一種適用於底泥中微生物群落結構分析的dna提取方法
2023-05-03 07:54:46 1
專利名稱：一種適用於底泥中微生物群落結構分析的dna提取方法
技術領域：
本發明屬於環境微生物生態學技術領域，具體涉及一種適用於底泥中微生物群落 結構分析的DNA提取方法。
背景技術：
河流或湖泊中的底泥是生態系統的重要組成部分，也是大量微生物類群的棲息 地，這些微生物類群在湖泊進化演替以及營養元素循環等方面發揮著重要的作用。當前， 有關底泥中的微生物群落結構組成的研究已成為微生物生態學研究中的熱點領域。但 是，由於自然界中存在的許多微生物不可培養，依靠傳統的顯微鏡觀察和分離培養來研 究微生物的方法難以快速、全面的對湖泊沉積物中的微生物進行研究。近年來，隨著分 子生物學技術的發展，產生了一些新的微生物生態學研究方法，如自動核糖體基因間隙 分析(Automated ribosomal intergenicspacer analysis, ARISA)，變性梯度凝膠電泳 (Denaturing gradient gelelectrophoresis， DGGE)以及末端限制性片段長度多態性 (Terminal restrictionfragment length polymorphisms,T-RFLP)等，這些方法的共同之
處是突破了原有的微生物分離培養的過程限制，能夠更加全面的分析自然界中存在的各種
微生物。另外，這些基於核酸的分子生物學技術一般需要先從底泥中提取出DNA，然後再進 行進一步的分子生物學研究。因此，DNA提取質量的好壞，會直接影響到微生物群落結構的 分析結果。通常底泥成分複雜，難以直接提取到高濃度、高質量的DNA。另外，底泥中包含的 腐質酸、重金屬等物質會干擾後續的PCR反應，必須在DNA提取階段予以去除。目前大多數 學者使用的DNA提取方法有的無法有效去除底泥中的腐質酸等幹擾物質，給後續的PCR擴 增帶來困難，有的需要使用高成本的核酸吸附柱。因此，探索簡便、高效、低成本的DNA提取 方法仍然是微生物生態學研究所面臨的難題。
發明內容
技術問題本發明提供了一種從底泥中提取DNA的簡便、高效的方法，可直接用於 底泥中微生物群落結構的分析。 技術方案一種底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法，提取步驟為
a.用TENP buffer清洗底泥樣品，將清洗好的底泥樣品懸浮於PBSbuffer中；
b.將經步驟a預處理的底泥樣品在-S(TC和65t:反覆凍溶後加入溶菌酶，在37°C 水浴lh，所述溶菌酶最終濃度為lmg/mL ; c.向底泥樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，在55t:水浴1.5h，所述蛋白酶 K最終濃度為0.2mg/mL，所述十二烷基磺酸鈉最終濃度為1% (w/v); d.步驟c所得樣品在室溫下離心後取上清液，向其中加入等體積的酚氯仿異
戊醇混合液，振蕩混勻，所述混合液中各物質的體積比為25 : 24 : i; e.步驟d所得樣品室溫下離心後取液相，向液相中加入等體積的氯仿異戊醇混 合液，混合液中氯仿異戊醇的體積比為24 : 1;
3
f.步驟e所得樣品室溫下離心後取液相，向液相中加入預冷的異丙醇在_20°〇沉 澱2h; g.步驟f所得樣品在4t:條件下離心去上清，向沉澱中加入預冷的乙醇洗滌沉澱
三次，再離心去乙醇； h.將樣品在空氣中自然風乾，用TE緩衝液溶解DNA保存於-2(TC。
—種底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法，提取步驟為稱取0. 5g溼重的 底泥樣品置於5mL滅菌後的離心管中，加入3mL TENP buffer,所述TENP buffer的配方為 50mM Tris，200mM EDTA， lOOmM NaCl， 0. 01g/mLPVPP， pHlO. 0，漩渦振蕩8min， lOOOOrpm離 心5min，棄上清，在沉澱中再加3mL TENP buffer,按上述方法再洗滌兩次，最後加3mL的 PBS buffer,所述PBS buffer配方為8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HP04， 0. 24g KH2P04，:^# 於1L水中，pH7. 4 ;將預處理之後的沉積物樣品置於-S(TC和65t:反覆凍溶三次，向樣品中 加入溶菌酶，溶菌酶的終濃度為lmg/mL，在37t:水浴lh ;向樣品中加入蛋白酶K和十二烷 基磺酸鈉，蛋白酶K的終濃度為0. 2mg/mL，十二烷基磺酸鈉的終濃度為1 % (w/v)，在55°C 水浴1. 5h，每10 15min輕輕倒置離心管幾次，混勻；樣品在室溫下lOOOOrpm離心5min， 取出500iiL上清液置於一新離心管中，向其中加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液， 酚氯仿異戊醇的體積比為25 : 24 : 1，輕輕振蕩、混勻；室溫下14000rpm離心25min，
取出400iiL水相置於一新離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液，氯仿異戊醇的
體積比為24 : 1 ;室溫下14000rpm離心25min，取出300iiL水相置於一新離心管中，加 入200 ii L預冷的異丙醇，在-20。C沉澱2h ;在4。C條件下，14000rpm離心25min，去上清， 向沉澱中加入lmL 70X體積濃度的冷乙醇洗滌沉澱，12000rpm離心10min，去乙醇，再用 同樣方法洗滌沉澱兩次；倒掉乙醇，在空氣中自然風乾，用50ii L TE緩衝液溶解DNA，保存 於-20。C，所述TE緩衝液配方為10mM Tris-HCl， lmM EDTA， pH8. 0。 有益效果本方法可有效去除底泥中存在的腐質酸等雜質，為後續的PCR擴增實 驗的順利開展提供了有利的條件。 本方法操作簡便，所用到的試劑均為常規生化試劑，不需要使用價格昂貴的DNA 吸附柱，降低了實驗成本。
圖1為應用本方法提取得到的DNA電泳圖譜；其中1 8號泳道為某湖泊不同 採樣點底泥樣品中提取得到的DNA條帶，9號泳道為A-Hind III DNAMarker，最大片段為 23. 1Kb。 圖2為應用本方法提取的DNA為模版，採用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增 得到的電泳圖譜。其中1 8號泳道分別為應用提取的1 8號總DNA進行PCR擴增所 得的電泳條帶，9號用到為DL 2000DNA Marker。 圖3為應用其它方法提取得到的DNA電泳圖譜；其中1 8號泳道為某湖泊不同 採樣點底泥樣品中提取得到的DNA條帶，9號泳道為A-Hind III DNAMarker，最大片段為 23. 1Kb。
具體實施方式
材料 (1)湖泊底泥樣品； (2)三羥基甲基氨基甲烷，乙二銨四乙酸，聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，氯化鈉，氯化 鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，蛋白酶K，溶菌酶，十二烷基磺酸鈉，酚，氯仿，RNase A，異戊 醇，異丙醇，無水乙醇； (3) TENP緩衝液:50mM Tris，200mM EDTA， lOOmM NaCl，O. 01g/mLPVPP， pHlO. 0 ;
(4)PBS緩衝液8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HP04，0. 24g KH2P04，溶於1L水中， pH7. 4 ; (5)DNA抽提緩衝液100mM Tris-HCl， lOOmM EDTA， 100mMNa3P04， 1. 5MNaCl， 1 % CTAB(w/v)。 DNA純度的檢測方法用分光光度計測定OD26。/OD28。，與標準值進行比較。
實施例1 稱取0. 5g底泥樣品(溼重)置於5mL滅菌後的離心管中，加入3mL TENPbuffer， 漩渦振蕩8min， lOOOOrpm離心5min，棄上清，在土壤顆粒沉澱中再加3mL TENP buffer,按 上述方法再洗滌兩次，最後加3mL的PBS buffer。將預處理之後的底泥樣品置於_80"和 65t:反覆凍溶三次，向樣品中加入溶菌酶(最終濃度為lmg/mL)，在37t:水浴lh。向樣品中 加入蛋白酶K(最終濃度為0. 2mg/mL)和十二烷基磺酸鈉(SDS)(最終濃度為l%，w/v)，在 55t:水浴1. 5h (每10 15min輕輕倒置離心管幾次，混勻)。在室溫下10000rpm離心5min，
取出500ii L上清液置於一新離心管中，向其中加入等體積的酚氯仿異戊醇混合液(體
積比為25 : 24 : 1)，輕輕振蕩、混勻。室溫下14000rpm離心25min，取出400iiL水相置於 一新離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液(體積比為24 : 1)。室溫下14000rpm 離心25min，取出300 y L水相置於一新離心管中，加入200 y L預冷的異丙醇，在-2(TC沉 澱2h。在4t:條件下，14000rpm離心25min，去上清，向沉澱中加入lmL 70%體積濃度的冷 乙醇洗滌沉澱，12000rpm離心10min，去乙醇，再用同樣的方法洗滌沉澱兩次。倒掉乙醇， 在空氣中自然風乾，用50ii L TE緩衝液(10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH8.0)溶解DNA，保存 於-20。C。 將提取得到的總DNA用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果在紫外燈下拍照，圖 譜見圖1。 用紫外分光光度計測定所提取的DNA在260nm和280nm處的吸光度，計算出0D26。/ 0D28。的平均值為1. 82，屬於純DNA的OD26。/OD28。 " 1. 8的範圍，可直接用於後續的PCR擴增 反應。 實施例2 將實施例1中提取得到的DNA作為聚合酶鏈式反應(PCR)的模板，使用 美國Bio-Rad公司的PCR擴增儀，採用細菌的16S rRNA基因V3區的通用引物對 GC-F341禾P R518進行擴增，引物具體序列為F341 (5 ' -CCTACGGGAGGCAGCAG-3 '); R518(5 ' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ' ) ， GC發卡結構(5 ' -CGCCCGCCGCGCGCG GCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGC-3')。(上海生工生物工程技術服務有限公司提供)
50 ii L的PCR反應體系包括DNA模板50ng、正反向引物各20pmo1、200 y M dNTP、10 X PCR buffer (不含MgCl2) 5 ii L、 1. 5mM的MgCl2、 1U的ExTaqDNA聚合酶和適量的雙蒸水 補足50iiL。 PCR反應採用降落式PCR策略，艮卩94t:預變性5min，前20個循環為94t: lmin， 65 55°C lmin和72°C 3min(其中每個循環後復性溫度下降0. 5°C )，後10個循環條件為 94°C lmin，55°C lmin和72 °C 3min，最後在72"C下延伸8min，4t:保存。PCR擴增產物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果在紫外燈下拍照，圖譜見圖2。從圖中可以看出，採用實施例 1所述方法提取得到的DNA經PCR擴增後都得到了清晰、明亮的條帶，說明按實施例1所述 方法提取得到的DNA可直接用於PCR擴增。
實施例3 稱取0. 5g底泥樣品(溼重)，同時加入5mL DNA抽提緩衝液(100mMTris-HCl， pH8. 0， 100mM EDTA， pH8. 0， 100mM Na3P04緩衝液，pH8. 0， 1. 5M NaCl， 1% CTAB， w/v)和蛋白 酶K(終濃度為200ii g/mL)，混合均勻，於搖床中水平振蕩(37°C，225rpm)約30min後，加入 lmL TE(10mM Tris-HCl，lmM EDTA，pH8.0)和溶菌酶(終濃度為lmg/mL)，繼續振蕩30min， 再加0.5mL 20% (W/V)的SDS，經65。C水浴30min後加入2%的PVPP (w/v) ， 10000rpm離心 10min，將上清液移入新的離心管，沉澱重複抽提2次，步驟為往沉澱中加入DNA抽提緩衝 液及20%的SDS(w/v) ，65"水浴10min， 10000rpm離心10min，收集3次抽提的上清液於同 一離心管中，加入RNaseA(終濃度為200 y g/mL)，在37。C下作用15min，加入等體積酚氯 仿異戊醇(25 : 24 : l)溶液輕輕混勻，15000rpm離心15min，將上層水相移入新的離心 管，加入0. 6倍體積異丙醇，於-20°C中沉澱lh。在4°C ， 12000rpm條件下離心10min，棄上 清，沉澱用70%體積濃度乙醇洗兩次，溶解於50 ii L TE緩衝液中，於-2(rC保存。
將提取得到的總DNA用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結果在紫外燈下拍照，圖 譜見圖3。 用紫外分光光度計測定所提取的DNA在260咖和280咖處的吸光度，計算出OD26。/OD28。
的平均值為1.66，說明其中含有蛋白等雜質。 序列表 〈110>河海大學 〈120〉 一種適用於底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法 〈130〉 〈141>2009-10-22 〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211〉 17 〈212>DNA 〈213>人工引物 〈400〉 1 cctacgggag gcagcag 17
〈210>2
〈211〉 17
〈212>DNA〈213〉人工引物〈400>2attaccgcgg ctgctgg〈210>3〈211〉40〈212>DNA人工序列〈400>3cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggc
17
40
權利要求
一種底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法，其特徵在於提取步驟為a.用TENP buffer清洗底泥樣品，將清洗好的底泥樣品懸浮於PBSbuffer中；b.將經步驟a預處理的底泥樣品在-80℃和65℃反覆凍溶後加入溶菌酶，在37℃水浴1h，所述溶菌酶最終濃度為1mg/mL；c.向底泥樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，在55℃水浴1.5h，所述蛋白酶K最終濃度為0.2mg/mL，所述十二烷基磺酸鈉最終濃度為1％(w/v)；d.步驟c所得樣品在室溫下離心後取上清液，向其中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，所述混合液中各物質的體積比為25∶24∶1；e.步驟d所得樣品室溫下離心後取液相，向液相中加入等體積的氯仿異戊醇混合液，混合液中氯仿∶異戊醇的體積比為24∶1；f.步驟e所得樣品室溫下離心後取液相，向液相中加入預冷的異丙醇在-20℃沉澱2h；g.步驟f所得樣品在4℃條件下離心去上清，向沉澱中加入預冷的乙醇洗滌沉澱三次，再離心去乙醇；h.將樣品在空氣中自然風乾，用TE緩衝液溶解DNA保存於-20℃。
2. —種底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法，其特徵在於提取步驟為稱取 0. 5g溼重的底泥樣品置於5mL滅菌後的離心管中，加入3mLTENP buffer,所述TENP buffer 的配方為50mM Tris，200mM EDTA， lOOmM NaCl， 0. Olg/mL PVPP， pHlO. 0，漩渦振蕩8min， 10000rpm離心5min，棄上清，在沉澱中再加3mL TENP buffer,按上述方法再洗滌兩次，最 後加3mL的PBS buffer,所述PBS buffer配方為8g NaCl，O. 2g KCl，1.44g Na2HP04，0. 24g K^P(V溶於IL水中，pH7. 4 ;將預處理之後的沉積物樣品置於-S(TC和65。C反覆凍溶三 次，向樣品中加入溶菌酶，溶菌酶的終濃度為lmg/mL，在37t:水浴lh ;向樣品中加入蛋白 酶K和十二烷基磺酸鈉，蛋白酶K的終濃度為0. 2mg/mL，十二烷基磺酸鈉的終濃度為1%， 在55t:水浴1. 5h，每10 15min輕輕倒置離心管幾次，混勻；樣品在室溫下10000rpm離 心5min，取出500iiL上清液置於一新離心管中，向其中加入等體積的酚氯仿異戊醇混 合液，酚氯仿異戊醇的體積比為25 : 24 : 1，輕輕振蕩、混勻；室溫下14000rpm離心 25min，取出400 y L水相置於一新離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇混合液，氯仿異 戊醇的體積比為24 : 1 ;室溫下14000rpm離心25min，取出300iiL水相置於一新離心管 中，加入200 ii L預冷的異丙醇，在-2(TC沉澱2h ;在4。C條件下，14000rpm離心25min，去 上清，向沉澱中加入lmL 70%濃度的冷乙醇洗滌沉澱，12000rpm離心10min，去乙醇，再用 同樣方法洗滌沉澱兩次；倒掉乙醇，在空氣中自然風乾，用50 ii L TE緩衝液溶解DNA，保存 於-20。C，所述TE緩衝液配方為10mM Tris-HCl， lmM EDTA， pH8. 0。
全文摘要
一種底泥中微生物群落結構分析的DNA提取方法，提取步驟為用TENPbuffer清洗底泥樣品，將清洗好的底泥樣品懸浮於PBS buffer中；將預處理的底泥樣品反覆凍溶後加入溶菌酶，向底泥樣品中加入蛋白酶K和十二烷基磺酸鈉，所得樣品在室溫下離心後取上清液，向其中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，所得樣品室溫下離心後取液相，向液相中加入等體積的氯仿∶異戊醇混合液，所得樣品室溫下離心後取液相，向液相中加入預冷的異丙醇；所得樣品離心去上清，向沉澱中加入預冷的乙醇洗滌沉澱三次，再離心去乙醇；將樣品在空氣中自然風乾，用TE緩衝液溶解DNA保存。
文檔編號C12N15/10GK101696410SQ200910180630
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月26日 優先權日2009年10月26日
發明者趙大勇 申請人:河海大學;