Pi3－k抑制劑的新用途及組合物的製作方法

2023-05-26 12:54:36 2

專利名稱：Pi3－k抑制劑的新用途及組合物的製作方法
技術領域：
本發明發現PI3-K抑制劑、MAPK抑制劑可以明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能。本發明還發現PI3-K抑制劑、MAPK抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可以明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。本發明提供了用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病的方法及組合物。具體說，本發明提供了PI3K抑制劑、MAPK抑制劑用於預防、治療或延緩哺乳動物心臟病方法及組合物，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物施用有效量的PI3K抑制劑、MAPK抑制劑或與其它哺乳動物心臟病治療藥物聯合使用，以預防、治療或延緩所述心臟病。
背景技術：
有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，屬絲氨酸/蘇氨酸殘基激酶，廣泛存在於真核細胞。MAPK超家族蛋白質的磷酸化-去磷酸化狀態對生命過程起重要的調節作用。研究表明MAPK信號傳導途徑對細胞的生長、增殖、分裂、分化、遷移及死亡、炎性細胞因子和多種類型的細胞應激信號起重要的作用(Cobb，M.H.Prog.Biophys.Mol.Biol.71，479-500.1999；Garrington，T.P.and Johnson，G.L.Curr.Opin.Cell Biol.11，211-218，1999；Lewis，T.S.et al.Adv.Cancer Res.74，49-139，1998；Schaeffer，H.J.and Weber，M.J.Mol.Cell Biol.19，2435-2444，1999；Whitmarsh，A.J.andDavis，R.J.Trends Biochem.Sci.23，481-485，1998)。WO0039075發現MAPK信號傳導途徑與心肌細胞分化、心肌細胞中的肌原纖維節、細胞骨架結構、或心肌細胞間連接的重新構建有關。但抑制MAPK信號傳導途徑對心肌及心功能的影響未見報告。
磷脂醯肌醇3-激酶(phosphotidylinositol 3-kinase，PI3K)包括p85及110KD構成的異源二聚體複合物。PI3K催化磷脂醯肌醇(phosphotidylinositol，PI)形成3，4-二磷酸磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol 3，4 bisphosphate，PI(3，4)P2)和3，4，5-三磷酸肌醇(phosphatidylinositol 3，4，5 trisphosphate，PI(3，4，5)P3)，這兩種磷酸肌醇可作為胞內信號蛋白從而引發相應的生物學效應。在PI3K細胞信號傳導中胞外信號分子與細胞表面G蛋白耦聯型受體結合，激活質膜上的磷脂酶C(PLC-β)，使質膜上4，5-二磷酸磷脂醯肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二醯基甘油(DG)兩個第二信使。IP3與內質網上的IP3配體門鈣通道結合，開啟鈣通道，使胞內Ca2+濃度升高，激活各類依賴鈣離子的蛋白。因此，IP3在細胞內的鈣調節起重要的作用。DG結合於質膜上，可活化與質膜結合的蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)，PKC以非活性形式分布於細胞溶質中，引發相應的生物學效應如細胞分泌、肌肉收縮、細胞增殖和分化等(Kazlauskas and Cooper Cell 581121.1989；Coughlin et al.Science 243，1191.1989；Whitman et al Nature 332，644.1988；Kaplan et al.Cell501021.1987；Fukui and Hanafusa Mol.Cell.Biol.9，1651.1989；Carpenter et al.J.Biol.Chem.265，19704.1990)。Kodama研究發現，由gp130介導的PI3K信號傳導與心肌肥大有關(Kodama F，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.279，1635.2000)。
許多疾病與細胞信號傳導異常有關，原因可能是因為信息分子異常、受體信號傳導異常、G蛋白信號傳導異常、細胞內信號傳導異常或多環節細胞信號傳導異常引起。同時，由於人體內不同的細胞信號途徑之間存在廣泛交叉，不同刺激可引起相同的病理反應或疾病。例如心肌肥大的發病過程中，心肌負荷過重引起的機械刺激，神經體液調節產生的去甲腎上腺素、血管緊張素等，可通過不同的信號傳導蛋白的傳遞，最終引起相同的病理反應-心肌肥大。而同一刺激也可作用於不同的受體，引起不同的反應導致不同的病理反應。因此針對細胞傳導異常的不同原因，如調整細胞外信息分子的水平，或針對受體的過度激活或不足，可分別採用受體抑制劑或受體激動劑調節受體的結構和功能達到治療目的。
本發明發現通過抑制PI3-K信號傳導途徑改善心力衰竭病情和預後是有益的。本發明還發現PI3-K抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可以明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。從而提供了PI3-K抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力衰竭的新用途及組合物。
本發明發現通過抑制MAPK信號傳導途徑改善心力衰竭病情和預後是有益的。本發明還發現MAPK抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可以明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。從而提供了MAPK抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力衰竭的新用途及組合物。
發明概述本發明發現PI3-K抑制劑可明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，可提高哺乳動物EF值。本發明還發現PI3-K抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。本發明提供了PI3-K抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力衰竭的新用途及組合物。本發明涉及PI3-K抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力哀竭藥物的組合物。
本發明發現MAPK抑制劑可明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，可提高哺乳動物EF值。本發明還發現MAPK抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。本發明提供了MAPK抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力衰竭的新用途及組合物。本發明涉及MAPK抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力衰竭藥物的組合物。


圖1.Wortmannin對大鼠左心室細胞PI3K信號傳導的抑制選90-100g的雄性SD大鼠，尾靜脈注射0.4mg/Kg的Wortmannin，在Wortmannin注射後15、30、60、120min分別處死大鼠，將大鼠左心室快速取出並剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％TritonX-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonylfluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中勻漿。測定蛋白質濃度後直接電泳，經過SDS-PAGE，所有蛋白被電轉到PVDF膜上。經過牛奶或者BSA封閉，PVDF膜與抗體結合併最終顯影。抗Akt，抗p-Akt抗體購自Cell Signaling Technology。
Wortmannin可以降低大鼠左心室的AKT的磷酸化水平。注射Wortmannin30分鐘時，對Akt的抑制作用最強；注射Wortmannin 2小時後，抑制作用明顯減弱。
圖2.U0126對大鼠左心室細胞MAPK信號傳導的抑制選90-100g的雄性SD大鼠，尾靜脈注射0.8mg/Kg的U0126，在U0126注射後15、30、60、120min分別處死大鼠，將大鼠左心室快速取出並剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Triton X-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonyl fluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中勻漿。測定蛋白質濃度後直接電泳，經過SDS-PAGE，所有蛋白被電轉到PVDF膜上。經過牛奶或者BSA封閉，PVDF膜與抗體結合併最終顯影。抗erk1、抗p-erk抗體購自Santa Cruz Biotechnology。
U0126可以降低大鼠左心室的Erk1、2的磷酸化水平。注射U0126 15分鐘時對Erk1、2的抑制作用最強。注射U0126 30分鐘後抑制作用開始減弱。
圖3.U0126、Wortmannin及rhNRG分別與U0126、Wortmannin聯合用藥對心力衰竭大鼠的心功能改善作用。
用藥5天進行心超檢測的結果顯示，NRG實驗組(D+N組)、U0126實驗組(U組)、U0126+NRG實驗組(U+N組)、Wortmannin實驗組(W組)、Wortmannin+NRG實驗組(W+N組)在用藥後較用藥前的EF值，兩者比較具有顯著性差異(P＜0.01)。用藥前NRG實驗組(D+N組)、U0126實驗組(U組)、U0126+NRG實驗組(U+N組)、Wortmannin實驗組(W組)、Wortmannin+NRG實驗組(W+N組)EF值分別為53.46±4.27％、54.43±3.75％、53.93±2.53％、53.93±2.71％、52.93±3.77％；用藥後NRG實驗組(D+N組)、U0126實驗組(U組)、U0126+NRG實驗組(U+N組)、Wortmannin實驗組(W組)、Wortmannin+NRG實驗組(W+N組)EF值分別為66.6±10.74％、71.17±12.75％、65.17±8.97％、67.46±5.56％、66.08±9.77％。
實施發明方式為清楚公開發明內容而不是限制發明，分以下小節詳細說明。
A.釋義除另有定義，這裡使用的所有科技術語與本發明所屬技術領域的普通技術人員理解含義相同。所有專利文獻、專利申請文獻、公開的專利文獻和其他出版物均作為參考。如本節闡述的定義與上述參考文獻所述的定義不一致或相反時，以本節闡述的定義為準。
在此所用「一個」的意思是「至少一個」或「一個或多於一個」。
在此所用「用於治療特定疾病的化合物有效用量」是指足以改善或以某種方式減少與該疾病相關症狀的用量。該用量可為單一劑量或根據療程確定的有效劑量。這個用量可治癒疾病，但通常是減輕病情。為了減輕病情，可能需要連續服用。
在此所用「治療」的意思是使任何臨床症狀、不適或疾病的症狀得到改善或有益改變的方法。治療也包括含藥物有效成分的任何藥物的使用。
在此，通過服用特定的藥物有效成分治療達到特定不適症狀「改善」是指任何的減輕，不管是永久還是暫時，持續還是短暫，可歸於或與服用藥物有效成分有關係。
在此所用「重組方法生產」是指用重組核酸方法的生產方法。本方法是以眾所周知的用克隆核酸表達其所編碼蛋白質的分子生物學方法。
在此所用「互補的」當是指兩個核酸分子的核苷酸序列能雜交，優選是低於25％，更優選是低於15％，更加優選是低於5％，最優選是在相對核苷酸處不存在錯誤配對。優選在嚴格條件下，這兩個分子雜交。
在此所用決定錯誤配對百分率的「雜交的嚴格性」規定如下高嚴格性0.1x SSPE，0.1％SDS，65℃；中等嚴格性0.2x SSPE，0.1％SDS，50℃；(也指適度嚴格性)低嚴格性1.0x SSPE，0.1％SDS，50℃；應理解為使用對等的緩衝液、鹽和溫度，可以獲得相當的嚴格性。
在此所用「載體(或質粒)」是指用於將外源DNA導入細胞進行表達或複製的不連續元件。本領域技術人員熟知選擇及使用這些載體。表達載體包括DNA表達載體，該載體有效地與調控序列，例如啟動子區域連接在一起調控該DNA片段的表達。所以，一個表達載體是指重組DNA或RNA構建物，例如質粒、噬菌體、重組病毒或其它載體，它們一旦導入適當的宿主細胞中，使克隆的DNA表達。本領域技術人員十分清楚適當的表達載體、能在真核細胞和(或)原核細胞中複製的載體以及保持游離態或整合進宿主細胞基因組的載體。
在此所用「啟動子區域或啟動子元件」是指調控DNA或RNA轉錄並與其有效連接的DNA片段或RNA片段。啟動子區域是RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始的特定序列，這部分啟動子區域特指啟動子。同時，啟動子區域還包括調控RNA聚合酶識別、結合和轉錄起始活動的序列。這些序列可以對順式作用因子或對反式作用因子作出響應。依據調控性質，啟動子可以是組成型或調控型。用於原核生物典型的啟動子包括噬菌體T7和T3啟動子和類似的啟動子。
在此所用「有效連接和有效結合」是指效應和調控核苷酸序列如啟動子、增強子、轉錄和翻譯終止位點和其他信號序列與DNA間的功能關係。例如，DNA和啟動子的有效連接是指DNA和啟動子間物質和功能關係。專一識別、結合和轉錄該段DNA的RNA聚合酶能夠從啟動子處起始該段DNA轉錄。為便於優化表達和(或)體外轉錄，有必要去掉、增加或改變克隆的5′不翻譯部分，以便消除多餘、潛在不適當替代性翻譯(如起始)密碼子或其他不論是在轉錄或翻譯水平上幹擾或減少表達的序列。其他方法還有將核糖體結合位點共有序列緊接起始密碼子的5′插入，可以增強表達(參見，Kozak.生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)1991；26619867-19870)。這一改正的願望或需要可由經驗來決定。
在此所用「有絲分裂原活化蛋白激酶」(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，屬絲氨酸/蘇氨酸殘基激酶，廣泛存在於真核細胞。MAPK超家族蛋白質的磷酸化-去磷酸化狀態對生命過程起重要的調節作用。研究表明MAPK信號傳導途徑對細胞的生長、增殖、分裂、分化、遷移及死亡、炎性細胞因子和多種類型的細胞應激信號起重要的作用(Cobb，M.H.Prog.Biophys.Mol.Biol.71，479-500.1999；Garrington，T.P.and Johnson，G.L..Curr.Opin.Cell Biol.11，211-218，1999；Lewis，T.S.et al.Adv.Cancer Res.74，49-139，1998；Schaeffer，H.J.and Weber，M.J.Mol.Cell Biol.19，2435-2444，1999；Whitmarsh，A.J.andDavis，R.J.Trends Biochem.Sci.23，481-485，1998)。
在此所用「磷脂醯肌醇3-激酶」(phosphotidylinositol 3-kinase，PI3K)是包括p85及110KD構成的異源二聚體複合物。PI3K催化磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol，PI)形成PI(3，4)P2和PI(3，4，5)P3，這兩種磷酸肌醇可作為胞內信號蛋白從而引發相應的生物學效應。在PI3K細胞信號傳導中胞外信號分子與細胞表面G蛋白耦聯型受體結合，激活質膜上的磷脂酶C(PLC-β)，使質膜上4，5-二磷酸磷脂醯肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二醯基甘油(DG)兩個第二信使。IP3與內質網上的IP3配體門鈣通道結合，開啟鈣通道，使胞內Ca2+濃度升高，激活各類依賴鈣離子的蛋白。因此，IP3在細胞內鈣調節起轉運重要的作用(Kazlauskas and Cooper Cell 581121.1989；Coughlin et al.Science 243，1191.1989；Whitman et al Nature 332，644.1988；Kaplan et al.Cell 501021.1987；Fukui and Hanafusa Mol.Cell.Biol.9，1651.1989；Carpenter et al.J.Biol.Chem.265，19704.1990)。
在此所用「神經調節蛋白」或「neuregulin」或「NRG」的意思是指與ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3結合，可以激活上述受體的蛋白質或多肽。它能激活上述受體，並調控多種生物反應如刺激乳房癌細胞分化和乳蛋白的分泌；誘導神經脊細胞分化為Schwann細胞；刺激骨胳肌細胞內乙醯膽鹼受體的合成；以及促進心肌細胞成活和DNA合成。常見神經調節蛋白可由例如NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)編碼的蛋白質或多肽。由於在多肽的非功能區域的個別胺基酸的改變對其功能無影響(see，e.g.，Watson等.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，TheBejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)，這裡，NRG也包括保留NRG保守胺基酸序列，但治療作用不變的NRG異構體及突變體。rhNRG可通過基因工程方法獲得，本領域技術人員熟知該方法。
在此所用「EGF樣結構域」或「epidermal growth factor-like domain」或「EGF-like domain」是指與ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3結合，具有與EGF受體結合區域相同結構的多肽結構，常見「EGF樣結構域」可由NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)編碼。關於EGF樣結構域參見WO00/64400，Holmes等.，Science，2561205-1210(1992)；U.S.Patent Nos.5,530,109and5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，131061-1067(1998)；Chang等，Nature，387509-512(1997)；Carraway等，Nature，387512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochern.，122675-680(1997)及WO 97/09425。
B.PI3-K抑制劑用於治療、預防或延遲哺乳動物心臟病的方法及組合物本發明發現PI3-K抑制劑可提高哺乳動物EF值，明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能。本發明還發現PI3-K抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。本發明提供了PI3-K抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力衰竭的新用途及組合物。
PI3K催化PI的肌醇磷酸化形成PI3P(Whitman et al.Nature，(1988)322664-646)；PI3K還可催化PI形成PI(3，4)P2和PI(3，4，5)P3(Auger et al.Cell，(1989)57167-175)，PI3-K抑制劑是降低、阻斷上述過程的物質。
PI3-K抑制劑包括但不僅限於渥曼青黴素(Wortmannin)、渥曼青黴素類似物、Ly294002、Ly294002類似物。本領域技術人員熟知PI3-K抑制劑，其中渥曼青黴素、Ly294002是PI3-K的專一性的抑制劑。關於Ly294002的化學性質可參閱J.Biol.，Chem.，2695241-5248，1994。Ly294002是櫟精的衍生物，與ATP競爭性結合PI3-K，是PI3-K強抑制劑。PI3-K抑制劑包括但不僅限於渥曼青黴素的醇或酯的衍生物，如在11位、17位或在11、17位同時取代的渥曼青黴素衍生物(參見U.S.Pat.No.5,480,906)。
PI3-K抑制劑包括但不僅限於綠膠黴素(viridin)、綠膠醇(viridiol)、脫甲基綠膠黴素(demethoxyviridin)、脫甲基綠膠醇(demethoxyviridiol)(參見，U.S.Pat.No.5,276,167)。當分離、純化綠膠黴素(viridin)、綠膠醇(viridiol)、脫甲基綠膠黴素(demethoxyviridin)、脫甲基綠膠醇(demethoxyviridiol)或其它的PI3-K抑制劑時，本領域技術人員可通過下述方法獲得其類似物或衍生物，如在U.S.Pat.No.5,276,167公式I所說明的方法，還可參見Grove etal.J.Chem.Soc.，(1965)June3803-3811，Hanson et al.J.Chem.Soc.PerkinTrans.I1311-1314(1985).Aldridge et al.J.Chem.Soc.Perkin Trans.I943-945(1975)，及Blight et al.J.Chem.Soc.Perkin Trans I1317-1322(1975)。
PI3-K抑制劑還可通過高通量藥物篩選方法獲得。利用細胞模型和已有的高通量藥物篩選設備對組合化學自動合成所提供的小分子化合物及天然藥物分離提純物進行高通量、並行多靶點篩選，從而得到每一個被篩選對象的生物活性指紋譜，並通過利用生物信息學和化學信息學的於段從中挑選出有希望的候選化合物/分離提純物，再利用生物晶片技術進行系統的跟蹤分析，對被篩選對象進行進一步的評價。在本領域技術人員熟知高通量藥物篩選方法，化合物庫包括但不限於如多肽(參見，U.S.Pat.No.5,010,175，Furka Int.J.Pept.Prot.Res.，(1991)37487-493，Houghton et al.Nature，(1991)35484-88)。
本發明能用於任何哺乳動物的預防、治療或延緩心臟病，例如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類。本發明的方法優選用於人類心臟病的預防、治療或延緩。
本發明能用於哺乳動物心臟病的預防、治療或延緩，例如，心肌病、缺血性心臟病、心肌炎、肥大型心肌病、心肌梗塞、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心力衰竭的預防、治療或延緩。本發明能用於由於高血壓、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌炎、肥大型心肌病、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心律不齊、家族肥大型心肌病、自發擴張型心肌病和心臟毒性藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因化療藥物、抗精神病藥物、抗抑鬱病藥物、幹擾素-α、白細胞介素-2、吐根鹼及herceptin等心臟毒性藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因ADM、柔紅黴素、絲裂黴素、博萊黴素、環磷醯胺、氟脲嘧啶、放線菌素D、長春新鹼等化療藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪等抗抑鬱病藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因氯丙咪嗪，阿米替林，多慮平等抗精神病藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
PI3K抑制劑能夠單獨使用。優選的方式是，PI3K抑制劑與藥物治療上可接受的載體或者賦形劑共同使用。任何合適的藥物治療可以接受的載體或者賦形劑能用於本方法中(參見，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(編者)，Mack出版社，1997年4月)。
PI3K抑制劑能夠與其它預防、治療或延緩心臟病的藥物聯合使用。任何適當的可以預防、治療或延緩心臟病的藥物能用於該組合物中。組合物包括PI3K抑制劑以及有效量的預防或治療心臟病的藥物組成。例如小劑量的阿司匹林或雙嘧達莫。預防、治療或延緩心心臟病和臨床症狀及其併發症的藥物可以是溶血栓藥如尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(SCUPA)或甲氧苯基化纖溶酶原鏈激酶複合物(APSAC)等。心律失常治療藥物如利多卡因、美西律、普魯卡因醯胺、溴苄銨、丙吡胺、妥卡尼、阿託品或奎尼丁腎上腺皮質激素、異丙腎上腺素或麻黃素等。血管收縮藥多巴胺、多巴酚丁胺、間羥胺(阿拉明)或去甲腎上腺素等。血管擴張藥可選用硝酸甘油、硝普鈉、酚妥拉明、二硝酸異山梨醇、硝苯地平或東莨菪鹼等。β阻滯劑如阿替洛爾、美託洛爾、普萘洛爾、索他洛爾或塞嗎洛爾等。ACEI如卡託普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利等。鈣離子拮抗劑如硝苯地平、維拉帕米、阿羅地平或地爾硫等。促進心肌代謝藥物維生素C、輔酶A、肌苷酸鈉、細胞色素C、維生素B6等。以及洋地黃類、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等藥物。透明質酸酶、嗎啡或哌替啶和利尿劑糖皮質激素如甲基強的松龍。抗凝劑如肝素、華法林或雙香豆素或苯茚二酮可以用於該組合物中。優選方式，該組合物包括PI3K抑制劑以及有效量的預防或治療心臟病的藥物rhNRG組成，NRG包括神經調節蛋白或含EGF樣結構域的神經調節蛋白功能片段。優選方式是rhNRG177-237。
C.MAPK抑制劑用於治療、預防或延遲哺乳動物心臟病的方法及組合物本發明發現MAPK抑制劑可提高哺乳動物EF值，明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能。本發明還發現MAPK抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。本發明提供了MAPK抑制劑在用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病、心力衰竭的新用途及組合物。
MAPK抑制劑包括但不僅限於PD098059、U0126、SB203580、FR167653、SCIO-469。本領域技術人員熟知MAPK抑制劑，優選MAPK抑制劑是PD098059、U0126。
本發明能用於任何哺乳動物的預防、治療或延緩心臟病，例如小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、奶牛、牛、綿羊、山羊、馬、猴子和其它非人的靈長類。本發明的方法優選用於人類心臟病的預防、治療或延緩。
本發明能用於哺乳動物心臟病的預防、治療或延緩，例如，心肌病、缺血性心臟病、心肌炎、肥大型心肌病、心肌梗塞、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心力衰竭的預防、治療或延緩。本發明能用於由於高血壓、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌炎、肥大型心肌病、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心律不齊、家族肥大型心肌病、自發擴張型心肌病和心臟毒性藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因化療藥物、抗精神病藥物、抗抑鬱病藥物、幹擾素-α、白細胞介素-2、吐根鹼及herceptin等心臟毒性藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因ADM、柔紅黴素、絲裂黴素、博萊黴素、環磷醯胺、氟脲嘧啶、放線菌素D、長春新鹼等化療藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪等抗抑鬱病藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
本發明能用於因氯丙咪嗪，阿米替林，多慮平等抗精神病藥物所導致的哺乳動物心力衰竭的預防、治療或延緩。
MAPK抑制劑能夠單獨使用。優選的方式是，MAPK抑制劑與藥物治療上可接受的載體或者賦形劑共同使用。任何合適的藥物治療可以接受的載體或者賦形劑能用於本方法中(參見，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(編者)，Mack出版社，1997年4月)。
MAPK抑制劑能夠與其它預防、治療或延緩心臟病的藥物聯合使用。任何適當的可以預防、治療或延緩心臟病的藥物能用於該組合物中。組合物包括MAPK抑制劑以及有效量的預防或治療心臟病的藥物組成。例如小劑量的阿司匹林或雙嘧達莫。預防、治療或延緩心臟病和臨床症狀及其併發症的藥物，可以是溶血栓藥如尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(SCUPA)或甲氧苯基化纖溶酶原鏈激酶複合物(APSAC)等。心律失常治療藥物如利多卡因、美西律、普魯卡因醯胺、溴苄銨、丙吡胺、妥卡尼、阿託品或奎尼丁腎上腺皮質激素、異丙腎上腺素或麻黃素等。血管收縮藥多巴胺、多巴酚丁胺、間羥胺(阿拉明)或去甲腎上腺素等。血管擴張藥可選用硝酸甘油、硝普鈉、酚妥拉明、二硝酸異山梨醇、硝苯地平或東莨菪鹼等。β阻滯劑如阿替洛爾、美託洛爾、普萘洛爾、索他洛爾或塞嗎洛爾等。ACEI如卡託普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利等。鈣離子拮抗劑如硝苯地平、維拉帕米、阿羅地平或地爾硫等。促進心肌代謝藥物維生素C、輔酶A、肌苷酸鈉、細胞色素C、維生素B6等。以及洋地黃類、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等藥物。透明質酸酶、嗎啡或哌替啶和利尿劑糖皮質激素如甲基強的松龍。抗凝劑如肝素、華法林或雙香豆素或苯茚二酮可以用於該組合物中。優選方式，該組合物包括MAPK抑制劑以及有效量的預防或治療心臟病的藥物rhNRG組成，，NRG包括神經調節蛋白或含EGF樣結構域的神經調節蛋白功能片段。優選是rhNRG177-237。
D.MAPK抑制劑、PI3K抑制劑使用方法、劑量以及給藥途徑MAPK抑制劑、PI3K抑制劑使用配方、劑量和給藥途徑，尤其作為藥物組合物時，可根據本技術領域所知的方法加以確定。(參見，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro，Mack出版社，1997年4月；治療用肽和蛋白配方、加工和傳遞系統(Therapeutic Peptides and ProteinsFormulation，Processing，and DeliverySystems)，Banga，1999；肽和蛋白製藥配方的發展(Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins)，Hovgaard和Frkjr(編者)，Taylor Francis公司，2000；脂質體的醫學應用(Medical Applications of Liposomes)，Lasic和Papahadjopoulos(編者)，Elsevier Science，1998；基因治療教程(Textbook of Gene Therapy)，Jain，Hogrefe Huber出版社，1998；腺病毒基因治療的基本生物學(AdenovirusesBasic Biology to Gene Therapy)，15卷，Seth，Landes Bioscience，1999；生物製藥的藥物設計和發展(BiopharmaceuticalDrug Design and Development)，Wu-Pong和Rojanasakul(編者)，Humana出版社，1999；治療學上的血管發生從基礎科學到臨床(Therapeutic AngiogenesisFrom Basic Science to the Clinic)，28卷，Dole等(編者)，Springer-Verlag NewYork，1999)。MAPK抑制劑、PI3K抑制劑，可配製成用於口服，直腸給藥，局部用藥，吸入法用藥，口腔用藥(例如舌下)，注射用藥(例如，皮下的，肌內的，皮內的，靜脈的)，經皮給藥或其他適合的給藥途徑。在任何給定的情況下，最合適的給藥途徑將取決於要治療情況的性質和嚴重程度以及所用的特定MAPK抑制劑、PI3K抑制劑的性質。
MAPK抑制劑、PI3K抑制劑能夠單獨使用。優選的方式是，MAPK抑制劑、PI3K抑制劑與藥物治療上可接受的載體或者賦形劑共同使用。任何合適的藥物治療可以接受的載體或者賦形劑能用於本方法中。(參見，雷明頓藥劑學科學與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(編者)，Mack出版社，1997年4月)。
本方法能單獨使用。或者，本方法能與其它疾病治療方法聯合使用。本方法也能與其它疾病治療方法聯合使用例如例如預防、治療或延緩心臟病和臨床症狀及其併發症的藥物可以是溶血栓藥如尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(SCUPA)、甲氧苯基化纖溶酶原鏈激酶複合物(APSAC)等。預防、治療或延緩心臟病和臨床症狀及其併發症的藥物可以是心律失常治療藥物如利多卡因、美西律、普魯卡因醯胺、溴苄銨、丙吡胺、妥卡尼、阿託品或奎尼丁腎上腺皮質激素、異丙腎上腺素或麻黃素等。血管收縮藥多巴胺、多巴酚丁胺、間羥胺(阿拉明)、去甲腎上腺素等。血管擴張藥可選用硝酸甘油、硝普鈉、酚妥拉明、二硝酸異山梨醇、硝苯地平或東莨菪鹼等。β阻滯劑如阿替洛爾、美託洛爾、普萘洛爾、索他洛爾或塞嗎洛爾等。預防、治療或延緩心臟病和臨床症狀及其併發症的藥物可以是ACEI如卡託普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利或喹那普利等。鈣離子拮抗劑如硝苯地平、維拉帕米、阿羅地平或地爾硫等。促進心肌代謝藥物維生素C、輔酶A、肌苷酸鈉、細胞色素C、維生素B6等。以及洋地黃類、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等藥物。透明質酸酶、嗎啡或哌替啶和利尿劑糖皮質激素如甲基強的松龍。抗凝劑如肝素、華法林或雙香豆素或苯茚二酮等其它心臟病治療藥劑。其它心臟病治療或藥劑能夠用於MAPK抑制劑、PI3K抑制劑的之前、之中或之後使用。舉實施例而言，MAPK抑制劑、PI3K抑制劑可與心臟病藥劑共同使用。
根據本發明，無論單獨或是與其它藥劑、載體或賦形劑聯合使用的MAPK抑制劑、PI3K抑制劑，可以系統用於任何的給藥途徑，諸如海綿體內注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、皮內注射、口服或局部用藥。本方法可以使用以單位劑量形式、一次用量針劑或多劑量容器的含有添加的防腐劑的注射製劑。該配方可以採用油質或水質賦形劑中的懸濁液，溶液或乳濁液形式並且可以包含配方試劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。活性成分也可以是粉狀，以便在使用前與適合的載體、無菌不含熱源的水或其他溶劑混合。本發明的局部用藥可以採用泡沫狀物、凝膠體、霜、藥膏、透皮藥膏或軟膏。
可能用於本發明的藥物治療可接受的組合物和方法包含在，但不僅僅限於美國專利Nos.5,736,154；6,197,801B1；5,741,511；5,886,039；5,941,868；6,258,374B1和5,686,102中。
治療或預防中藥物治療劑量的大小將隨治療的狀況的嚴重程度和給藥途徑變化。劑量和劑量頻率也將根據病人自身年齡、體重、疾病狀況和反應而變化。
主治醫生應當知道怎樣和何時由於藥物毒性或不利的效應終止、中斷或將治療調整到低劑量。相反地，醫生應當知道怎樣和何時由於臨床效應不足(排除了毒性副效應)，將治療調整到高水平。
可以使用任何適合的給藥途徑。劑形包括片劑、錠劑、扁囊劑、分散體、懸濁液、溶液、膠囊、藥膏和類似形態(參考，雷明頓氏藥物治療科學)。
在實際應用中，無論單獨或是與其它藥劑聯合使用的MAPK抑制劑、PI3K抑制劑，可以根據傳統藥物治療混合技術作為活性成分與諸如β-環糊精和2-羥基-丙基-β-環糊精的藥物治療載體或賦形劑形成緊密添加混合物。載體根據期望使用方式，局部或注射用藥，採取多種配製形式。在製備用於注射劑的組合物時，例如靜脈注射或靜脈灌輸，相同的製藥介質可以使用，水、乙二醇、油、緩衝液、糖、防腐劑、脂質體和其他具有本技術領域技能的人所知的介質。注射組合物的實例包括，但不限於，5％w/v的葡萄糖、正常生理鹽溶液或其他溶液。
實施例1.Wortmannin對大鼠左心室細胞PI3K信號傳導的抑制方法選90-100g的雄性SD大鼠，尾靜脈注射0.4mg/Kg的Wortmannin，在Wortmannin注射後15、30、60、120min分別處死大鼠，將大鼠左心室快速取出並剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％TritonX-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonylfluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中勻漿。測定蛋白質濃度後直接電泳，經過SDS-PAGE，所有蛋白被電轉到PVDF膜上。經過牛奶或者BSA封閉，PVDF膜與抗體結合併最終顯影。Western blot參照Kodama F，Circ.Res.81656-663，1997方法。抗Akt，抗p-Akt抗體購自CellSignaling Technology。
結果Wortmannin可以降低大鼠左心室的Akt的磷酸化水平。注射Wortmannin30分鐘時，對Akt的抑制作用最強；注射Wortmannin 2小時後，抑制作用明顯減弱。
實施例2.U0126對大鼠左心室細胞MAPK信號傳導的抑制方法選90-100g的雄性SD大鼠，尾靜脈注射0.8mg/Kg的U0126，在U0126注射後15、30、60、120min分別處死大鼠，將大鼠左心室快速取出並剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Triton X-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonyl fluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中勻漿。測定蛋白質濃度後直接電泳，經過SDS-PAGE，所有蛋白被電轉到PVDF膜上。經過牛奶或者BSA封閉，PVDF膜與抗體結合併最終顯影。Western blot參照Kodama F，Circ.Res.81656-663，1997方法。抗erk1、抗p-erk抗體購自Santa CruzBiotechnology。
結果U0126可以降低大鼠左心室的Erk1、2的磷酸化水平。注射U0126 15分鐘時對Erk1、2的抑制作用最強。注射U0126 30分鐘後抑制作用開始減弱。
實施例3.U0126、Wortmannin及rhNRG分別與U0126、Wortmannin聯合用藥對心力衰竭大鼠的心功能改善作用方法大鼠腹腔注射氯胺酮100mg/kg。麻醉後，仰臥固定於鼠板，頸部及胸部去毛後用新潔爾滅消毒。頸部做正中切口，鈍性分離頸前肌肉找到氣管，用18G動靜脈留置針於第3-5氣管軟骨間穿入氣管後，退山針芯，將塑料套管推入氣管內1-2cm，固定後接小動物呼吸機(潮氣量約20ml，頻率80次/分鐘)。胸部左前皮膚切開後，鈍性分離胸部肌肉，暴露第4、5肋骨，用彎頭紋式止血鉗從肋間穿透胸壁，分離肋骨下組織後剪斷第4肋，接通呼吸機，暴露心臟，觀察肺充氣及心跳情況，撕開心包，將上部脂肪墊上翻，充分暴露左心耳和肺動脈圓錐，於二者之間用6/0醫用無損傷縫合線結紮左冠狀動脈前降支，可看到結紮後心肌梗死區(約8mm×8mm)局部呈現紫色，膨突，活動明顯減弱，然後縫合胸壁，堵住呼吸機回氣口使肺充盈後，用力擠壓胸部以排氣，再縫合胸部肌肉和皮膚。觀察呼吸情況，有自主呼吸後去除呼吸機，放回籠內飼養。
術後4周，對大鼠進行心超檢測，選用EF值下降到48-60％左右的大鼠，隨機分為7組，每組6隻，分別為假手術組(開胸後撕開心包，不結紮冠狀動脈)、陰性對照組(D組)、NRG組(D+N組)、U0126組(U組)、U0126+NRG組(U+N組)、Wortmannin組(W組)、Wortmannin+NRG組(W+N組)。受試藥組和陰性對照組給藥均為尾靜脈注射，每天一次(qd)，連續給藥5天。第6天停藥行心臟超聲檢測後，再連續給藥3天，給藥量，NRG為10μg/Kg，U0126為0.8mg/Kg，Wortmannin為0.4mg/Kg。每次給藥容積為0.4ml/100g。第3天停藥行心臟超聲檢測後，並解剖動物，稱心重、測心室壁厚度、心臟病理檢查及血液生化檢測等。
結果用藥5天進行心超檢測的結果顯示，D+N組、U組、U+N組、W組、W+N組在用藥後較用藥前的EF值，兩者比較具有顯著性差異(P＜0.01)。用藥前D+N組、U組、U+N組、W組、W+N組的EF值分別為53.46±4.27％、54.43±3.75％、53.93±2.53％、53.93±2.71％、52.93±3.77％；用藥後D+N組、U組、U+N組、W組、W+N組的EF值分別為66.6±10.74％、71.17±12.75％、65.17±8.97％、67.46±5.56％、66.08±9.77％。實驗結果見表1、圖3。
表1.U0126、Wortmannin及rhNRG分別與U0126、Wortmannin聯合用藥對心力衰竭大鼠的心功能改善作用

權利要求
1.有效量的PI3-K抑制劑用於製備治療、預防或延遲哺乳動物心臟病藥物中的用途。
2.根據權利要求1的用途，其中所述PI3-K抑制劑選自渥曼青黴素、渥曼青黴素類似物、Ly294002、Ly294002類似物。
3.根據權利要求2的用途，其中所述PI3-K抑制劑是渥曼青黴素。
4.根據權利要求2的用途，其中所述PI3-K抑制劑是Ly294002。
5.根據權利要求1的用途，其中所述哺乳動物是人。
6.根據權利要求1的用途，其中所述心臟病選自心肌病、缺血性心臟病、心肌炎、肥大型心肌病、心肌梗塞、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心力衰竭。
7.根據權利要求6所述的用途，其中所述心力衰竭是由於高血壓、缺血性心臟病、心肌梗塞、心肌炎、肥大型心肌病、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心律不齊、家族肥大型心肌病、自發擴張型心肌病和心臟毒性藥物所導致。
8.根據權利要求7的用途，其中所述心臟毒性藥物選自化療藥物、抗精神病藥物、抗抑鬱病藥物、幹擾素-α、白細胞介素-2、吐根鹼及herceptin。
9.根據權利要求8的用途，其中所述化療藥物可以是ADM、柔紅黴素、絲裂黴素、博萊黴素、環磷醯胺、氟脲嘧啶、放線菌素D、長春新鹼。
10.根據權利要求8的用途，其中所述抗精神病藥物可以是氯丙嗪、奮乃靜、三氟拉嗪。
11.根據權利要求8的用途，其中所述抗抑鬱病藥物可以是氯丙咪嗪，阿米替林，多慮平。
12.根據權利要求1的用途，其中所述PI3-K抑制劑是與藥理學可接受載體或賦形劑配製使用的。
13一種組合物，該組合物包括PI3-K抑制劑和有效量的預防或治療心臟病的藥物組成。
14.根據權力要求13所述的組合物，其中預防或治療心臟病的藥物包括ACEI、β受體阻滯劑、鈣離子拮抗劑、阿司匹林、阿託品、硝酸甘油、東莨菪鹼、NRG以及溶栓類藥物。
15.根據權力要求14所述的組合物，ACEI選自卡託普利、雷米普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利、喹那普利、西拉普利(cilazapril)或培哚普利(perindopril)。
16.根據權力要求14所述的組合物，β受體阻滯劑選自阿替洛爾、美託洛爾、普萘洛爾、索他洛爾或塞嗎洛爾。
17.根據權力要求14所述的組合物，鈣離子拮抗劑選自硝苯地平、維拉帕米、阿羅地平或地爾硫。
18.根據權力要求14所述的組合物，溶栓類藥物選自尿激酶、鏈激酶、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑(SCUPA)或甲氧苯基化纖溶酶原鏈激酶複合物(APSAC)。
19.根據權力要求14所述的組合物，NRG包括神經調節蛋白或含EGF樣結構域的神經調節蛋白功能片段。
20.根據權利要求13所述的組合物，包括藥理學可接受載體或賦形劑。
全文摘要
本發明發現PI3－K抑制劑、MAPK抑制劑可以明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能。本發明還發現PI3－K抑制劑、MAPK抑制劑與哺乳動物心力衰竭治療藥物rhNRG聯合使用，可以明顯改善哺乳動物心力衰竭心功能，兩者有協同作用。本發明提供了用於預防、治療或延緩哺乳動物尤其是人類心臟病的方法及組合物。具體說，本發明提供了PI3K抑制劑、MAPK抑制劑用於預防、治療或延緩哺乳動物心臟病方法及組合物，該方法包括對需要或希望預防、治療或延緩的哺乳動物施用有效量的PI3K抑制劑、MAPK抑制劑或與其它哺乳動物心臟病治療藥物聯合使用，以預防、治療或延緩所述心臟病。
文檔編號A61P9/10GK1743005SQ20041005423
公開日2006年3月8日 申請日期2004年9月2日 優先權日2004年9月2日
發明者周明東 申請人:上海澤生科技開發有限公司