一種成人遠端肺動脈平滑肌細胞的培養方法

2023-06-30 11:01:46 2

專利名稱：一種成人遠端肺動脈平滑肌細胞的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養方法，尤其是一種成人遠端肺動脈平滑肌細胞的培養方 法，屬生物技術領域。
背景技術：
成人遠端肺動脈平滑肌細胞，是研究肺循環相關疾病、尤其是肺動脈高壓等疾病發 病機制的重要細胞材料。目前培養肺動脈平滑肌細胞的方法包括酶消化法和組織塊貼片 法。動物來源多為大鼠，大鼠與人的種屬不同細胞間差異較大，所以用成人的肺動脈平 滑肌細胞進行肺動脈高壓發病機制及相關研究的意義明顯大於用動物的細胞。但由於取 材困難，並且人類是高等進化的生物體其細胞在體外成功培養遠遠難於低等生物，同時 因為成人細胞體外生長的潛伏期明顯長於大鼠等動物所以體外成功培養更加困難。鑑於 以上原因，目前國內用於實驗研究培養的肺動脈平滑肌細胞多採用大鼠為材料；部分學 者採用引產胎兒(18周內)的肺動脈主幹進行實驗。因為胎兒細胞增殖能力強易於培養， 並且肺動脈主幹平滑肌層厚細胞易於分離，但胎兒尚未發育成熟其細胞與成人細胞有所 差異，而且肺動脈高壓的主要病理改變部位位於肺遠端動脈。所以採用胎兒肺動脈主幹 進行肺動脈高壓機制研究的實驗並不理想。而國外學者除採用動物為材料(大部分為大 鼠)夕卜；部分學者也購買成人的肺動脈平滑肌細胞株進行實驗但細胞株價格昂貴並且非 原代培養的細胞，細胞生物學特徵有所改變影響實驗結果；而少部分學者也培養成人遠 端肺動脈平滑肌細胞，但其採用的培養基為平滑肌細胞基礎培養基(SMBM)這種培養基 價格昂貴，國內一般的實驗室難以接受。綜上所述，尋找一種高效、簡便、成本低的成 人遠端肺動脈平滑肌細胞原代培養的方法成為了實驗成功的關鍵。發明內容本發明的目的是提供一種成人遠端肺動脈平滑肌細胞的培養方法。該培養方法技術 穩定，重複性好，培養的細胞形態均一，生長良好，且具有典型的平滑肌細胞的形態及 特點。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的 一種成人遠端肺動脈平滑肌細胞的培養方法，它包括以下步驟組成(1)獲取原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞從取得的成人遠端肺動脈平滑 肌層中分離遠端肺動脈平滑肌細胞，並進行原代細胞培養。以獲得原代培養的成人遠端 肺動脈平滑肌細胞；(2)獲取傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞當步驟(l)中的原代細胞長至對數生長期後，取出原代細胞用PBS (磷酸鹽緩衝液)溶液清洗後，加入0. 3 0. 5ml 0. 1 % 0.2%胰蛋白酶溶液35 37°。消化2 3分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時， 吸除胰蛋白酶溶液，加入3 5ml完全培養液，使之形成細胞懸浮液，接種於新的培養 瓶中，每3天換液一次，即完成傳代細胞培養，獲得傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌 細胞。所述的步驟(2)中的完全培養液為；胰蛋白酶溶液中含有0.1%EDTA(乙二胺四乙 酸)，所述的細胞接種密度為2 3X105個/ml，以保持細胞生長有足夠的空間、營養。步驟(2)中所述的完全培養基是含90 105U/ml青黴素、90 105mg/ral鏈黴素的 低糖DMEM(Dulbcco's Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清佔培 養基總體積的10 20%。所述的HBSS(Hank， s平衡鹽溶液)含125 135mol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、 1 1.5mol/L氯化鎂、5 15mol/LHEPES(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)、15 25 n mol/L氯化鈣、 5 15mol/L無水葡萄糖、90 105 U/ml青黴素和90 105mg/ml鏈黴素的水溶液，該溶液的ra值為7 7.5。所述的步驟(l)獲取原代培養的成人肺動脈平滑肌細胞的具體步驟為 1〉採用分次酶消化法，將分離並剝離了內外膜的血管中膜組織剪成小塊，放入HBSS 中4。C靜置20 30min，然後放入無含鈣的HBSS中室溫靜置10 20min;再將組織塊放入 離心管中加入消化液35 37。C消化35 45min，可見組織塊鬆軟、邊緣發毛。2〉吸出消化液，向離心管中加入完全培養基2 3ml，室溫放置3 5min;廣口巴氏 吸管吹打10 15次，靜置片刻使組織塊沉澱，吸出細胞懸浮液收集於另一離心管中，再 將原消化液加入原離心管中進行再次消化並按以上步驟收集細胞；將收集的細胞懸浮液 離心，棄上清液，加入完全培養基調整細胞密度並以該密度種植於培養板中，置37T、 5%0)2培養箱內靜置培養，3d後半量更換培養基；當細胞生長至對數生長期，便獲得了 原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。所述步驟2〉中依據組織消化的情況，重複收集細胞操作2 4次。 所述步驟2〉中的細胞密度是2 3 X 105細胞/ml 。所述的無鈣的HBSS溶液是含125 135mol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、l 1. 5mol/L氯化鎂、5 15raol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES) 、 5 15mol/L無水葡萄糖、 90 105 U/ml青黴素和90 105mg/ml鏈黴素的水溶液，該溶液的PH值為7 7. 5。所述的消化液含125 135raol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化 鎂、5 15mol/LHEPES、 5 15mol/L無水葡萄糖、2. 0 3. 0mg/ml1型膠原酶、9 10 U/ml 木瓜蛋白酶、1 3mg/ml牛血清白蛋白、0. 5 1. 51mmol/L DTT(l， 4-二硫代蘇糖醇)、90 105 U/ml青黴素和90 105mg/ml鏈黴素的水溶液，該溶液的ffl值為7 7. 5。步驟2〉中所述的完全培養基是含90 105U/ml青黴素、90 105mg/ml鏈黴素的 低糖DMEM(Dulbcco's Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清佔培 養基總體積的10 20%。本發明所使用的試劑均用0. 2 0. 22 " m濾膜過濾除菌。 本發明方法與現有技術相比具有以下有益效果1、 藉助顯微鏡、顯微鑷、顯微剪等精細工具突破了運用酶消化法培養出高純度的 成人遠端肺動脈平滑肌細胞的技術難關，填補了該領域空白。2、 培養方法技術穩定，重複性好，培養的細胞形態均一，生長良好。3、 獲得的細胞經過顯微鏡觀察及細胞免疫化學鑑定具有典型的遠端肺動脈平滑肌 細胞形態及特點，而且肺動脈平滑肌細胞的取材部位位於遠端肺動脈，該部分細胞對研 究肺動脈高壓發病機制更有意義。為進一步深入研究肺循環相關疾病、小血管相關疾病， 尤其是肺動脈高壓等疾病的發病機制奠定了條件，提供了豐富的材料來源。


圖1是倒置相差顯微鏡(100X)下原代培養20天成人遠端肺動脈平滑肌細胞照片； 圖2是倒置相差顯微鏡(100X)下原代培養35天成人遠端肺動脈平滑肌細胞照片； 圖3是倒置相差顯微鏡(100X)下傳代培養3天成人遠端肺動脈平滑肌細胞照片； 圖4是倒置相差顯微鏡(100X)下傳代培養7天成人遠端肺動脈平滑肌細胞照片；圖5是雷射掃描共聚焦顯微鏡(200 X )下原代培養成人遠端肺動脈平滑肌細胞經細胞免疫螢光染色照片；FITC標記的細胞漿a -Act in抗原發綠色螢光、DAPI標記的細胞 核發紅色螢光；圖6是雷射掃描共聚焦顯微鏡(600 X )下原代培養成人遠端肺動脈平滑肌細胞經細胞免疫螢光染色照片；圖7是雷射掃描共聚焦顯微鏡(200 X )下原代培養成人遠端肺動脈平滑肌細胞經細胞免疫螢光染色照片；陰性對照無加a -Actin單克隆抗體，僅用DAPI標記細胞核，可見細胞核發紅色螢光；圖8是雷射掃描共聚焦顯微鏡(IOOX)下原代培養成人遠端肺動脈平滑肌細胞經細胞免疫螢光染色照片；圖9是透射電鏡(28000 X )下原代培養成人遠端肺動脈平滑肌細胞，可見胞漿中肌絲(個)、密體(A )、密斑( ^ )。
具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。實施例一 具體步驟1、主要實驗材料 (1)試劑配製1、 HBSS:含130mol/L氯化鈉、5mol/L氯化鉀、1. 2mol/L氯化鎂、10mol/L羥乙基 哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 20ixmol/L氯化鈣、10mol/L無水葡萄糖、100 U/ml青黴素和 100mg/ml鏈黴素水溶液，該溶液的PH值為7. 4。2、 無鈣的HBSS:含130mol/L氯化鈉、5raol/L氯化鉀、1.2mol/L氯化鎂、10mol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 10mol/L無水葡萄糖、100 U/ml青黴素和100mg/ml鏈 黴素水溶液，該溶液的PH值為7.4。3、 預消化液含130mol/L氯化鈉、5mol/L氯化鉀、1. 2mol/L氯化鎂、10mol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 10mol/L無水葡萄糖、1. 5mg/ml I型膠原酶、100 U/ml 青黴素和100mg/ml鏈黴素水溶液，該溶液的TO值為7. 4。4、 消化液含130mol/L氯化鈉、5mol/L氯化鉀、1.2mol/L氯化鎂、10mol/L羥乙 基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、 10mol/L無水葡萄糖、2. 5mg/ml I型膠原酶、9. 5 U/ml木瓜 蛋白酶、2mg/ml牛血清白蛋白、l鵬ol/L DTT、 100 U/ml青黴素和100mg/ml鏈黴素水 溶液，該溶液的PH值為7.4。5、 胰蛋白酶溶液.-含0.2^(m/v)胰蛋白酶和0. lX(m/v)的EDTA。6、 完全培養基是含100/ml青黴素、100mg/ml鏈黴素的低糖DMEM和胎牛血清的 混合溶液，所述的胎牛血清佔培養基總體積的10%以上試劑經0. 22 u m濾膜過濾除菌。(2)組織來源無肺動脈高壓的病人因肺癌等疾病行肺葉切除術，取切除肺葉的遠 端肺組織。2、操作步驟(1) 獲取成人肺動脈平滑肌1) 在無菌條件下，用剪刀、鑷子切取肺葉外周組織，放入冷的HBSS中，置入冰盒 中低溫保存並儘快於4小時內送入實驗室超淨臺進行實驗。2) 將肺組織送入超淨臺內操作，用冷朋SS清洗去除血汙；置於體式顯微鏡下，用 顯微鑷和顯微剪刀於顯微鏡觀察下小心分離遠端肺動脈；在分離過程中需要不斷更換冷 HBSS;分離得到的肺動脈組織置於冷HBSS中清洗去除血液。3) 將肺動脈組織放入預消化液中25。C溫度下進行預消化10min，將血管放入冷 HBSS中以洗去預消化液，於顯微鏡觀察下用顯微鑷和顯微剪刀小心剝離血管外膜；將剝 離外膜的血管條縱向剪開，內面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內膜，留中膜平滑肌層；(2) 獲取原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞1) 將中膜組織剪成小塊約2X3mm，放入HBSS中4°C靜置30min，然後放入無含鈣 的HBSS中室溫靜置20min;2) 再將組織塊放入離心管中加入消化液37。C消化45min，可見組織塊鬆軟、邊緣發毛；3) 輕輕吸出消化液，加入完全培養基3 ml，室溫放置3min。廣口巴氏吸管吹打 10次，可見液體中有絮狀物；4) 靜置片刻使組織塊沉澱於離心管底部，吸出細胞懸浮液收集於另一離心管中。 原消化液加回組織塊中繼續消化5min,按上述步驟收集細胞。再重複5min消化操作2 次；5) 將收集的細胞懸浮液離心(800rpm， 5min)，棄上清液，加入培養基調整細胞 密度以3X 105個加1的密度種植於6孔培養板中(其中2孔放入蓋玻片，鑑定時用)。置 37°C、 5%(]02培養箱內靜置培養，10 14天後換培養基。當細胞生長至對數生長期，即 完成原代細胞培養，獲得原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。(3)獲取傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞當原代細胞長滿瓶壁後，即可傳代。屆時，用2mlPBS溶液清洗細胞2次，加入0. 5ml 0.2X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 37'C消化3分鐘，當細胞出現回縮、細胞間 隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培養液，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之形成細 胞懸浮液，以2X105個/ml的細胞密度接種於新的培養瓶中，置於37'C、 5%二氧化碳 孵箱中培養，每2天換液一次，至細胞生長至對數生長期，獲得傳代培養的成人遠端肺 動脈平滑肌細胞。3、培養結果(1) 、倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細胞呈圓形、透亮、單個均勻分布。原代 培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞潛伏期長、生長緩慢14天左右可見部分細胞貼壁、 展開細胞形態多樣，呈稜形、多角形、星形或不規則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞 核多為卵圓形多數細胞為單核，少數細胞有雙核或三核，有一個或多個核仁。20 25 天后細胞數量明顯增多呈積聚性生長(圖l)，細胞間常有突起相連。30 35天細胞生 長達到對數期生長，部分區域細胞重疊堆積生長形成"峰"，"峰"與"峰"之間細胞 層數漸少，形成"谷"。當細胞生長至融合後，細胞間相互平行排列成束，高低起伏， 形成典型的平滑肌細胞生長特徵"峰""谷"狀生長(圖2)。(2) 倒置相差顯微鏡下觀察，傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。細胞生長速 度較原代培養細胞明顯加快。傳代後1天細胞貼壁、展開可見細胞呈稜形、多角形、星形或不規則形，3天後細胞數量明顯增多呈積聚性生長，細胞間常有突起相連(圖3)。 7天後細胞生長至融合，形成典型的平滑肌細胞生長特徵"峰""谷"狀生長(圖4)。 原代培養的細胞與傳代細胞形態一致。(3) 平滑肌a-Actin抗原的免疫螢光檢測採用平滑肌a-Actin單克隆抗體對培 養的細胞進行鑑定，並採用國際常用的復染法進行染色，用MPI對所有細胞核進行染色， 保證細胞純度計算的可靠性。在雷射掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可見FITC標記的細胞 槳平滑肌a-Actin抗原發綠色螢光，DAPI標記的細胞核發紅色螢光(圖5)。高倍鏡下 觀察，平滑肌細胞胞漿中的肌絲平行於細胞長軸呈細絲狀表達(圖6)。陰性對照無加 一抗，僅檢測到DAPI標記的細胞核沒有檢測FITC標記的平滑肌a -Actin，所以僅見發 紅色螢光(圖7)。低倍鏡計算細胞純度，每張片隨機取5個視野，每個視野至少檢測 200個細胞。計算每個視野中ci-Actin表達陽性細胞佔該視野總細胞數的比例，為平滑 肌細胞純度。平均達98%以上(圖8)。(4) 透射電鏡檢測透射電鏡下觀察到遠端肺動脈平滑肌胞槳中有與細胞長軸平 行的肌絲及與其相連的有密體、密斑(圖9)，顯典型的收縮表形結構特徵。實施例二具體步驟1、主要實驗材料(1)試劑配製1、 HBSS:含125mol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、 15 ymol/L氯化鈣、15mol/L無水葡萄糖、105U/ml青黴素和105mg/ml鏈黴素水溶液，該 溶液的PH值為7.4。2、 無鈣的HBSS:含125mol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、 15mol/L無水葡萄糖、105U/ml青黴素和105mg/ral鏈黴素水溶液，該溶液的PH值為7. 4。3、 預消化液含125mol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、 15mol/L無水葡萄糖、1.3mg/ml I型膠原酶、105 U/ml青黴素和105mg/ml鏈黴素水溶 液，該溶液的PH值為7.4。4、 消化液含125raol/L氯化鈉、6mol/L氯化鉀、lmol/L氯化鎂、5mol/LHEPES、15mol/L無水葡萄糖、2.0mg/ml I型膠原酶、10 U/ml木瓜蛋白酶、lmg/ml牛血清白蛋白、0. 5mmol/L DTT、 105 U/ml青黴素和105mg/ml鏈黴素水溶液，該溶液的PH值為 7.4。5、 胰蛋白酶溶液含0. 1% (m/v)胰蛋白酶和0. 1% (m/v)EDTA。6、 培養基含90U/ml青黴素、90mg/ml鏈黴素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清)混 合溶液，所述的胎牛血清佔培養基總體積的20%。以上試劑經0. 2 P m濾膜過濾除菌。(2)組織來源無肺動脈高壓的病人因肺癌等疾病行肺葉切除，取切除的肺葉的遠 端肺組織。2、操作步驟(1)獲取成人肺動脈平滑肌1) 在無菌條件下，用剪刀、鑷子切取肺葉外周組織，放入冷的朋ss中，置入冰盒中低溫保存並儘快於4小時內送入實驗室超淨臺進行實驗。2) 將肺組織送入超淨臺內操作，用冷朋SS清洗去除血汙；置於體式顯微鏡下，用顯微鑷和顯微剪刀於顯微鏡觀察下小心分離遠端肺動脈；在分離過程中需要不斷更換冷HBSS;分離得到的肺動脈組織置於冷HBSS中清洗去除血液。3) 將肺動脈組織放入預消化液中2(TC溫度下進行預消化8min，將血管放入冷朋SS 中以洗去預消化液，於顯微鏡觀察下用顯微鑷和顯微剪刀小心剝離血管外膜；將剝離外膜的血管條縱向剪開，內面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內膜，留中膜平滑肌層； (2)獲取原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞1) 將中膜組織剪成小塊約2X3mm，放入HBSS中4°C靜置20min，無含鈣的HBSS 中室溫靜置15min;2) 再將組織塊放入離心管中加入消化液35。C消化35min，可見組織塊鬆軟、邊緣發毛；3) 輕輕吸出消化液，加入培養基2.5ml，室溫放置.4min。廣口巴氏吸管吹打數次， 可見液體中有絮狀物；4) 靜置片刻使組織塊沉澱於離心管底部，吸出細胞懸浮液收集於另一離心管中。 原消化液加回組織塊中繼續消化5min，按上述步驟收集細胞。再重複5min消化操作3次；5)將收集的細胞懸浮液離心(800rpm, 5min)，棄上清液，加入培養基調整細胞 密度以2X105個/ml的密度種植於6孔培養板中(其中2孔放入蓋玻片，鑑定時用)。置 37°C、 5%0)2培養箱內靜置培養，10 14天後換培養基。當細胞生長至對數生長期，即 完成原代細胞培養，獲得原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。(3)獲取傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞當原代細胞長滿瓶壁後，即可傳代。屆時，用2mlPBS溶液清洗細胞2次，加入0. 5ml 0. 1X(m/v)胰蛋白酶溶液(含O. 1%EDTA) 35'C消化3分鐘，當細胞出現回縮、細胞間 隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml培養液，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之形成細 胞懸浮液，以2X105個/ml的細胞密度接種於新的培養瓶中，置於37'C、 5%二氧化碳 孵箱中培養，每2天換液一次，至細胞生長至對數生長期，獲得傳代培養的成人遠端肺 動脈平滑肌細胞。3、培養結果結果與實施例一相同。 實施例三-具體步驟-1、主要實驗材料(1)試劑配製1、 HBSS:含135mol/L氯化鈉、3mol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、15mol/LHEPES、 25umol/L氯化鈣、5mol/L無水葡萄糖、90 U/ml青黴素和90mg/ml鏈黴素水溶液，該 溶液的PH值為7.4。2、 無鈣的HBSS:含135mol/L氯化鈉、3mol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、 15mol/LHEPES、 5mol/L無水葡萄糖、90 U/ml青黴素和90mg/ml鏈黴素水溶液，該溶液 的PH值為7.4。3、 預消化液含135mol/L氯化鈉、3raol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、15mol/LHEPES、 5raol/L無水葡萄糖、1.0mg/ml I型膠原酶、90U/ml青黴素和90mg/ml鏈黴素水溶液， 該溶液的PH值為7.4。4、 消化液含135mol/L氯化鈉、3mol/L氯化鉀、1. 5mol/L氯化鎂、15mol/LHEPES、 5mol/L無水葡萄糖、3. 0mg/ml I型膠原酶、9 U/ml木瓜蛋白酶、3mg/ml牛血清白蛋白、 1. 5mmol/L DTT、 90 U/ml青黴素和90mg/ml鏈黴素水溶液，該溶液的PH值為7. 4。5、 胰蛋白酶溶液含0. 15% (m/v)胰蛋白酶和0. 1% (m/v)EDTA。6、 培養基:含105U/ml青黴素、105mg/ml鏈黴素的低糖DMEM和FBS(胎牛血清) 混合溶液，所述的胎牛血清佔培養基總體積的15%。以上試劑經0. 21IX m濾膜過濾除菌。(2)組織來源無肺動脈高壓的病人因肺癌等疾病行肺葉切除，取切除的肺葉的遠 端肺組織。2、操作步驟(1) 獲取成人肺動脈平滑肌1) 在無菌條件下，用剪刀、鑷子切取肺葉外周組織，放入冷的HBSS中，置入冰盒 中低溫保存並於4小時內送入實驗室超淨臺進行實驗。2) 將肺組織送入超淨臺內操作，用冷HBSS清洗去除血汙；置於體式顯微鏡下，用 顯微鑷和顯微剪刀於顯微鏡觀察下小心分離遠端肺動脈；在分離過程中需要不斷更換冷 朋SS;分離得到的肺動脈組織置於冷HBSS中清洗去除血液。3) 將肺動脈組織放入預消化液中23。C溫度下進行預消化5min，將血管放入冷HBSS 中以洗去預消化液，於顯微鏡觀察下用顯微鑷和顯微剪刀小心剝離血管外膜；將剝離外 膜的血管條縱向剪開，內面朝上用彎頭小鑷子自上而下刮除內膜，留中膜平滑肌層；(2) 獲取原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞1) 將中膜組織剪成小塊約2X3畫，放入朋SS中4°C靜置25min，無含鈣的HBSS 中室溫靜置10min;2) 再將組織塊放入離心管中加入消化液36nC消化38min，可見組織塊鬆軟、邊緣發毛；3) 輕輕吸出消化液，加入培養基2ml，室溫放置5min。廣口巴氏吸管吹打20次， 可見液體中有絮狀物；4) 靜置片刻使組織塊沉澱於離心管底部，吸出細胞懸浮液收集於另一離心管中。原消化液加回組織塊中繼續消化5min,按上述步驟收集細胞。再重複5min消化操作4 次；5)將收集的細胞懸浮液離心(800rpm， 5min),棄上清液，加入培養基調整細胞 密度以2. 5X 15細胞/ml的密度種植於6孔培養板中(其中2孔放入蓋玻片，鑑定時用)。 置37。C、 5%0)2培養箱內靜置培養，10 14天後換培養基。當細胞生長至對數生長期， 即完成原代細胞培養，獲得原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。(3)獲取傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞當原代細胞長滿瓶壁後，即可傳代。屆時，用2mlPBS溶液清洗細胞2次，加入0. 4ml 0. 15X(m/v)胰蛋白酶溶液36t;消化3分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除 胰蛋白酶溶液，加入5ml培養液，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸浮液，以2.5 X105個Ai1的細胞密度接種於新的培養瓶中，置於37'C、 5%二氧化碳孵箱中培養，每 2天換液一次，至細胞生長至對數生長期，獲得傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。3、培養結果結果與實施例一相同。
權利要求
1、一種成人遠端肺動脈平滑肌細胞的培養方法，其特徵在於包括以下步驟(1)獲取原代培養的成人肺動脈平滑肌細胞從獲取的成人遠端肺動脈平滑肌層中分離肺動脈平滑肌細胞，並進行原代細胞培養，獲得原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞；(2)獲取傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞當步驟(1)中的原代細胞長至對數生長期後，取出原代細胞用PBS溶液清洗後，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培養液，使之形成細胞懸液，接種於新的培養瓶中，每3天換液一次，即完成傳代細胞培養，獲得傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。
2、 根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於所述的步驟(2)中的胰蛋白酶溶 液中含有O. 1%乙二胺四乙酸，所述的細胞接種密度為2 3XlS個/ml。
3、 根據權利要求1所述的培養方法，其特徵在於所述的完全培養基是含90 105U/ml青黴素、90 105mg/ml鏈黴素的低糖DMEM和胎牛血清的混合溶液，所述的胎 牛血清佔培養基總體積的10 20%。
4、 根據權利要求l所述的培養方法，其特徵在於所述的步驟(l)獲取原代培養的 成人肺動脈平滑肌細胞的具體步驟為1〉採用分次酶消化法，將分離並剝離了內外膜的血管中膜組織剪成小塊，放入HBSS 中4T靜置20 30min，然後放入無含鈣的HBSS中室溫靜置10 20min;再將組織塊放入 離心管中加入消化液35 37 。C消化35 45min;2〉吸出消化液，向離心管中加入完全培養基2 3ml，室溫放置3 5min;廣口巴氏 吸管吹打10 15次，靜置片刻使組織塊沉澱，吸出細胞懸浮液收集於另一離心管中，再 將原消化液加入原離心管中進行再次消化並按以上步驟收集細胞；將收集的細胞懸浮液 離心，棄上清液，加入完全培養基調整細胞密度並以該密度種植於培養板中，置37。C、 5%0)2培養箱內靜置培養，3d後半量更換培養基；當細胞生長至對數生長期，便獲得了 原代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。
5、 根據權利要求4所述的培養方法，其特徵在於所述步驟2〉中的細胞密度是2 3 Xl。5個/ml。
6、 根據權利要求4所述的培養方法，其特徵在於所述的朋SS溶液含125 135mol/L 氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化鎂、5 15mol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、15 25iimol/L氯化轉、5 15mol/L無水葡萄糖、90 105 U/ml青黴素和90 105mg/ml鏈黴素的水溶液，該溶液的ra值為7 7.5。
7、 根據權利要求4所述的培養方法，其特徵在於所述的無鈣的HBSS溶液是含 125 135mol/L氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化鎂、5 15mol/L羥乙基 哌嗪乙硫磺酸、5 15mol/L無水葡萄糖、90 105 U/ml青黴素和90 105mg/ral鏈黴素 的水溶液，該溶液的ra值為7 7.5。
8、 根據權利要求4所述的培養方法，其特徵在於所述的消化液* 125 135mol/L 氯化鈉、3 6mol/L氯化鉀、1 1. 5mol/L氯化鎂、5 15mol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸、5 15mol/L無水葡萄糖、2. 0 3. 0mg/ml1型膠原酶、9 10 U/ml木瓜蛋白酶、1 3mg/ml 牛血清白蛋白、0. 5 1. 51腿ol/L 1,4-二硫代蘇糖醇、90 105 U/ml青黴素和90 105mg/ml鏈黴素的水溶液，該溶液的ra值為7 7. 5。
9、 根據權利要求4所述的培養方法，其特徵在於所述的完全培養基是含90 105U/ml青黴素、90 105mg/ml鏈黴素的低糖DMEM和胎牛血清的混合溶液，所述的胎 牛血清佔培養基總體積的10 20%。
10、 根據權利要求4所述的培養方法，其特徵在於所述步驟2〉中依據組織消化的 情況，重複收集細胞操作2 4次。
全文摘要
本發明公開了一種成人遠端肺動脈平滑肌細胞的培養方法，包括以下步驟(1)從獲取的成人遠端肺動脈平滑肌層中分離肺動脈平滑肌細胞，並進行原代細胞培養；(2)獲取傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞當步驟(1)中的原代細胞長至對數生長期後，取出原代細胞用PBS溶液清洗後，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培養液，使之形成細胞懸液，接種於新的培養瓶中，每3天換液一次，即完成傳代細胞培養，獲得傳代培養的成人遠端肺動脈平滑肌細胞。該培養方法技術穩定，重複性好，培養的細胞形態均一，生長良好，且具有典型的平滑肌細胞的形態及特點。
文檔編號C12N5/08GK101250500SQ20071003301
公開日2008年8月27日 申請日期2007年12月29日 優先權日2007年12月29日
發明者冉丕鑫, 盧文菊, 彭公永, 冰 李, 李曉巖, 城 洪, 健 王, 胡錦興 申請人:廣州醫學院