糖，包括鹽複合物和取代的氨
基葡糖。
通常氨基葡糖是高純度的，但可能包含別的成分，包括葡萄糖，
未反應的幾丁質和其它材料。優選地氨基葡糖包含少於10%的葡萄 糖，更優選的少於5%的葡萄糖，甚至更優選的少於2%的葡萄糖。氨 基葡糖可能也包含其它的有機雜質。例如氨基葡糖可能包含有機酸。 但是，如果存在有機酸，通常發現其只有非常有限的數量，例如象上 述的葡萄糖的水平或甚至更小的數量。本發明的氨基葡糖有相對低的 灰分含量。灰分含量通常少於5%,更典型的是少於2%，在一些實施 例中甚至少於1%。在本發明的氨基葡糖中鈣的水平通常也是低的。 通常重金屬含量同樣低，典型的低於百萬分之100份，更典型的低於 百萬分之50份，甚至更典型的低於百萬分之20份。在某些實施方案 中該水平低於百萬分之10份。氨基葡糖有正比旋光，例如氨基葡糖 的鹽酸鹽是正69到74度的比旋光。
本發明的氨基葡糖在純淨乾燥形式下通常是相對白色的。但當溶 解在水溶液中是無色的。在一個實施例中，20%重量比氨基葡糖溶液 的美國公共衛生協會(American public Health Association) (APHA)的顏色少於50。通常氨基葡糖也有很小的氣味，並且通過 氣味就可以區別於來源於甲殼類動物的氨基葡糖。
B. 微生物真菌生物質原材料
適合的原材料包括基本上相同的微生物質源，典型的是真菌生物 質，例如含有全部細胞乾重10%以上的幾丁質的絲狀真菌，例如來源 於麴黴屬(y4spez^!77tfs印.)、青黴屬(屍朋J'C!'L iW3)、 毛
黴屬(#WC02" )的真菌源。適合的真菌生物質包括黑色麴黴
(y4邵ei^i7Jtfs /7i^er) 、 土麴黴(y4砂ejr《i77tfs tejrrews)、 米曲 黴(v4s/ e2^ii7〃s OJT/zae)、 魯克氏毛黴(臉cor 2wu'jf)、 產黃 青黴(屍e/ j.c^h'咖 c力2^o^"e/7咖)、點青黴(屍e/ ic!'77jf咖
/7otat咖)、釀酒酵母(5"acc力aro邁yces cererisiae); 葡萄汁糖酵 母(5"acc力aro顯yces肝ar咖)；尤其是季也蒙氏假絲酵母(Ca/ Wa 卵/77e2"顯o/zfl(/ )、 黑色麴黴 (J印ez^i77tfs /7/^r ) 和土麴黴 (爿s/，er^7^/s terreus)。生物質通常從商業的發酵反應中回收， 例如有機酸的商業產品，包括檸檬酸。同樣，可以專門為這個過程生 產適合生產氨基葡糖的生物質而不是用其它過程的副產品。這裡使用 的術語微生物不包括浮遊植物和甲殼動物或軟體動物。
本發明尤其適合使用幾丁質水平超過生物質乾重5%的生物質。此 類生物質中通常含佔生物質乾重5-25%和可佔生物質乾重10%-20%的 幾丁質。同樣，為了製備高質量的氨基葡糖，有時希望在生物質的生 長過程中，在相對相同的溫度和營養水平的基本上可控制的方式下生 產微生物質。
C. 氨基葡糖的生產方法
技術領域：
本發明也涉及形成氨基葡糖的方法。包括從發酵的真菌生物質的 酸水解形成。酸水解破壞了酸鍵和使幾丁質分子脫去乙跣基產生游離 的氨基葡糖。酸水解足以破壞幾丁質成為氨基葡糖，但是使氨基葡糖 分子基本上完整。水解反應條件有破壞一些存在於真菌生物質中其它
成分(如葡聚糖，蛋白和脂類)的額外優勢。通常通過在強酸溶液中 處理真菌生物質超過4小時而進行此類酸水解。
生產氨基葡糖通常包括以下步驟提供含幾丁質的生物質，在酸 性溶液中反應含幾丁質的生物質形成氨基葡糖和從酸性溶液中分離氨 基葡糖。該反應通常具有真菌生物質原材料中全部幾丁質含量50% 以上的氨基葡糖產量。
強酸可用於水解真菌生物質，包括濃度小於50%的酸，更常用的 是5-25%濃度的酸。適合的強酸包括適當水平的鹽酸、硫酸、磷酸和 擰檬酸。
通常氨基葡糖的形成反應使用5-20%的酸、2-50%預處理的生物質 (依據乾重，儘管通常生物質在有水存在下處理)和35-93%的水。 在某些實施例中反應混合物包含8-12%的鹽酸、4-8%的生物質(依據
乾重)和80-90%的水。
包含生物質、酸和水的混合物，加熱並維持在升高的溫度。混合 物通常加熱到或接近它的沸點並維持在回流條件超過5小時，更典型 的是超過8小時，通常少於16小時。希望使反應持續足夠長以完全 地破壞幾丁質，但不持續長到低效率或過多的分解氨基葡糖。
在酸溶液中反應產生氨基葡糖，但要產生滿意的產品通常需要隨 後的純化步騍。第一個純化步驟通常包括過濾去除顆粒雜質，產生基 本上澄清的濾液。通常此濾液中包含氨基葡糖，也包含少量的葡萄糖 和其它糖。隨後用蒸發步驟來濃縮氨基葡糖和可能去除一些酸，這可 以再循環和再利用。通過蒸發濃縮混合物，通過往濃縮混合物中加入 乙醇或繼續蒸發到其溶解度的極限，氨基葡糖能以純化的固體沉澱出 來。
氨基葡糖可以通過過濾或離心回收，然後乾燥。乾燥的氨基葡糖 可選擇進一步純化以去除任何殘餘的糖。去除這些多餘糖的一種方法 是通過在水中溶解氨基葡糖或加入乙醇，這樣可在更大的純度沉澱氨 基葡糖。另外，溶液可以通過電滲析、層析、膜濾等來純化。氨基葡 糖可選擇用乙醇、碳或其它適合的材料和方法來脫色。
除了上面描述的步驟，可以一開始處理生物質以去除一些雜質或 改進氨基葡糖產量。這些處理包括加熱生物質、加入消化酶、與酸或 鹼混合、機械攪拌或加壓脫水。 一個特別適合的處理是在氫氧化鈉存 在時預處理生物質。在某些實施例中把濃度小於10%的氫氧化鈉加入 真菌生物質中，加熱到升高的溫度持續一段時間，足以去除絕大部分 不含幾丁質的材料。這個階段通常小於2小時。該預處理方法的一個 具體的例子需要在2-8%的氫氧化鈉溶液中，加熱真菌生物質到100 到125"C持續20到60分鐘。這個步驟水解了生物質中的一些蛋白和 葡聚糖，其副產品通過過濾可選擇性地去除。過濾步驟後去除可溶蛋 白質、胺基酸等。在本發明具體的實施例中，洗過的和預處理的生物 質包含超過50%的水，甚至超過70-80%的水。通常預洗過的真菌生物 質中水的水平為大約80%到95%。
D. 實施例
通過下面非限制性說明性實施例進一 步說明本發明。除非另外指 明，各部分中所有的數量都是重量。 實施例1
用4%的氫氧化鈉(NaOH)水溶液120C高壓滅菌1小時預處理檸 檬酸生物質，這一步驟去除過量的蛋白質和其它不希望的材料。然後 用去離子水徹底洗生物質直到pH值為大約7.0。該洗過的材料與濃 鹽酸(HC1)和水混合形成含10-15%鹽酸和5-6%生物質的混合物(按 照生物質的乾重)。該混合物加熱回流。時常取出樣品，用Dionex HPLC高壓液相色譜(商標名稱DX-500)分析反應。
結果顯示在圖1中，其為氨基葡糖產量指示圖，並且顯示在8小 時反應內，氨基葡糖產生不斷增加，但是葡萄糖的量在4小時後減 少。8小時後氨基葡糖的產率是14%。該產品的層析圖譜如圖2所 示。
反應後，過濾混合物，用RotaVap製造的旋轉蒸發器使濾液蒸發 以增加溶液中氨基葡糖的濃度。終體積減少到大約10到20毫升。在 此溶液中加入20亳升乙醇並使溶液渦漩以加速氨基葡糖的沉澱並增 加產量。通過過濾得到氨基葡糖沉澱並進一步用酒精洗滌直到顏色變 白。圖3顯示了該產品的層析圖譜，顯示超過9796的氨基葡糖。
實施例2
重複實施例1，但是要使預處理生物質維持在回流條件下13小 時。產生的氨基葡糖的純度超過98%。
前述的詳述和實施例僅是為了清楚理解。不應將說明書和實施例 理解為對本發明的限制。本發明不限於顯示的和描述的確切細節，因 為權利要求書所限定的本發明裡包括各種變化。
權利要求
1.適合人或動物用的包含氨基葡糖的材料，氨基葡糖來源於發酵的微生物質。
2. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖的 灰分含量小於2%。
3. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中氨基葡糖的重金屬 含量小於每百萬20份。
4. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中通過發酵的微生物 質的酸水解形成氨基葡糖。
5. 權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用酸處理微生 物質超過4小時的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
6. 權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用酸處理生物 質超過8小時的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
7. 權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用5-25%的強 酸溶液處理生物質的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
8. 權利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通過用5-25%的強 酸溶液處理生物質超過4小時的微生物質的酸水解形成氨基葡糖。
9. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中當氨基葡糖為鹽酸 鹽形式時，氨基葡糖有正69-74度的比旋光。
10. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的微生物質的 產率為生物質原材料的全部幾丁質含量的50%以上。
11. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的包含氨基葡 糖的材料包含少於5%的葡萄糖。
12. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中包含氨基葡糖的材 料根據乾重大於98%的純度。
13. 權利要求12的包含氨基葡糖的材料，其中所述的包含氨基 葡糖的材料僅包含氨基葡糖，或者氨基葡糖中混合有其他成分。
14. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖 20%重量比的水溶液具有小於50的美國公共健康協會的顏色。
15. 權利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖來 源於基本相同的微生物真菌源。
16. 權利要求15的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖 來源於麴黴屬、青黴屬、毛黴屬和它們的組合。
17. 權利要求15的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖 來源於絲狀真菌的品種，其具有全部細胞重量的10%以上的幾丁質。
18. 從微生物質得到氨基葡糖的方法，本方法包括以下步驟(a) 提供含幾丁質的生物質；(b) 在酸濃度大於5%的酸溶液中，反應溫度高於80t:，使含 幾丁質的生物質反應，反應時間至少4小時，將生物質中的幾丁質轉 化成氨基葡糖；並且(c) 從酸性溶液中分離氨基葡糖。
19. 權利要求18的方法，其中分離氨基葡糖的步驟包含從酸性 溶液中結晶氨基葡糖。
20. 權利要求18的方法，其中酸溶液的酸濃度是5-25%。
21. 權利要求18的方法，其中酸溶液的酸濃度是5-50%。
22. 權利要求18的方法，其中反應溫度高於80X:。
23. 權利要求18的方法，其中反應時間為4-25小時。
24. 權利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料具有 含幾丁質的生物質的全部幾丁質含量的50%以上的產率並且含有小 於5%的葡萄糖。
25. 權利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料含有 小於5%的可溶性糖。
26. 權利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料根據 乾重為大於98%的氨基葡糖。
27. 權利要求18的方法，其中所述的氨基葡糖來源於麴黴屬、 青黴屬、毛黴屬和它們的組合。
全文摘要
本發明公開了適合人和動物用的氨基葡糖。所述的氨基葡糖來源於含有幾丁質的微生物質。適合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如來源於麴黴屬(Aspergillus sp.)、青黴屬(Penicilliun sp.)、毛黴屬(Mucor sp.)或它們的組合的真菌源。本發明也公開了通過酸水解發酵的真菌生物質生產氨基葡糖的方法。
文檔編號A61P19/02GK101186626SQ20071016980
公開日2008年5月28日 申請日期2002年2月15日 優先權日2001年2月16日
發明者J·A·鮑爾曼, J·D·斯坦科, J·P·海寧, J·R·特林科勒, 範煒宇, 黃基五 申請人:卡吉爾公司