具有改善的藥代動力學性質的坎普他汀類似物的製作方法

2023-06-26 19:18:16 3

具有改善的藥代動力學性質的坎普他汀類似物的製作方法
【專利摘要】公開了包含能夠結合C3蛋白並且抑制補體活化的肽的化合物。所述化合物包括其中N末端包含添加的或取代的組分的坎普他汀類似物，相較於等同條件下的未修飾坎普他汀肽，所述組分改善了(1)所述肽對於C3或其片段的結合親和力，(2)所述肽在水性液體中的溶解度，(3)所述肽的血漿穩定性，(4)所述肽的體內停留和/或(5)所述肽的生物利用度。還公開了使用所述化合物的藥物組合物和方法。
【專利說明】具有改善的藥代動力學性質的坎普他汀類似物
[0001]政府資助
[0002]依據35U.S.C.§ 202 (C)，承認美國政府可具有本文中描述的發明的某些權利，所述發明是部分利用來自美國國立衛生研究院的基金號GM62134、AI30040、A1068730、GM097747和EY020633下的資金進行的。
發明領域
[0003]本發明涉及機體內補體級聯的活化。具體地，本發明提供了以納摩爾濃度親和力結合C3蛋白和抑制補體活化，顯示強勁水溶解性、血漿穩定性和體內停留，並且通過多種施用途徑可具有生物利用度的肽和肽模擬物(peptidomimetics)。
[0004]發明背景
[0005]在整個說明書中引用了各種出版物，包括專利、公開申請、技術論文和學術論文。這些引用的出版物中每一篇通過引用整體併入本文。
[0006]人補體系統是對抗致病性生物體的防禦和免疫反應介導中的有力的參與者。補體可通過3個不同途徑活化:經典途徑、凝集素途徑和旁路途徑。3個不同途徑共有的主要活化事件是補體系統的中心蛋白C3被C3轉化酶蛋白水解切割成其活化產物C3a和C3b。這些片段的產生導致C3b和iC3b對致病細胞的調整作用(使它們易受吞噬作用或清除的過程)，以及導致通過與補體受體的相互作用發生的免疫細胞活化(Markiewski&Lambris, 2007, Am J Pathol 171:715-727) ? C3b 在祀細胞上的沉積還誘導新的轉化酶複合物的形成，從而起始自我擴增迴路。
[0007]血漿和細胞表面結合蛋白一起仔細地調節補體激活，防止宿主細胞被補體級聯自我攻擊。然而，補體的過度活化或不適當的調控可導致許多致病狀況，包括自身免疫病到炎性疾病(Holers, 2003, Clin Immunol 107:140-51 ；Markiewski&Lambris, 2007,同上；Ricklin&Lambris, 2007，Nat Biotechnol25:1265-75 ;Sahu 等人，2000，JImmunol 165:2491-9)。因此非常希望開發治療性補體抑制劑。在本說明書中，C3和C3b已顯示為有前景的靶，因為它們在級聯中的中心作用允許同時抑制補體的起始、放大和下遊活化(Ricklin&Lambris, 2007,同上)。
[0008]坎普他汀(compstatin)是首個顯示能夠阻斷所有3個活化途徑的非宿主來源的補體抑制劑(Sahu 等人，1996，J Immunol 157:884-91 ;U.S.Patent6, 319，897)。該環狀十三肽結合C3和C3b 二者，並且阻止C3轉化酶對天然C3的切割。其高抑制效力已通過一系列使用實驗模型的研究得以確認，所述研究指出其作為治療劑的潛能(Fiane等人，I999a, Xenotransplantation6:52-65 ；Fiane 等人，1999b,Transplant Proc31:934-935 ；Nilsson 等人，1998Blood92:1661-1667 ;Ricklin&Lambris, 2008，Adv Exp MedBiol632:273-292 ;Schmidt 等人，2003，J Biomed Mater Res A66:491-499 ;Soulika 等人，2000, Clin Immunol96:212-221)。坎普他汀的逐漸優化已產生了具有改善活性的類似物(Ricklin&Lambris, 2008,同上；TO2004/026328 ；W02007/062249)。這些類似物之一目前正在臨床試驗中測試用於治療年齡相關黃斑變性(AMD)(工業化國家中老年患者失明的首要原因)(Coleman 等人，2008，Lancet372:1835-1845 ；Ricklin&Lambris, 2008，同上)。鑑於其在AMD和其它疾病中的治療潛能，對坎普他汀進行進一步優化以獲得甚至更大的效力是相當重要的。
[0009]早期的結構-活性研究已將坎普他汀肽的環狀性質以及β -轉角和疏水簇的存在鑑定為該分子的主要特徵(Morikis 等人，1998，Protein Sci7:619-627 ；W099/13899 ；Morikis 等人，2002，J Biol Chem277:14942-14953 ；Ricklin&Lambris, 2008,同上)。發現位置4和7上的疏水殘基特別重要，利用非天然胺基酸修飾它們產生了活性比原始坎普他汀肽改善24倍的類似物(Katragadda等人，2006, J Med Chem49:4616-4622 ；W02007/062249)。
[0010]雖然先前的優化步驟是基於組合篩選研究、溶液結構和計算機模型(Chiu等人，2008，Chem Biol Drug Des72:249-256 ；Mulakala 等人，2007，Bioorg MedCheml5:1638-1644 ；Ricklin&Lambris, 2008，同上)，但與補體片段C3c複合的坎普他汀共晶體結構的公布(Janssen 等人，2007，J Biol Chem282:29241-29247 ；W02008/153963)代表了起動合理優化的重要裡程碑。晶體結構顯示了 C3c的巨球蛋白(MG)結構域4和5的界面上的淺結合部位，並且顯示13個胺基酸中的9個通過氫鍵或疏水作用直接參與結合。與溶液中的坎普他汀肽的結構(Morikis等人，1998，同上)相比較，坎普他汀的結合形式經歷構象改變，β-轉角的位置從殘基5-8移至殘基8-11 (Janssen等人，2007，同上；W02008/153963)。
[0011]本發明人最近開發了一系列基於肽主鏈(特別地肽的位置8)上的甲基化和側翼位置13上的取代的具有改善效力的一系列坎普他汀類似物(Qu等人，2011，Molec Immuno148:481-489, W02010/127336)。這些修飾據報導產生了結合親和力優於大多數迄今報導的活性類似物的坎普他 汀類似物。
[0012]坎普他汀及其類似物具有顯著的臨床應用潛能。最近的實例包括在血液透析過程中減少濾器誘導的不利作用和敗血症中器官的保存。重要地，坎普他汀類似物的玻璃體內使用在非人靈長類動物(NHP)研究中和I期臨床試驗中都顯示了在年齡相關黃斑變性(AMD)治療中的有前景的結果。坎普他汀及其類似物的低分子量、它們的高特異性和效力以及它們同時抑制所有補體活化和擴增途徑的能力促成了一種有益的藥物模式。然而，擴展的臨床應用(例如，通過多種途徑的全身性施用)對坎普他汀衍生物的分子性質提出了額外需要。例如，因從血漿中快速消除而導致的不利藥代動力學特徵仍然對肽類藥物導致了主要限制。此外，雖然口服遞送是最方便的和最受歡迎的藥物施用途徑，但大多數肽藥物幾乎不顯示或不顯示口服活性。這據信主要是因為在胃腸道中被酶和極端條件降解以及腸黏膜的較差通透性。因此，大多數基於蛋白質的治療劑通過頻繁注射(經由胃腸外途徑，例如通過靜脈內、肌內和皮下注射)來施用。這些施用形式非常昂貴，並且可能需要醫學專業人員，所有這些可導致較差的患者接受度和順從性。鑑於上述內容，很明顯具有更大活性、體內穩定性、血漿停留時間和生物利用度的經修飾坎普他汀肽或模擬物的開發將構成本領域的重大進步。
[0013]發明概述
[0014]本發明提供了補體抑制肽坎普他汀的類似物，其相較於坎普他汀具有改善的補體抑制活性，並且還具有改善的溶解度和穩定性以及藥代動力學性質，包括通過多種施用途徑的生物利用度。
[0015]本發明的一個方面是包含經修飾坎普他汀肽(ICVVQDWGHHRCT (環C2-C12 ；SEQ IDNO:1)或其類似物的化合物，其中所述修飾包括添加的或取代的N末端組成，該組分相較於等同條件下未修飾的坎普他汀肽，改善了(I)肽的C3、C3b或C3c結合親和力，(2)肽在含水液體中的溶解度，和/或(3)肽的血漿穩定性和/或血漿停留時間。
[0016] 可被添加至肽的N末端的組分包括除L-Gly外的胺基酸殘基或這樣的胺基酸的肽或非肽類似物。在某些實施方案中，添加的組分是D-胺基酸，和/或所述組分可包括至少一個芳族環。在一個實施方案中，添加的組分是D-Tyr。在其它實施方案中，添加的組分包括N-甲基化胺基酸。在一個實施方案中，所述N-甲基化胺基酸是N-甲基化L-Gly，在本文中也稱為Sar。因此，在不同實施方案中，所添加的組分為D-Tyr、D-Phe, Tyr(Me)、D-Trp,Tyr> D-Cha> Cha> Phe> Sar> Arg、mPhe、mVal、Trp、mile、D_Ala、mAla、Thr 或 Tyr0
[0017]在其它實施方案中，被修飾的坎普他汀肽包含取代的N末端組分，其中位置I處的Ile 被 Ac-Trp 或二肽 Tyr-Gly 替代。
[0018]所述化合物還可包括其它修飾。例如，位置9 (基於坎普他汀的編號)上的His可被Ala替代。此外，位置4上的Val可被Trp或Trp的類似物替代。位置4上的Trp的特定類似物包括1-甲基Trp或1-甲醯基Trp。位置7上的Trp還可被Trp的類似物(包括但不限於滷代Trp)替代。其它修飾包括位置8上的Gly的修飾，以約束該處置處的主鏈構象。具體地，可通過用Na -甲基Gly (Sar)替代位置8上的Gly (Gly8)來約束主鏈。其它修飾包括用Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile來替代位置13上的Thr。還有其它一些修飾包括利用硫醚鍵替代C2與C12之間的二硫鍵來形成胱硫醚或羊毛硫氨酸(lantithionine)。另一個修飾包括利用Orn替代位置11上的Arg,和/或利用Asn替代位置6上的Asp。
[0019]在具體的實施方案中，坎普他汀類似物包括具有SEQ ID N0:29的序列的肽，其為:
[0020]Xaal-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8,其中Xaa5與Xaa6之間的Gly (坎普他汀的位置8)任選地被修飾來約束主鏈構象，並且其中:Xaal 不存在或為 Tyr、D_Tyr 或 Sar ；Xaa2 為 Ile、Gly 或 Ac-Trp ；Xaa3 為 Trp 或 Trp 類似物，其中所述Trp的類似物相較於Trp具有增強的疏水特徵；Xaa4為Asp或Asn ；Xaa5為Trp或包含對其吲哚環的化學修飾的Trp類似物，其中所述化學修飾增強吲哚環的氫鍵勢能；Xaa6 為 His、Ala、Phe 或 Trp ；Xaa7 為 Arg 或 Orn ；以及 Xaa8 為 Thr> lie、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基He，其中Thr、Ile、Leu、Nle、N_甲基Thr或N-甲基Ile中任一個的羧基末端-OH任選地被-NH2替代，並且其中所述肽通過Cys-Cys或硫醚鍵呈環狀。
[0021]所述類似物的一些具體實施方案包括下列特徵:位置8上的Gly是N-甲基化的；Xaal 為 D-Tyr 或 Sar ；Xaa2 為 lie ；Xaa3 為 Trp, 1-甲基-Trp 或 1-甲醯基-Trp ；Xaa5 為Trp ；Xaa6 為 Ala ；以及 Xaa8 為 Thr > 11 e > Leu > NI e > N-甲基 Thr 或 N-甲基 lie,竣基末端-OH任選地被-NH2替代。更具體地，Xaa8可以為lie、N-甲基Thr或N-甲基He，任選地羧基末端-OH被-NH2替代。示例性類似物包括SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 18。本發明的另一個方面涉及抑制補體活化的化合物，其包括SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 18的非肽或部分肽模擬物，其中所述化合物結合C3並且以比等同測定條件下包含SEQ ID NO:1的肽的活性高至少500倍的活性抑制補體活化。[0022]本發明的另一個方面涉及上述化合物，其包括延長所述化合物的體內停留(即，停留時間)的額外組分。在一個實施方案中，所述額外組分是聚乙二醇(PEG)。在其它實施方案中，所述額外組分是白蛋白結合小分子或白蛋白結合肽。在一些特定實施方案中，將白蛋白結合小分子或白蛋白結合肽在N或C末端連接於所述肽。該連接可以是直接的或通過接頭或間隔子。
[0023]本發明的另一個方面涉及包含上述化合物中任一種和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一個實施方案中，藥物組合物被配製來用於口服施用。在另一個實施方案中，其被配製來用於局部施用。在另一個實施方案中，其被配製來用於經肺施用。在另一個實施方案中，藥物組合物被配製來用於皮下或肌內注射。在另一個實施方案中，其被配製來用於靜脈內注射或輸注。
[0024]本發明的另一個方面提供了上述化合物的任一種用於體內、離體、原位或體外抑制補體活化以及用於製備用於抑制補體活化的藥劑的用途。
[0025]通過參考下列詳細描述、附圖和實施例將理解本發明的各種特徵和有利方面。 [0026]附圖概述
[0027]圖1.坎普他汀類似物與C3b的相互作用。(A)坎普他汀前導化合物4 (IMeW)(最低，最窄組的峰)、Cp20(SEQ ID NO:3)(中間組的峰)和肽14(Cp40 (SEQ ID N0:18))(最高最寬組的峰)的動力學特徵譜，如通過單循環動力學分析，使用表面等離子共振術測定的。(B)具有等親和力線(isoaffinity line)的肽1_20以及參照化合物4 (IMeW)和Cp20 (SEQID NO: 3)的速率圖(Rate plot)，如虛線顯示的。顯示了 Cp20 (SEQ ID NO: 3)的速度常數和親和力的基準線。
[0028]圖2.從坎普他汀類似物與C3c之間的計算化停靠實驗(computational dockingexperiment)計算的自由能值(AG) (y軸)與從C3b的相同類似物的實驗測定親和力值計算的自由能值(X軸)之間的關聯性。肽編號示於圖上每一個標記的旁邊。整個數據組上的關聯性示為實線，而點線代表了排除肽1、5和7後的關聯性。
[0029]圖3.坎普他汀類似物在C3c的結合部位內的停靠。㈧肽14 (Cp40 (SEQ IDN0:18)，彩色圖中的藍綠色)和肽4(彩色圖中灰色)的停靠構象(注意，在非彩色圖中，dY側鏈的芳環(CP40(SEQ ID NO: 18))疊加在Y(肽4)的環之前，並且可以以該方式區分)。其它D-胺基酸在停靠模型中具有與肽14相似的構象。為清楚起見，略去肽4中的其它殘基的側鏈。(B)肽19的停靠構象。
[0030]圖4.人血漿中肽 3(Cp30(SEQ ID NO: 7))和肽 14 (Cp40 (SEQ ID NO: 18))在 37。。的穩定性。將Cp30(SEQ ID N0:7)、Cp40(SEQ ID NO: 18)和陽性對照肽2B摻入人血漿以達到20 μ M的終濃度。將血漿在37°C溫育，在不同的時間點取出100 μ L的樣品。使用固相提取法從血漿提取肽，使用UPLC-MS進行分析。3Α:將每一個樣品在不同時間點的面積隨時間作圖(方塊:Cp40(SEQ ID NO: 18)，圓圈:Cp30(SEQ ID NO:7)，三角形:對照肽 2B)。3B:來自時間0(上部)、24h(中間)和120h(下部)的樣品的色譜圖。
[0031]圖5.坎普他汀類似物在非人靈長類動物中的藥代動力學評估。(A)在於食蟹猴中1.V.單次快速靜脈內注射2mg/kg後肽水平隨時間的線性圖，顯示了具有快速初始消除相、隨後緩慢的對數線性末期相的雙相性模型。Cp20(SEQ ID NO: 3)_底下的兩條線；Cp30(SEQID NO: 7)(肽3)-中間兩條線；Cp40 (SEQ ID NO: 18)(肽14)-上方兩條線。(B)從末期相(l-24h)計算血漿消除半衰期(t1/2)。Cp20 (SEQ ID NO: 3)-下方的兩條線；Cp30 (SEQ IDNO: 7)(肽3)-中間兩條線；Cp40 (SEQ ID NO: 18)(肽14)-上方兩條線。虛線標記圖框A和B中靶蛋白C3的測量血漿水平的範圍。(C)類似物Cp20(SEQ ID NO:3)與來自人、狒狒、食蟹猴和獼猴的固定化C3的動力學結合特徵譜的疊加，如通過SPR評估的。
[0032]圖6.在食蟹猴中通過兩個不同途徑單次施用類似物後坎普他汀類似物Cp40 (SEQID NO: 18)的血漿濃度。在皮下注射(頂部的小圖)或口服施用(底部的小圖)後的各時間點上通過質譜法測量血漿濃度。
[0033]圖7.在狒狒中通過肌內注射單次施用類似物後，坎普他汀類似物Cp40 (SEQ IDNO: 18)的血漿濃度和補體抑制活性。在肌內注射(圓圈)後的各時間點上通過質譜法測量血漿濃度。通過紅細胞溶血測定(三角形)測量對經變通途徑的補體活化的抑制。
[0034]舉例說明性實施方案的詳述
[0035]定義:
[0036]在整個說明書和權利要求中使用與本發明的方法和其它方面相關的各種術語。除非另有所指，否則這樣的術語將具有它們在本領域中的普通含義。其它明確定義的術語將以與本文中提供的定義一致的方式進行解釋。
[0037]在本文中可使用下列縮寫:Ac，乙醯基；DCM，二氯甲烷；DIC，1，3-二異內基碳化二亞胺；DIPEA，N, N-二異丙基乙胺；DPBS，Dulbecco』 s磷酸緩衝鹽溶液；ELISA，酶聯免疫吸附測定；ESI，電噴射離子化；FmoC，9-芴甲氧羰基；H0At，l-羥基-7-氮雜苯並三唑；ITC，等溫滴定量熱法；MALDI，基質輔助雷射解吸電離；MBHA，4-甲基二苯甲胺(4-methylbenzhydrylamine) ；NMP,N-甲基吡咯燒酮；Sar,N_甲基甘氨酸；SPR,表面等離子共振術；TIPS，三異丙基矽烷；Trt，三苯甲基；WFI，注射用水。
[0038]如本文中所用，術語「約」當指可測量值例如量、時間長度等時，意指包括與指定值有±20%或±10%的變化，在某些實施方案有±5%的變化，在一些實施方案中有±1%的變化，在一些實施方案中有±0.1%的變化，因為這樣的變化適合於產生和使用公開的化合物和組合物。
[0039]如本文中所用，術語「坎普他汀」是指包含SEQ ID NO:1的肽ICVVQDWGHHRCT(通過二硫鍵形成的環狀C2-C12)。術語「坎普他汀類似物」是指包含天然和/或非天然胺基酸或胺基酸類似物的取代以及在不同胺基酸內或之間的修飾(如本文中更詳細描述的和如本領域中已知的)的經修飾坎普他汀。當提及特定胺基酸或類似物在坎普他汀或坎普他汀類似物內的位置時，這些位置有時被稱為肽內的「位置」，其中位置編號為從I (坎普他汀中的lie)至13 (坎普他汀中的Thr)。例如，Gly殘基佔據「位置8」。
[0040]術語「藥物活性」和「生物活性」是指本發明的化合物結合C3或其片段並且抑制補體活化的能力。該生物活性可通過一個或多個本領域承認的測定(如在本文中更詳細描述的)來測量。
[0041] 如本文中所用，「烷基」是指具有約I至10個碳原子(和其中碳原子的範圍和具體數目的所有組合和亞組合)的任選地被取代的直鏈、支鏈或環狀烴，約I至約7個碳原子是優選的。烷基包括但不限於甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、異丁基、叔丁基、正-戊基、環戊基、異戊基、新戊基、正-己基、異己基、環己基、環辛基、金剛烷基、3-甲基戊基、2，2- 二甲基丁基和2，3- 二甲基丁基。術語「低級烷基」是指具有約I至約5個碳原子(和其中碳原子的範圍和具體數目的所有組合和亞組合)的任選地被取代的飽和直鏈、支鏈或環狀烴。低級烷基包括但不限於甲基、乙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、異丁基、叔丁基、正-戊基、環戊基、異戊基和新戊基。
[0042]如本文中所用，「滷素」是指F、Cl、Br或I。
[0043]如本文中所用，「烷醯基」可與「醯基」互換使用，是指具有約I至約10個碳原子(和其中碳原子的範圍和具體數目的所有組合和亞組合)的任選地被取代的直鏈或分枝脂肪族非環狀殘基，約I至約7個碳原子是優選的。烷醯基包括但不限於甲醯基、乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、2-甲基-丁醯基、2，2-二甲基丙醯基、己醯基、庚醯基、辛醯基等。術語「低級烷醯基」是指具有約I至約5個碳原子(和其中碳原子的範圍和具體數目的所有組合和亞組合)的任選地被取代的直鏈或分枝脂肪族非環狀殘基。低級烷醯基包括但不限於甲醯基、乙醯基、正-丙醯基、異-丙醯基、丁醯基、異-丁醯基、戊醯基、異-戊醯基等。
[0044]如本文中所用，「芳基」是指具有約5至約14個碳原子(和其中碳原子的範圍和具體數目的所有組合和亞組合)的任選地被取代的單環或雙環芳香環系統，約6至約10個碳是優選的。非限定性實例包括例如苯基和萘基。
[0045]如本文中所用，「芳烷基」是指具有芳基取代基並且具有約6至約20個碳原子(和其中碳原子的範圍和具體數目的所有組合和亞組合)的如上定義的烷基，約6至約12個碳原子是優選的。芳烷基可任選地被取代。非限定性實例包括例如苄基、萘基甲基、二苯甲基、
三苯甲基、苯乙基和二苯乙基。
[0046]如本文中所 用，術語「烷氧基」和「烷氧基」是指任選地被取代的烷基-O-基團，其中烷基是如先如定義的。不例性烷氧基和烷氧基團包括甲氧基、乙氧基、正-丙氨基、異-丙氧基、正-丁氧基和庚氧基等。
[0047]如本文中所用，「羧基」是指-C (=0) OH基團。
[0048]如本文中所用，「烷氧羰基」是指-C (=0) O-烷基，其中烷基是如先前定義的。
[0049]如本文中所用，「芳醯基」是指_C(=0)_芳基，其中芳基是如先前定義的。示例性芳醯基包括苯甲醯基和萘甲醯基。
[0050]通常地，取代的化學部分包括在分子上的選定位置上替代氫的一個或多個取代基。不例性取代基包括例如滷素、烷基、環烷基、芳烷基、芳基、疏基、羥基(_0H)、烷氧基、氰基(-CN)、羧基(-C00H)、醯基(烷醯基:-C(=0)R) ;_C (=0)0-烷基、氨基羰基(-C (=0)NH2)、-N取代的氨基羰基(_C(=0)NHR」 )、CF3> CF2CF3等。與上述取代基相關，每一個部分「 R」可以獨立地是例如H、烷基、環烷基、芳基或芳烷基中任一個。
[0051]如本文中所用，「L-胺基酸」是指通常存在於蛋白質中的天然左旋α-胺基酸或這些α-胺基酸的烷基酯中任一種。術語D-胺基酸」是指右旋α-胺基酸。除非另外明確指出，否則本文中提及的所有胺基酸是L-胺基酸。
[0052]「疏水的」或「非極性的」在本文中可同義地使用，是指特徵不在於偶極子的任何分子間或分子內相互作用。
[0053]「PEG化作用」是指其中至少一個聚乙二醇(PEG)部分(無論大小)被化學連接於蛋白質或肽以形成PEG-肽綴合物的反應。「PEG化的」意指至少一個PEG部分(無論大小)被化學連接於肽或蛋白質。術語PEG通常伴隨著數字後綴指示PEG聚合物的近似平均分子量；例如，PEG-8, OOO是指具有約8，000道爾頓(或g/mol)的平均分子量的聚乙二醇。
[0054]如本文中所用，「藥學上可接受的鹽」是指所公開的化合物的衍生物，其中通過生成其酸或鹼鹽而修飾了親代化合物。藥學上可接受的鹽的實例包括但不限於鹼性殘基例如胺的無機酸或有機酸鹽；酸性殘基例如羧酸的鹼性或有機鹽；等。因此，術語「酸加成鹽」是指已通過酸的加成製備的親代化合物的對應鹽衍生物。藥學上可接受的鹽包括例如從無機或有機酸形成的親代化合物的常規鹽或季銨鹽。例如，這樣的常規鹽包括但不限於，衍生自無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的鹽；以及從有機酸例如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、巴莫酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、穀氨酸、苯甲酸、水楊酸、對氨基苯磺酸、2-乙醯氧基苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸等製備的鹽。本發明的某些酸性或鹼性化合物可以以兩性離子的形式存在。化合物的所有形式(包括游離酸、游離鹼和兩性離子)包括在本發明的範圍內。
[0055]描述:
[0056]本發明部分源自本發明人對於抑制效力和藥代動力學參數均有改善的坎普他汀類似物的開發。利用非蛋白源性胺基酸和/或其它分子實體對坎普他汀N-末端的選擇性修飾導致某些具有亞納摩爾濃度水平結合親和力(KD=0.5nM)的類似物和在臨床相關溶劑中具有改善的溶解度的其它相似地強效的衍生物。非人靈長類動物中的藥代動力學評價顯示超過對於肽類藥物的預期的血漿半衰期值。兩個非人靈長類動物模型中的生物利用度評價顯示某些類似物具有皮下、肌內和口服生物利用度。
[0057]按照本發明的一種修飾包括將組分添加於坎普他汀(IIe-[Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-His-His-Arg-Cys]-Thr ;SEQ ID NO:1)的 N 末端，其改善肽的溶解度和血眾穩定性，同時維持或改善C3結合親和力和補體抑制活性。在具體實施方案中，添加的組分是胺基酸殘基，特別地是抗蛋白水解切割的殘基，例如N-甲基化胺基酸(例如，N-甲基Gly(Sar)或D-胺基酸((例如，D-Tyr)。同樣地，如下文中更詳細描述的，N末端殘基的D構型可更好地配置游離氨基而與C3極性相互作用。此外，在N末端包含疏水側鏈(例如，包括芳環)的胺基酸或類似物有利於與C3結合(可能是通過與坎普他汀-C3結合部位上的疏水性口袋相互作用)。
[0058]參考下面所示示例性類似物，所述類似物顯示優於坎普他汀和甚至高效類似物Ae-lie-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys]-Thr-NH2 (SEQ ID NO: 2)的顯著改善的活性(Katragadda等人，2006,同上，W02007/062249 ;在本文中有時稱為「4(IMeW) 」)，以及下文中詳細描述的幾個其它有利特徵。
[0059]「坎普他汀 3O」(Cp3O):
[0060]Sar-1Ie-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mlIe-NH2
[0061](SEQ ID N0:7 ;在實施例中也稱為「肽3」)
[0062]「坎普他汀 40」 (Cp40):
[0063]dTyr-1Ie-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-Sar-Ala-His-Arg-Cys]-mlIe-NH2 [0064](SEQ ID NO: 18 ;在實施例中也稱為「肽14」)
[0065]不期望受理論束縛或限制，據信本文中描述的類似物的改善的C3結合親和力至少部分歸因於由N末端介導的更高親和相互作用。例如，SPR和ELISA數據顯示，D-胺基酸或具有疏水側鏈的胺基酸改善了 C3結合，同時特徵的組合(即具有芳香族側鏈的D-胺基酸，例如D-Tyr)是最有利的。總的來說，具有芳香族側鏈的D-胺基酸顯示優於具有更短側鏈的D或L構型的胺基酸。此外，停靠研究表明改善的親和力源自涉及游離氨基的定位的另外的極性和非極性相互作用，以及N末端殘基上的側鏈的性質和定位。例如，Cp40 (SEQ IDNO: 18)的親和力增加經測定至少部分歸因於在該類似物的N末端處與C3的相互作用的組合；(I) N末端Tyr的D構型更好地提供游離氨基來與C3發生極性相互作用，一種在總體上解釋了 D構型的有利方面的特性；和(2)龐大的疏水側鏈能夠擬合C3c上的疏水性口袋並且還提供羥基來與C3c發生氫鍵合。此外，停靠研究預測在N末端包含Ac-Trp (實施例2)的類似物以高親和力結合C3。肽I的SPR分析確實顯示可與Cp40 (SEQ ID N0:18)(肽14)的結合親和力相當的高結合親和力。已測定兩種肽利用C3、C3b或C3c上靠近坎普他汀的N末端的疏水性結合口袋。
[0066]N-甲基化可以以幾種方式影響肽。首先，潛在的氫鍵供體被甲基替代，所述甲基不能形成氫鍵。第二，N-甲基是弱電子供體，這意味著其可略微增加相鄰羰基的鹼性。第三，取決於相鄰殘基的性質，N-甲基的大小可引起空間約束。最後，N-甲基化可改變醯胺鍵的反式/順式群體，從而以與 脯氨酸類似的方式改變局部肽構象。在Cp30(SEQ ID NO:7)的情況下，SPR數據表明相較於Cp20 (SEQ ID NO: 3)略微更快的締合速率和略微更慢的解離速率，這表明Cp30(SEQ ID NO:7)具有更有利的用於結合C3/C3b/C3c的游離溶液構象並且結合更強。鑑於N末端位置處Ac基團的缺乏和甲基的存在，可以合理地概括修飾允許N末端參與更強的與C3c的殘基S388/S437/D349的極性相互作用。通過將游離N末端定位至有利位置(通過以增強與C3/C3c上的結合部位的極性相互作用的方式進行的N-甲基化)使得這成為可能。
[0067]除了改善的C3結合親和力以外，本發明的類似物還具有相較於先前可獲得的類似物例如Cp20(SEQ ID NO:3)有所改善的溶解度特徵。對於全身性藥物施用，在注射用水(WFI)和磷酸緩衝鹽溶液(PBS)中具有高溶解度的類似物宜應使所需注射體積減少至最少。通過比較，在WFI中具有高溶解度並且在PBS中具有更低溶解度的類似物可產生用於局部施用或局部注射例如眼內注射(例如，用於AMD的治療)的更長效的凝膠、沉澱物或懸浮物。已確定 Cp30(SEQ ID NO: 7)溶於 WFI 和 PBS，然而 Cp40 (SEQ ID NO: 18)在 PBS 中的溶解度小於在WFI中的溶解度。
[0068]本發明的肽類似物還顯示有利的血漿穩定性特徵，據認為這至少部分歸因於一個或多個抵抗蛋白酶攻擊的N末端組分(例如D-胺基酸殘基或N-甲基)或白蛋白結合分子的存在。此外,類似物特異和強勁地結合血漿中的C3、C3b和C3c。重要地，由本文中描述的N末端和/或其它修飾提供的穩定性促成了口服、皮下或肌內施用的改善的生物利用度，如在小鼠和兩種非人靈長類動物模型系統中顯示的，以及改善(即，更慢的)的類似物體內血漿消除半衰期值，如在靈長類動物模型系統中顯示的。
[0069]可將上述N末端修飾與先前顯示改善活性的坎普他汀的其它修飾組合，從而產生具有顯著改善的補體抑制活性的肽。例如，N末端的乙醯化通常增強坎普他汀及其類似物的補體抑制活性。因此，醯基在肽的氨基末端的添加(包括但不限於N-乙醯化)是本發明的一個實施方案，儘管如果肽的N末端已是穩定的或如果溶解度成為一個問題，那麼可能不需要。[0070] 作為另一個實例，已知Ala對位置9處His的取代改善了坎普他汀的活性，並且也是本發明的肽的優選修飾。還已確定Tyr對位置4處Val的取代可導致活性的適度改善(Kl印eis 等人，2003，J Am Chem Socl25:8422-8423)。
[0071 ] W02004/026328和W02007/0622249中公開了位置4處的Trp和某些Trp類似物以及位置7處的某些Trp類似物(特別地與位置9處的Ala組合的)產生比坎普他汀的活性高許多倍的活性。這些修飾同樣地用於在本發明中獲得有利方面。
[0072]具體地，已顯示在位置4處包含5-氟-色氨酸或者5-甲氧基-、5_甲基-或1_甲基-色氨酸或1-甲醯基-色氨酸的肽具有比坎普他汀高31-264倍的活性。特別優選的是1-甲基和1-甲醯基色氨酸。據信位置4上的吲哚『N』-介導的氫鍵不是坎普他汀的結合和活性所必需的。 通過在位置4上用低級烷基、烷醯基或吲哚氮替代氫使該氫鍵不存在或極性特徵減小增強了坎普他汀的結合和活性。不期望受限於任何特定理論或作用機制，據信位置4處的疏水相互作用或效應增強了坎普他汀與C3的相互作用。因此，位置4處的Trp的修飾(例如，按照本領域公知的方法改變側鏈的結構)，或者維持或增強上述疏水相互作用的Trp類似物在位置4或位置7處的取代在本發明中被視為有利的修飾，組合上述位置8和13處的修飾。這樣的類似物在本領域中是公知的，包括但不限於本文中舉例說明的類似物，以及其未取代的或以其它方式取代的衍生物。通過參考下列出版物和許多其它出版物可找到適當的類似物的實例:Beene,等人，2002, Biochemistry41:10262-10269 (描述單-和多-滷代 Trp 類似物等)；Babitzky&Yanofsky, 1995，J.Biol.Chem.270:12452-12456 (描述甲基化和滷代Trp以及其它Trp和吲哚類似物等)；和美國專利6，214，790,6, 169，057、5，776，970,4, 870，097,4, 576，750和4，299，838。如本領域中已知的，通過體外或體內表達，或通過肽合成可將Trp類似物引入坎普他汀肽。
[0073]在某些實施方案中，用包含1-烷基取代基，更具體地低級烷基(例如,C1-C5)取代基(如上文中定義的)的類似物替代坎普他汀的位置4上的Trp。這些類似物包括但不限於Ν(α)甲基色氨酸和5-甲基色氨酸。在其它實施方案中，用包含1-烷醯基，更具體地低級烷醯基(例如,C1-C5)取代基(如下文中定義的)的類似物例如Ν(α)甲醯基色氨酸、1-乙醯基-L-色氨酸和L- β -高色氨酸替代坎普他汀的位置4上的Trp。
[0074]W02007/0622249中公開了坎普他汀的位置7處5_氟-色氨酸的摻入相對於坎普他汀而言增加了所得坎普他汀類似物與C3之間的相互作用的焓,而位置4處5-氟-色氨酸的摻入減小了該相互作用的焓。因此，位置7處Trp的修飾，如W02007/0622249中描述的，結合上述N末端修飾在本發明中被視為有用修飾。
[0075]其它修飾描述於W02010/127336中。在該文獻中公開的一個修飾包括在肽的位置8處對肽主鏈的約束。在一個具體實施方案中，通過用N-甲基甘氨酸替代位置8上的甘氨酸(Gly8)來約束主鏈。該文獻中公開的另一個修飾包括用Ile、Leu、Nle (正亮氨酸)、N_甲基Thr或N-甲基Ile替代位置13處的Thr。
[0076]還有其它修飾描述於共同未決的申請N0.61/385，711中。一個這樣的修飾包括通過添加CH2來替代C2-C12 二硫鍵以在C2或C12上形成高半胱氨酸，和引入硫醚鍵以形成胱硫醚例如Y-胱硫醚或S-胱硫醚。另一個修飾包括用硫醚鍵而非添加CH2來替代C2-C12二硫鍵，從而形成羊毛硫氨酸。包含硫醚鍵的類似物顯示與某些二硫鍵類似物的活性大體相同的活性並且也具有等同的或改善的穩定性特徵。[0077]其它內部修飾描述於本申請中。例如，用鳥氨酸取代某些坎普他汀類似物(例如Cp20, SEQ ID N0:3, Cp40，SEQ ID NO: 18)的位置11上的精氨酸，和/或用天冬醯胺取代其位置6上的天冬氨酸，導致具有與親代化合物相似的結合和補體抑制活性的類似物。此外，這些取代的一個或兩個預期使得類似物不太易被腸道、肝或血漿中發現的某些生理酶代謝。
[0078] 本發明的修飾的坎普他汀肽可按照常規肽合成法，利用各種肽合成的合成法通過一個或多個胺基酸殘基的縮合來製備。例如，按照標準固相方法合成肽。通過固相方法或在液相中合成肽或肽模擬物的其它方法對於本領域技術人員來說是公知的。在肽合成的過程中，可使用公知的保護基團根據需要對支鏈氨基和羧基進行保護/去保護。適當的肽合成法的實例示於實施例1中。利用可選擇的保護基團對肽和肽衍生物的修飾對於本領域技術人員來說是顯而易見的。
[0079]或者，可通過在適當的原核或真核系統中表達來產生本發明的某些肽。例如，可將DNA構建體插入適合用於在細菌細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或酵母細胞(例如釀酒酵母)中表達的質粒載體，或插入用於在昆蟲細胞中表達的杆狀病毒載體或用於在哺乳動物細胞中表達的病毒載體。這樣的載體包含DNA在宿主細胞中表達所必需的調控元件，以定位方式可以允許DNA在宿主細胞中表達。這樣的表達所需的調控元件包括啟動子序列、轉錄起始序列和任選地增強子序列。
[0080]肽還可通過體外或體內表達核酸分子來產生。可將編碼肽的多聯體的DNA構建體(多聯體的上限取決於使用的表達系統)引入體內表達系統。在產生多聯體後，通過將多肽暴露於肼來實現C末端Asn與之後N末端G之間的切割。
[0081]可按照本領域已知的方法純化通過基因表達在重組原核或真核系統中產生的肽。基因表達和合成法的組合也可用於產生坎普他汀類似物。例如，可通過基因表達產生類似物，隨後使其經歷一個或多個翻譯後合成過程，例如以修飾N或C末端或者環化分子。
[0082]有利地，摻入非天然胺基酸，例如甲基化胺基酸的肽可通過在適當的原核或真核系統中體內表達來產生。例如，可利用一些方法、例如由Katragadda&Lambris (2006, Protein Expression and Purification47:289-295)描述的通過在大腸桿菌營養缺陷型中表達而將非天然Trp類似物引入坎普他汀的那些方法，在坎普他汀的選定位置處引入N-甲基化胺基酸或其它非天然胺基酸。
[0083]坎普他汀的結構在本領域是已知的，前述類似物的結構通過類似的方法來測定。在確認了短肽的特別期望的構象後，用於設計擬合該構象的肽或肽模擬物的方法在本領域中是公知的。與本發明特別相關的是，肽類似物的設計可通過考慮胺基酸殘基的各側鏈的貢獻來進一步改善，如上文中論述的(即，關於官能團的作用或關於立體化學的考慮)。
[0084]本領域技術人員應理解，肽模擬物可同樣好地作為肽用於提供結合C3和抑制補體活化所需的特定主鏈構象和側鏈功能性。因此，將其包括在本發明的範圍內，通過使用天然存在的胺基酸、胺基酸衍生物、類似物或能夠被連接以形成適當主鏈構象的非胺基酸分子產生結合C3、抑制補體的化合物。非肽類似物或包含肽和非肽組分的類似物在本文中有時被稱為〃肽模擬物〃或「等構模擬物(isosteric mimetic) 」，以表示本發明的肽的取代或衍生化，所述肽具有相同的主鏈構象特徵和/或其它功能性，以便與舉例說明的肽充分相似而抑制補體活化。[0085]肽模擬物用於高親和力肽類似物的開發的用途在本領域是公知的(參見，例如，Vagner 等人,2008, Curr.0pin.Chem.Biol.12:292-296 ；Robinson 等人,2008, Drug Disc.Todayl3:944-951)。假定可分析與肽、包含非胺基酸部分的類似物中的胺基酸殘基的旋轉約束相似的旋轉約束，則可利用任一種本領域公知的計算機化技術驗證它們的構象基序。
[0086]本發明的被修飾坎普他汀肽可通過將聚乙二醇(PEG)組分添加至肽來修飾。如本領域中公知的，PEG化可增加治療性肽和蛋白質的體內半衰期。在一個實施方案中，PEG具有約1，000至約50，000的平均分子量。在另一個實施方案中，PEG具有約1，000至約20，000的平均分子量。在另一個實施方案中，PEG具有約1，000至約10，000的平均分子量。在示例性實施方案中，PEG具有約5，000的平均分子量。聚乙二醇可以是支鏈或直鏈，優選為直鏈。
[0087]可通過連接基團將本發明的坎普他汀類似物共價鍵合於PEG。這樣的方法在本領域是公知的。(綜述於Kozlowski A.等人2001，BioDrugsl5:419-29中；也參見，Harris JM 和 Zalipsky S, eds.Poly(ethylene glycol), Chemistry and BiologicalApplications, ACS Symposium Series680 (1997))。可接受的連接基團的非限定性實例包括酯基團、醯胺基團、醯亞胺基團、氨基甲酸酯基團、羧基、羥基、碳水化合物、琥珀醯亞胺基團(包括但不限於琥珀醯亞胺琥珀酸酯(SS)、琥珀醯亞胺丙酸酯(SPA)、琥珀醯亞胺羧甲基化物(SCM)、琥珀醯亞胺琥珀醯胺(SSA)和N-羥基琥珀醯亞胺(NHS))、環氧化物基團、氧羰基咪唑基團(包括但不限於羰二咪唑(CDI))、硝基苯基(包括但不限於硝基苯基碳酸酯(NPC)或三氯苯基碳酸酯(TPC))、甲苯磺酸酯(trysylate)基團、醒基、異氰酸酯基團、乙烯基碸基團、酪氨酸基團、半胱氨酸基團、組氨酸基團或伯胺。在某些實施方案中，連接基團是琥珀醯亞胺基團。在一個實施方案中，連接基團是NHS。
[0088]或者可將本 發明的坎普他汀類似物通過氨基、巰基、羥基或羧基直接偶聯於PEG (即，無連接基團)。在一個實施方案中，可將PEG偶聯於添加至坎普他汀的C末端的賴
氨酸殘基。
[0089]作為PEG化的變通選擇，還可通過將肽連接於某些其它分子或肽來減少肽的體內清除。例如，當通過靜脈內推注入兔時，某些白蛋白結合肽(ABP)顯示2.3h的顯著長的半衰期(Dennis 等人，2002，J Biol Chem.277:35035-35043)。融合於 D3H44 的抗組織因子Fab的該類型肽使得Fab能夠結合白蛋白，同時保留Fab結合組織因子的能力(Nguyen等人，2006，Protein Eng Des Sel.19:291-297.)。當與野生型 D3H44Fab 相比較時，該與白蛋白的相互作用在小鼠和兔中導致顯著減少的體內清除和延長的半衰期，可與對於PEG化的Fab分子、免疫粘附素和白蛋白融合物看到的相當。W02010/127336提出利用ABP以及白蛋白結合小分子(ABM)，和任選地在組分之間利用間隔子或接頭的適當合成策略。這些方法導致生成能夠抑制補體活化並且還顯示延長的體內存活的ABP-和ABM-坎普他汀類似物綴合物。本文中的實施例1描述了這些和其它利用更高親和力的白蛋白結合小分子ABM2的方法用於利用接頭分子產生坎普他汀類似物-ABM2C末端綴合物的用途。實施例1進一步描述了使用直接連接而不使用接頭進行的某些坎普他汀類似物與3種不同白蛋白結合小分子ΑΒΜ、ΑΒΜ0和ABM2的N末端綴合物的產生。這樣的綴合物，無論是通過C末端、N末端直接綴合的還是通過間隔子或接頭綴合的，都顯示可與未綴合的類似物相當的C3結合和補體抑制活性或超過其的C3結合和補體抑制活性，以及有利的體內停留。[0090]坎普他汀類似物、肽模擬物和綴合物的補體活化抑制活性可通過多種本領域已知的測定來測試。在某些實施方案中，利用實施例中描述的測定。其它測定的非窮盡性列表示於美國專利 6，319，897，W099/13899, W02004/026328, W02007/062249 和 W02010/127336，包括但不限於(1)C3和C3片段的肽結合；(2)各種溶血測定；(3)C3轉化酶介導的C3切割的測量；和(4)因子D對因子B的切割的測量。
[0091]本文中描述的肽和肽模擬物對於現有技術中已知的利用坎普他汀本身的任何目的具有實際功用。這樣的用途包括但不限於:(I)抑制患者(人或動物)的血清中和細胞、組織或器官上的補體活化，這可有利於某些疾病或病況的治療，所述疾病包括但不限於年齡相關黃斑變性、類風溼性關節炎、脊髓損傷、帕金森氏病、阿爾茨海默病、癌症、敗血症、陣發性夜間血紅蛋白尿、銀屑病和呼吸病障礙例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、過敏性炎症、肺氣腫、支氣管炎、支氣管擴張、囊性纖維化、結核病、肺炎、呼吸窘迫症候群(RDS-新生兒和成人)、鼻炎和竇炎；(2)抑制在細胞或器官移植過程中或在人造器官或植入物的使用中發生的補體活化(例如，通過在進行所述方法之前、期間和/或之後限時全身性施用，或通過利用本發明的肽塗覆或另外地處理細胞、器官、人造器官或植入物)；(3)抑制在體外分流生理溶液(血液、尿)的過程中發生的補體活化(例如，通過在進行所述方法之前、期間和/或之後限時全身性施用，或通過用本發明的肽塗覆通過其分流所述流體的管道)；和
(4)篩選小分子文庫以鑑定坎普他汀活化的其它抑制劑(例如，被設計用來測量測試化合物與坎普他汀類似物競爭對C3或C3片段的結合的能力的液相或固相高通量測定)。
[0092]為了執行上述功用的一個或多個功用，本發明的另一個方面表徵了包含本文中描述的和舉例 說明的坎普他汀類似物或綴合物的藥物組合物。這樣的藥物組合物可由單獨的活性成分(以適合給受試者施用的形式存在)組成，或藥物組合物可包含活性成分和一種或多種藥學上可接受的載體，一種或多種另外的成分，或這些試劑的某種組合。活性成分可以以生理上可接受的酯或鹽(例如與生理上可接受的陽離子或陰離子組合)的形式存在於藥物組合物中,這在本領域是公知的。
[0093]基於其溶解度特徵，本發明的特定坎普他汀類似物可被選擇用於特定製劑。如上所述，在水中或緩衝鹽溶液中高度可溶的類似物可以特別適合用於全身性注射，因為可使注射體積減小至最小。通過比較，在水中具有高溶解度和在緩衝鹽溶液中具有更低溶解度的類似物可產生更長效的凝膠、懸浮物或沉澱物來用於局部施用或局部注射，例如眼內注射。因此，為了舉例說明性目的並且無意是限定性的，Cp30(SEQ ID NO:7)可被選擇用於待通過全身性注射施用的藥物製劑，而Cp40 (SEQ ID NO: 18)可被選擇用於玻璃體內注射的製劑。值得注意地，已顯示Cp40 (SEQ ID NO: 18)可通過口服和通過皮下或肌內注射獲得，這提供了重要的另外的遞送途徑，如下文中論述的。
[0094]藥物組合物的製劑可通過製藥工藝學領域內已知的或將來開發的任何方法來製備。一般而言，這樣的製備性方法包括使活性成分與載體或者一種或多種其它助劑結合，和隨後在必要時或需要時將產品成型或包裝成期望的單個劑量單位或多個劑量單位的步驟。
[0095]如本文中所用，術語〃藥學上可接受的載體〃意指可與坎普他汀類似物組合併且在組合後可用於給個體施用坎普他汀類似物的化學成分。
[0096]如本文中所用，術語〃生理上可接受的〃酯或鹽意指可與藥物組合物中的任何其它成分相容，對於將對其施用組合物的受試者是無害的活性成分的酯或鹽形式。[0097]可以單次快速推注方式或在重複方案中或以可由本領域技術人員容易確定的組合施用可用於實踐本發明的藥物組合物以遞送lng/kg至100mg/kg體重的劑量。在某些實施方案中，劑量以每日為基礎或者另一種合適的周期性方案包括至少0.lmg/kg，或至少0.2mg/kg,或至少0.3mg/kg,或至少0.4mg/kg,或至少0.5mg/kg,或至少0.6mg/kg,或至少0.7mg/kg,或至少0.8mg/kg,或至少0.9mg/kg,或至少lmg/kg,或至少2mg/kg,或至少3mg/kg,或至少4mg/kg,或至少5mg/kg,或至少6mg/kg,或至少7mg/kg,或至少8mg/kg,或至少9mg/kg,或至少10mg/kg,或至少15mg/kg,或至少20mg/kg,或至少25mg/kg,或至少30mg/kg,或至少35mg/kg,或至少40mg/kg,或至少45mg/kg,或至少50mg/kg,或至少55mg/kg,或至少60mg/kg,或至少65mg/kg,或至少70mg/kg,或至少75mg/kg,或至少80mg/kg,或至少85mg/kg,或至少90mg/kg,或至少95mg/kg,或至少100mg/kg。在一個具體的實施方案中，劑量為約 0.5mg/kg 至約 20mg/kg,或約 lmg/kg 至約 10mg/kg 或約 2mg/kg 至約 6mg/kg。
[0098]在一個實施方案中，本發明包括施用導致個體中坎普他汀類似物的血清濃度在約0.01 μ M至約30 μ M範圍內的劑量。在某些實施方案中，組合劑量和方案可導致坎普他汀類似物的血清濃度或隨時間的平均血清濃度為至少約0.01 μ Μ，或至少約0.02 μ Μ，或至少約0.03 μ Μ,或至少約0.04 μ Μ,或至少約0.05 μ Μ,或至少約0.06 μ Μ,或至少約0.07 μ Μ,或至少約0.08 μ Μ，或至少約0.09 μ Μ，或至少約0.1 μ Μ, 0.11 μ Μ，或至少約0.12 μ Μ，或至少約0.13 μ Μ,或至少約0.14 μ Μ,或至少約0.15 μ Μ,或至少約0.16 μ Μ,或至少約0.17 μ Μ,或至少約0.18 μ Μ,或至少約0.19 μ Μ,或至少約0.2 μ Μ，或至少約0.3 μ Μ，或至少約0.4 μ Μ，或至少約0.5 μ Μ，或至少約0.6 μ Μ，或至少約0.7 μ Μ，或至少約0.8 μ Μ，或至少約0.9 μ Μ，或至少約I μ M或至少約1.5 μ Μ，或至少約2 μ Μ，或至少約2.5 μ Μ，或至少約3 μ Μ，或至少約
3.5 μ Μ， 或至少約4 μ Μ，或至少約4.5 μ Μ，或至少約5 μ Μ，或至少約5.5 μ Μ，或至少約6 μ Μ，或至少約6.5 μ Μ，或至少約7 μ Μ，或至少約7.5 μ Μ，或至少約8 μ Μ，或至少約8.5 μ Μ，或至少約9 μ Μ，或至少約9.5 μ Μ，或至少約10 μ Μ，或至少約10.5 μ Μ，或至少約11 μ M或至少約11.5 μ Μ，或至少約12 μ Μ，或至少約12.5 μ Μ，或至少約13 μ Μ，或至少約13.5 μ Μ，或至少約14 μ Μ,或至少約14.5 μ Μ，或至少約15 μ Μ,或至少約15.5 μ Μ,或至少約16 μ Μ,或至少約16.5 μ Μ，或至少約17 μ Μ,或至少約17.5 μ Μ,或至少約18 μ Μ,或至少約18.5 μ Μ，或至少約19 μ Μ,或至少約19.5 μ Μ，或至少約20 μ Μ,或至少約20.5 μ Μ,或至少約21 μ M或至少約21.5 μ Μ，或至少約22 μ Μ，或至少約22.5 μ Μ，或至少約23 μ Μ，或至少約23.5 μ Μ，或至少約24 μ Μ,或至少約24.5 μ Μ，或至少約25 μ Μ,或至少約25.5 μ Μ,或至少約26 μ Μ，或至少約26.5 μ Μ，或至少約27 μ Μ，或至少約27.5 μ Μ，或至少約28 μ Μ，或至少約28.5 μ Μ，或至少約29 μ Μ，或至少約29.5 μ Μ，或至少約30 μ Mo在某些實施方案中，組合劑量和方案可導致坎普他汀類似物的血清濃度或隨時間的平均血清濃度為:不超過約0.ΙμΜ，或不超過約0.11 μ Μ，或不超過約0.12 μ Μ，或不超過約0.13 μ Μ，或不超過約0.14 μ Μ，或不超過約0.15 μ Μ,或不超過約0.16 μ Μ,或不超過約0.17 μ Μ,或不超過約0.18 μ Μ,或不超過約0.19 μ Μ,或不超過約0.2 μ Μ,或不超過約0.3 μ Μ,或不超過約0.4 μ Μ,或不超過約0.5 μ Μ，或不超過約0.6 μ Μ，或不超過約0.7 μ Μ，或不超過約0.8 μ Μ，或不超過約0.9 μ Μ，或不超過約ΙμΜ或不超過約1.5 μ Μ,或不超過約2 μ Μ,或不超過約2.5 μ Μ,或不超過約3 μ Μ,或不超過約3.5 μ Μ,或不超過約4 μ Μ,或不超過約4.5 μ Μ,或不超過約5 μ Μ,或不超過約5.5 μ Μ，或不超過約6 μ Μ，或不超過約6.5 μ Μ，或不超過約7 μ Μ，或不超過約7.5 μ Μ，或不超過約8 μ Μ,或不超過約8.5 μ Μ,或不超過約9 μ Μ,或不超過約9.5 μ Μ,或不超過約10 μ Μ,或不超過約10.5 μ M或不超過約11 μ M或不超過約11.5 μ Μ,或不超過約12 μ Μ,或不超過約12.5 μ Μ,或不超過約13 μ Μ,或不超過約13.5 μ Μ,或不超過約14 μ Μ,或不超過約14.5 μ Μ，或不超過約15 μ Μ，或不超過約15.5 μ Μ，或不超過約16 μ Μ，或不超過約16.5 μ Μ，或不超過約17 μ Μ,或不超過約17.5 μ Μ,或不超過約18 μ Μ,或不超過約18.5 μ Μ,或不超過約19 μ Μ，或不超過約19.5 μ Μ，或不超過約20 μ Μ，或不超過約20.5 μ M或不超過約21 μ M或不超過約21.5 μ Μ,或不超過約22 μ Μ,或不超過約22.5 μ Μ,或不超過約23 μ Μ,或不超過約23.5 μ Μ,或不超過約24 μ Μ,或不超過約24.5 μ Μ,或不超過約25 μ Μ,或不超過約
25.5 μ Μ，或不超過約26 μ Μ，或不超過約26.5 μ Μ，或不超過約27 μ Μ，或不超過約27.5 μ Μ，或不超過約28 μ Μ,或不超過約28.5 μ Μ,或不超過約29 μ Μ,或不超過約29.5 μ Μ,或不超過約 20 μ Mo
[0099]適當的範圍包括約0.1至約30 μ Μ,或約I至約29 μ Μ,或約2至約28 μ Μ,或約3至約27 μ Μ,或約4至約26 μ Μ,或約5至約25 μ Μ,或約6至約24 μ Μ,或約7至約23 μ Μ，或 約8至約22 μ Μ,或約9至約21 μ Μ,或約10至約20 μ Μ,或約11至約19 μ Μ,或約12至約18 μ Μ,或約13至約17 μ Μ,或約I至約5 μ Μ，或約5至約10 μ Μ,或約10至約15 μ Μ,或約15至約20 μ Μ，或約20至約25 μ Μ，或約25至約30 μ Μ。雖然施用的精確劑量取決於許多因素(包括但不限於患者的類型和待治療的疾病狀態的類型、患者的年齡和施用途徑)而變化，但這樣的劑量可由本領域技術人員來容易地確定。
[0100]可以頻繁至每天數次給患者施用藥物組合物，或可以以更低頻率例如每天一次、每周一次、每兩周一次、每月一次或甚至更低的頻率(例如每數月一次或甚至每年一次或更低的頻率)施用。給藥頻率對於本領域技術人員來說是顯而易見的，並且將取決於許多因素，例如但不限於待治療的疾病的類型和嚴重度，患者的類型和年齡，如上文中描述的。
[0101]可以口服製劑、胃腸外製劑、經眼製劑(包括玻璃體內製劑)、栓劑、氣霧劑、局部製劑、經皮製劑或其它相似製劑全身性施用可用於本發明方法的藥物組合物。這樣的藥物組合物可包含藥學上可接受的載體和已知增強和促進藥物施用的其它成分。其它製劑例如納米顆粒、脂質體、重新包封的紅細胞和基於免疫的系統也可用於按照本發明的方法施用坎普他汀類似物。
[0102]如本文中所用，藥物組合物的「 口服施用」或「經腸施用」包括特徵在於向胃腸道內引入的任何施用途徑。這樣的施用包括通過嘴的餵食以及口胃或胃內灌服法。這樣的施用還可包括舌下、含服、鼻內、經肺或直腸施用等本領域已知的途徑。
[0103]適合用於口服施用的藥物組合物的製劑包含與藥學上可接受的載體組合的活性成分，以多種劑型存在，所述劑型包括但不限於(僅舉幾例)丸劑、片劑、顆粒劑、粉劑、膠囊齊?、分散劑、懸浮劑、溶液、乳液、微乳液、凝膠和薄膜。這樣的劑型通常包括載體和賦形劑來促進活性成分的配製和遞送。
[0104]藥學上可接受的載體選自蛋白質、碳水化合物、脂質、有機和無機分子及其組合。可將活性成分與載體在適當的稀釋劑中組合來形成溶液或懸浮液。這樣的液體製劑可以是有粘性的或無粘性的，這取決於使用的量和載體。液體製劑可直接使用或可通過本領域技術人員已知的方法被進一步配製成適當的膠囊、凝膠膠囊或固體。或者，固體製劑可通過組合固體組分來製備。這樣的固體製劑可用作粉劑或被配製成顆粒、膠囊、片劑或薄膜，可將其任一種製備為延時釋放製劑(time release formulation)。
[0105]在口服劑型中用作載體的適當蛋白質包括乳蛋白質例如酪蛋白、酪蛋白酸鈉、乳清、低乳糖乳清、乳清蛋白濃縮物、明膠、大豆蛋白(分離的)、褐藻蛋白質、紅藻蛋白質、麵包酵母提取物和白蛋白。適當的碳水化合物包括纖維素例如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、醋酸纖維素和乙基纖維素、澱粉例如玉蜀黍澱粉、馬鈴薯澱粉、木薯澱粉、小麥澱粉、酸性改性澱粉、預明膠化澱粉和非改性澱粉、藻酸鹽例如藻酸銨、藻酸鈉和藻酸鈣、谷蛋白例如玉米谷蛋白(corn gluten)和小麥谷蛋白，樹膠例如阿拉伯樹膠(阿拉伯樹膠)，印度膠，瓜爾膠，刺梧桐樹膠(卡接牙膠)和樹膠(黃蓍膠)，不溶性葡萄糖異構酶製劑，糖例如玉米糖、轉化糖、玉米糖漿、高果糖穀物糖漿和葡萄糖酸鈉。適當的脂質包括生育酚例如a-維生素E醋酸酯、短鏈、中鏈和長鏈脂肪酸及其酯、脂肪族醇及其醚，油例如椰子油(精煉的)、大豆油(氫化的)和菜籽油、棕櫚酸鋁、硫代二丙酸雙十二酯、酶修飾卵磷脂、硬脂酸鈣、酶修飾的脂肪、硬脂酸棕櫚酸甘油酯、卵磷脂、甘油一酯和甘油二酯、甘油和蠟例如蜂蠟(黃色和白色)、小燭樹蠟和巴西棕櫚蠟以及植物油。適當 的有機和無機物包括甲基和乙烯基吡咯烷酮例如聚乙烯吡咯烷酮、甲磺醯甲烷、二甲基亞碸和相關化合物、羥酸和多羥酸例如聚乳酸等等。
[0106]在一些實施方案中，可製備受控釋放形式來實現坎普他汀類似物在消化道內的持續或位置特異性釋放，以改善吸收和防止某些形式的代謝。例如，片劑的耐酸包衣或耐酸膠囊材料可用於阻止坎普他汀類似物在胃中釋放並且保護化合物免受胃酶代謝。實現通過胃後的受控釋放的適當材料和包衣主要由脂肪酸、蠟、蟲膠、塑料和植物纖維組成，包括但不限於甲基丙烯酸酯-甲基丙烯酸共聚物、醋酸纖維素琥珀酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸琥珀酸羥丙基甲基纖維素(醋酸琥珀羥丙甲纖維素)、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、藻酸鈉或硬脂酸。胃腸道中的持續釋放可以例如通過將坎普他汀類似物包埋在不溶性物質例如各種丙烯酸酯、殼多糖等的基質中來實現。製備這樣的製劑的方法對於本領域技術人員來說是已知的。
[0107]可將坎普他汀配製成用於直腸、陰道或尿道施用的栓劑或灌腸劑。為此目的，可將坎普他汀類似物溶解或懸浮於油脂性基質載體例如可可脂中，所述可可脂在室溫下是固體或半固體、但在體溫下熔化，或懸浮在水溶性固體基質例如聚乙二醇或甘油(由甘油和明膠製備的)中。可添加其它賦形劑來改善製劑，可將栓劑塑造成有利於施用的形式。在其它實施方案中，可使用由溶解或懸浮在適合用於利用小注射器來施用的直腸遞送的液體載體中的坎普他汀類似物組成的液體栓劑。
[0108]為了治療其中牽涉補體活化的慢性或急性肺病況，藥物組合物的優選施用途徑是肺部施用。因此，可將其以適合於通過口腔進行肺部施用的製劑製備、包裝或銷售本發明的藥物組合物。這樣的製劑可包括包含活性成分並且具有在約0.5至約7納米，優選約I至約6納米的範圍內的直徑的乾燥顆粒。這樣的組合物方便地以乾粉的形式存在，以使用包含可將一股噴射劑導向其以分散粉劑的乾粉貯存器或使用自噴射劑/粉末分配容器的裝置(例如包含溶解或懸浮在密閉容器內的低沸點噴射劑中的活性成分的裝置)進行施用。優選地，這樣的粉劑包括這樣的顆粒，其中按重量計至少98%的顆粒具有大於0.5納米的直徑，按數目計至少95%的顆粒具有小於7納米的直徑。更優選地，按重量計至少95%的顆粒具有大於I納米的直徑，按數目計至少90%的顆粒具有小於6納米的直徑。乾粉組合物優選包括固體細粉稀釋劑例如糖，並且方便地以單位劑量形式提供。
[0109]低沸點噴射劑通常包括在大氣壓下具有低於65° F的沸點的液體噴射劑。一般而言，噴射劑可構成50至99.9%(w/w)的組合物,活性成分可構成0.1至20%(w/w)的組合物。噴射劑還可包含另外的成分例如液體非離子型或固體陰離子型表面活性劑或固體稀釋劑(優選具有與包含活性成分的顆粒相同等級的顆粒尺寸)。
[0110]配製用於肺部遞送的本發明的藥物組合物還可以以溶液或懸浮液的滴劑形式提供活性成分。可以任選地無菌的，包含活性成分的含水或稀釋的醇溶液或懸浮液形式製備、包裝這樣的製劑，或銷售，並且可方便地使用任何霧化或噴霧裝置來施用。這樣的製劑還可包含一種或多種另外的成分，包括但不限於調味劑例如糖精鈉、揮髮油、緩衝劑、表面活性劑，包括替代肺表面活性劑或防腐劑例如羥苯甲酯。通過該施用途徑提供的滴劑優選具有在約0.1至約200納米範圍內的平均直徑。
[0111]在本文中描述為可用於肺部遞送的製劑也可用於本發明的藥物組合物的鼻內遞送。
[0112]適合用於鼻內施用的另一種製劑是包含活性成分並且具有約0.2至500微米的平均顆粒的粗粉。以其中採用鼻煙(即通過經由鼻道從保持靠近鼻孔的粉劑容器快速吸入)的方式施用這樣的製劑。
[0113]適合用於經鼻施用的製劑可以例如包含約少至0.l%(w/w)至多至100%(w/w)的活性成分，並且還可包含一種或多種本文中描述的另外的成分。
[0114]如本文中所用，藥物組合物的〃胃腸外施用〃包括特徵在於受試者的組織的物理損傷的任何施用途徑和通過組織的傷口進行的藥物組合物的施用。胃腸外施用從而包括但不限於通過注射組合物，通過經由手術切口施用組合物，通過經由組織穿透性非手術傷口施用組合物等進行的藥物組合物的施用。具體地，胃腸外施用意欲包括但不限於靜脈內、皮下、腹膜內、肌內、關節內、玻璃體內、胸骨內和腎滲析輸注技術。
[0115]適合用於胃腸外施用的藥物組合物的製劑包含與藥學上可接受的載體例如無菌水或無菌等滲鹽溶液組合的活性成分。可以適合用於推注施用或用於連續施用的形式製備、包裝或銷售這樣的製劑。可以單位劑型(例如在安瓿中或在包含防腐劑的多劑量容器中)製備、包裝或銷售可注射製劑。用於胃腸外施用的製劑包括但不限於油性或含水媒介物中的懸浮液、溶液、乳劑、糊劑和可植入的持續釋放或生物可降解製劑。這樣的製劑還可包含一種或多種另外的成分，包括但不限於懸浮劑、穩定劑或分散劑。在用於胃腸外施用的製劑的一個實施方案中，以乾燥(即粉劑或粒劑)形式提供活性成分，以在胃腸外施用重建的組合物之前利用適當的媒介物(例如無菌無熱原水)進行重建。
[0116]可以無菌可注射含水或油性懸浮液或溶液的形式製備、包裝或銷售藥物組合物。該懸浮液或溶液可按照已知技術進行配製，並且除了活性成分以外還可包含另外的成分例如本文中描述的分散劑、溼潤劑或懸浮劑。這樣的無菌可注射製劑可以例如使用無毒性的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑(例如水或1，3- 丁二醇)來製備。其它可接受的賦形劑和溶劑包括但不限 於林格液、等滲氯化鈉溶液和不揮髮油例如合成甘油一酯或甘油二酯。有用的其它胃腸外可施用製劑包括將活性成分以微晶纖維素形式，以脂質體製劑形式，以用於超聲釋放遞送的微氣泡中或作為生物可降解聚合物系統中組分的那些製劑。用於持續釋放或植入的組合物可包含藥學上可接受的聚合材料或疏水性材料，例如乳劑、離子交換樹脂、微溶聚合物或微溶鹽。
[0117]如本文中所用，〃另外的成分〃包括但不限於下列物質中的一種或多種:賦形劑；表面活性劑，包括取代肺表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；粒化劑和崩解劑；粘合劑；潤滑劑；甜味劑；調味劑；著色劑；防腐劑；生理上可降解組合物例如明膠；水性媒介物和溶劑；油性媒介物和溶劑；懸浮劑；分散劑或溼潤劑；乳化劑、緩和劑；緩衝劑；鹽；增稠劑；填充劑；乳化劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；穩定劑；以及藥學上可接受的聚合或疏水材料。可包含在本發明的藥物組合物中的其它"另外的成分"在本領域中是已知的，並且描述於例如 Genaro, ed.，1985，Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack PublishingC0., Easton, PA 中。
[0118]方法:
[0119]本發明的另一個方面涉及調控補體活化的方法。一般地，所述方法包括將其中期望調控補體活化的介質與本發明的坎普他汀類似物接觸，其中所述接觸導致介質中補體活化的調控。介質可以是其中期望調控補體活化的任何介質。在某些實施方案中，介質包括生物體的細胞或組織，包括(I)培養的細胞或組織，(2)受試者或患者機體內的細胞或組織；和(3)已從一個受試者的機體內取出並且將被置於相同患者的體內(例如，血液的體外分流或自體移植)或轉移至另一個患者的細胞或組織。就後一種實施方案而言，介質還可包含生物材料，例如在體外分流 過程中接觸細胞或組織的管線、濾器或膜。或者，介質可包含被置入受試者的生物材料。
[0120]在某些實施方案中，調控補體活化的方法適用於活的患者或受試者，並且包括針對與補體活化(特別地AP介導的補體活化)相關的病理狀況治療患者的方法的部分或全部。許多這樣的病理狀況在本領域中是已知的(參見，例如，Holers, 2008，同上)，包括但不限於如非典型性溶血性尿毒症症候群(aHUS)、緻密沉積物病、年齡相關黃斑變性(AMD)、陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)、冷凝集素疾病(CAD)、類風溼關節炎(RA)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、幾種自身免疫性和自身炎症性腎病、自身免疫性心肌炎、多發性硬化、外傷性腦和脊髓損傷、腸和腎缺血-再灌注(IR)損傷、自發和反覆性妊娠失敗、抗磷脂症候群(APS)、阿爾茨海默病、哮喘症、抗細胞核胞眾相關寡免疫血管炎(ant1-nuclear cytoplasmicantigen-associated pauc1-1mmune vasculitis) (Wegener，s 症候群)、非-狼瘡自身免疫性皮膚病例如天皰瘡、大皰性類天皰瘡和大皰性表皮鬆解、創傷後休克(post-traumaticshock)、某些形式的癌症和動脈粥樣硬化。在一些具體的實施方案中，病理狀況與編碼FH和/或CD46的基因中的突變和多態性相關，但不限於:AMD、aHUS和膜增生性腎小球腎炎II型(MPGN-1I，也稱為緻密沉積物病(DDD))。在其它實施方案中，本發明的坎普他汀類似物適合用作依庫珠單抗或TT30的替代品用於治療在目前針對性開具這些藥劑的疾病的治療中，或正在進行臨床前和臨床研究開發的疾病的治療中。這些疾病包括但不限於aHUS、PNH、CAD 和 MD。
[0121]治療方法通常包括(I)鑑定具有可通過調控補體活化(如上文中描述的)治療的疾病或病況的受試者，和(2)使用適合於待治療病況的治療方案和持續時間給受試者施用有效量的本發明的坎普他汀類似物。適當劑量和治療方案的開發將取決於許多因素而變化，包括但不限於患者的類型和待治療的疾病狀態的類型、患者的年齡和施用途徑。本領域技術人員熟悉將這樣的變量考慮在內的給藥方案的設計。例如，對於本領域技術人員來說很顯然的是本發明的坎普他汀類似物的口服施用因相較於例如靜脈內注射而言具有更少的生物利用度而需要更高的初始製劑。
[0122]提供下列實施例以更詳細地描述本發明。它們意欲舉例說明本發明，但不限定本發明。
[0123]實施例1
[0124]本實施例描述了具有N末端修飾的坎普他汀類似物和某些類似物與白蛋白結合小分子的綴合物的合成。
[0125]化學藥品。Rink酸胺MBHA樹脂、Oxyma和下列Fmoc-胺基酸獲自Novabiochem(SanDiego, CA):1le、Cys (Trt)、Val、Tyr (tBu)、Gln (Trt)、Asp (OtBu)、Trp (Boc)、Gly、Sar、Ala、MeAla、His(Trt)、Arg (Pbf)、Melle、Phe, MePhe 和 D-Cha0 DIC 和 Fmoc-Trp (Me) -OH購自 AnaSpec (San Jose, CA)? HOAt 購自 Advanced ChemTech(Louisville, KY)。NMP和DCM獲自Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) ?用於合成的所有其它化學試劑購自Sigma-Aldrich (St.Louis, MO),並且可直接使用而無需進一步純化。 [0126]肽合成和純化。所有肽通過Fmoc固相法,使用DIC和Oxyma作為偶聯劑來人工合成。下列方法用於合成線性肽:將Rink醯胺MBHA樹脂(0.59mmol/g)置於在底部配備有釉料的肽合成玻璃容器中，並且在DCM中溶脹30min。在除去Fmoc保護基團(NMP中的25%哌啶，5和IOmin)後，用NMP洗滌樹脂7次，用DCM洗滌2次，將各胺基酸偶聯至樹脂。對於每一個偶聯，使用3個當量的胺基酸、HOAt和DIC，於NMP中預活化10分鐘。將所有偶聯進行lh，通過Kaiser測試或氯醌測試進行監控。在陽性測試結果的情況下，重複偶聯直至觀察到陰性測試結果。在偶聯位置I處的Cys後，終止合成。隨後在HSW聚丙烯注射中將樹脂與底部上釉料分離(Torviq，Niles, MI)，使用先前報導的方法偶聯另外的胺基酸。
[0127]在完成固相合成後，用NMP、DCM和DCM/二乙醚(1:1)洗滌樹脂4次，在高真空下乾燥4h。利用94%TFA，2.5%水以及2.5%EDT和1%TIPS的混合物將肽從樹脂上切割下來，進行2h。在於真空下蒸發TFA後，將肽沉澱，利用冷二乙醚洗滌3次。通過離心將液體與固體分離，並將液體輕輕倒出。將粗製肽於真空中乾燥，溶解在30%的乙腈中。使用濃氫氧化鋁將溶液的PH調整至8-9。伴隨劇烈攪拌向溶液中添加稀釋的過氧化氫(1:100，2當量)。通過使用MALD1-T0F監控環化。當反應完成時，用TFA補充溶液以將pH降至2。冷凍乾燥溶液。如先前所述(Qu等人，2011，同上)，利用RP-HPLC純化粗製肽。純化肽的純度 >95%，如通過分析型 RP-HPLC (Phenomenex00G-4041-E0Luna5 μ C18100A 柱，250x4.60mm ；Phenomenex, Torrance, CA)測定的。每一種妝的質量使用 Waters MALDI micro MX 儀或Synapt HDMS 來確認。
[0128]將某些坎普他汀類似物綴合於白蛋白結合小分子，其實例示於下面。
[0129]

S.0
ABM: 廣 '!, '丫
[0130]
【權利要求】
1.一種包含經修飾坎普他汀肽(ICVVQDWGHHRCT (環C2-C12 ;SEQ ID NO:1)或其類似物的化合物，其中所述修飾包括添加的或取代的N末端組分所述組分相較於等同條件下的未修飾坎普他汀肽而言改善了(I)所述肽的C3、C3b或C3c結合親和力，(2)所述肽在含水液體中的溶解度，和/或(3)所述肽的血漿穩定性和/或血漿停留時間。
2.權利要求1的化合物，其中所述添加的組分是除L-Gly外的胺基酸或胺基酸的非肽類似物。
3.權利要求2的化合物，其中所述添加的組分是D-胺基酸。
4.權利要求2的化合物，其中所述添加的組分包括至少一個芳環。
5.權利要求2或權利要求3的化合物，其中所述添加的組分是D-Tyr。
6.權利要求2的化合物，其中所述胺基酸是N-甲基化。
7.權利要求6的化合物，其中所述胺基酸是N-甲基甘氨酸(Sar)。
8.權利要求2-6中任一項的化合物，其中所述添加的組分是D-Tyr、D-Phe,Tyr(Me)、D-Trp> Tyr> D-Cha> Cha> Phe> Sar> Arg、mPhe、mVal、Trp> mile、D_Ala、mAla、Thr 或 Tyr0
9.權利要求1的化合物，其包含取代的N末端組分，其中位置I處的Ile被Ac-Trp或二肽Tyr-Gly取代。
10.權利要求1-9中任一項的化合物，其還包括Ala對位置9處His的替代。
11.權利要求1-10中任一項的化合物，其還包含Trp或Trp類似物對位置4處Val的替代。
12.權利要求11的化合物，其中位置4處的Trp類似物是1-甲基Trp或1-甲醯基Trp0
13.權利要求11的化合物，其還包括Trp類似物對位置7處Trp的替代。
14.權利要求13的化合物，其中位置7處Trp類似物是滷代Trp。
15.權利要求1-14中任一項的化合物，其還包括位置8處Gly的修飾以約束該位置處的主鏈構象。
16.權利要求15的化合物，其中通過用N°-甲基Gly替代位置8處的Gly(Gly8)來約束主鏈。
17.權利要求15的化合物，其還包括利用Ile、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile替代位置13處的Thr。
18.權利要求1-17中任一項的化合物，其還包括利用硫醚鍵替代C2與C12之間的二硫鍵以形成胱硫醚或羊毛硫氨酸。
19.權利要求1-18中任一項的化合物，其還包括利用Orn替代位置11處的Arg。
20.權利要求1-19中任一項的化合物，其還包括利用Asn替代位置6處的Asp。
21.權利要求1的化合物，其為包含具有SEQID NO:29所示序列的肽的坎普他汀類似物，其為:
Xaal-Xaa2-Cys-Val-Xaa3-Gln-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-His-Xaa7-Cys-Xaa8,其中 Xaa4與Xaa5之間的Gly任選地被修飾以約束主鏈構象； 其中: Xaal不存在或為Tyr、D-Tyr或Sar ；
Xaa2 為 lie、Gly 或 Ac-Trp ；Xaa3為Trp或Trp類似物，其中所述Trp類似物相較於Trp具有增強的疏水特徵； Xaa4 為 Asp 或 Asn; Xaa5為Trp或Trp類似物，所述Trp類似物包括對其吲哚環的化學修飾，其中所述化學修飾增加吲哚環的氫鍵潛能；
Xaa6 為 His、Ala、Phe 或 Trp ；
Xaa7 為 Arg 或 Orn ;和 Xaa8 為 Thr, He, Leu, Nle, N-甲基 Thr 或 N-甲基 He，其中 Thr、lie、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基Ile中任一個的羧基末端-OH任選地被-NH2替代，和所述肽通過Cys-Cys或硫醚鍵呈環狀。
22.權利要求19的化合物，其中: 位置8處的Gly為N-甲基化的；
Xaal 為 D-Tyr 或 Sar ；
Xaa2 為 Ile ; Xaa3為Trp, 1-甲基-Trp或1-甲醯基-Trp ；
Xaa5 為 Trp ；
Xaa6 為 Ala ;和 Xaa8為Thr、lie、Leu、Nle、N-甲基Thr或N-甲基lie，任選地用-NH2替代羧基末端-OH。
23.權利要求22的化合物，其中Xaa8為11e、N-甲基Thr或N-甲基11 e，任選地用-NH2替代羧基末端-OH。
24.權利要求23的化合物，其包含SEQID N0:7或SEQ ID NO: 18。
25.前述權利要求中任一項的化合物，其包含增加所述化合物的生物利用度或延長所述化合物的體內停留的另外的組分。
26.權利要求25的化合物，其中所述另外的組分是聚乙二醇(PEG)。
27.權利要求25的化合物，其中所述另外的組分是白蛋白結合小分子。
28.權利要求27的化合物，其中將所述白蛋白結合小分子在N末端或C末端連接於所述肽。
29.權利要求25的化合物，其在所述肽與白蛋白結合小分子之間包含間隔子。
30.權利要求25的化合物，其中所述另外的組分是白蛋白結合肽。
31.一種藥物組合物，其包含前述權利要求中任一項的化合物和藥學上可接受的載體。
32.權利要求31的藥物組合物，其被配製用於所述化合物的口服施用。
33.權利要求31的藥物組合物，其被配製用於所述化合物的局部施用。
34.權利要求31的藥物組合物，其被配製用於所述化合物的肺部施用。
35.權利要求31的藥物組合物，其被配製用於所述化合物的皮下或肌內注射。
36.權利要求31的藥物組合物，其被配製用於所述化合物的靜脈內注射。
37.前述權利要求中任一項的化合物用於製備用於抑制補體活化的藥劑的用途。
38.前述權利要求中任一項的化合物用於抑制補體活化的用途。
【文檔編號】C07K7/64GK103987725SQ201280050936
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年9月7日 優先權日:2011年9月7日
【發明者】J·D·蘭布裡斯, H·曲, D·裡克林 申請人:賓夕法尼亞州大學理事會