細菌宿主菌株的製作方法

2023-06-25 15:07:11

專利名稱：細菌宿主菌株的製作方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及應用蛋白水解-缺陷性細菌宿主菌株。更具體而言，本發明涉及消除對異源多肽的降解作用和提高這類多肽的產量的宿主菌株。
2.相關技術描述缺乏蛋白酶或缺乏控制對蛋白酶調節的基因的大腸桿菌菌株是已知的。參見例如，Beckwith and Strauch，WO88/05821 1988年8月11日提交；Chaudhury and Smith，J.Bacteriol.，160788-791(1984)；Elish等人.，J.Gen.Microbiol.，1341355-1364(1988)；Baneyx and Georgiou，「Expression ofproteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli，」InStability of ProteinPharmaceuticals，Vol.3Chemical and Physical Pathways of ProteinDegradation，Ahern and Manning，eds.(Plenum Press，New York，1992)，p.69-108。
這其中的一些菌株已被使用，以試圖高效地生產蛋白水解敏感蛋白，特別是具有潛在的醫學或商業重要用途的那些蛋白。美國專利5,508,192(授予Georgiou等人)描述了多個蛋白酶-缺陷和/或熱-休克蛋白-缺陷性細菌宿主的構建。此類宿主包括單一-，雙重-，三重-或四重-蛋白酶-缺陷性細菌和還攜帶rpoH基因突變的單一-蛋白酶細菌。公開的蛋白酶-缺陷株的實例，包括刪除degP，ompT，ptr3和/或prc(tsp)的那些，以及據報導在大腸桿菌中產生高滴度重組蛋白的degP rpoH株。Park等人，Biotechnol.Prog.，15164-167(1999)也報導說，缺陷兩種細胞-外膜蛋白酶(degP，prc)的菌株(HM114)較另一種有更多蛋白酶缺陷的菌株生長稍微快些並產生更多的融合蛋白。他們聲稱，該菌株通過恆pH-補科分批培養29小時可生長至47.86g/L細胞乾重。所產生的蛋白是蛋白A-β-內醯胺酶融合蛋白，比得自其親本株KS272的β-內醯胺酶活性高30％。
Prc蛋白首先由Hara等人(J.Bacteriol.，1734799-4813(1991))作為裂解周質青黴素結合蛋白3(PBP3)羧基末端的周質蛋白酶分離出來。隨後，它也被鑑定為選擇性地降解具有非極性C-末端的蛋白的蛋白酶，並被重新命名為Tsp(Silber等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89295-299(1992))。經證明prc基因編碼一個75kDa的蛋白，該蛋白是保護細胞免受熱應激和滲透性應激的聯合影響所需要的(Hara等，出處同上)。業已證實，C-末端序列決定底物優選性(Keiler等人，Protein Sci.，4，1507-1515(1995))。裂解量對於底物蛋白C-末端殘基或功能性基團的同一性(identity)敏感。游離-羧基的存在，在決定帶有非極性C-末端序列的密切相關肽是否被Prc高效裂解方面是重要的。
在廣泛多種原核生物中業已鑑定了Prc同系物，所述原核生物包括數種藍細菌(Brand等人，Plant Mol.Bio.，20481-491(1992)；Shestakov等人，J.Biol.Chem.，26919354-19359(1994))，淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)(Black等人，J.Bacteriol.，1771952-1958(1995))，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)(Fleischmann等人，Science，269496-512(1995))，和杆狀巴爾通體(Bartonella bacilliformis)(GenBank系列號L37094)。Prc家族蛋白中有一種結構域類似於視黃醇-結合蛋白中的一種結構域，表明有一種共同的摺疊區域，它可能在這些蛋白中形成針對疏水性底物結合袋(Silber等，出處同上；Shestakov等，出處同上)。
Hara等(出處同上)發現，Δprc突變體的耐熱回復體包含基因外抑制物(spr)突變。他們進一步確認野生型spr基因產物是外膜組分中的脂蛋白。他們質疑野生型spr基因是否肽聚糖-水解酶(Hara等人，Microbial DrugResistance，263-72(1996))。當spr在prc-陽性背景下不具有功能時，spr突變的抑制物被鑑定為PBP7，它是另一種青黴素結合蛋白(Hara等，1996，出處同上)。Hara等(Abstract for Table Ronde Roussel Uclat no.86，Versailles，May 1997)還描述了對spr進行的克隆和Δprc突變體(在其中Spr不被蛋白酶降解)的製備，作者在文中得出結論prc和spr是交互抑制物。
利用大腸桿菌的prc(tsp)無效菌株的條件致死表型，也已經分離出三種多拷貝prc抑制基因(Bass等人，J.Bacteriol.，1781154-1161(1996))。它們當中無一與spr基因相關。這些抑制基因之中的一套是在染色體上定位於72.5分鐘的位置的兩個串聯的假定蛋白酶基因。這兩個基因是htrA同系物，其編碼與HtrA(DegP)絲氨酸蛋白酶分別有58％和35％的同一性的蛋白。另一種鑑定出的抑制基因是dksA(dnak抑制者)基因，其也是一個缺乏熱-休克基因dank，dnaj和grpE的多拷貝抑制基因。dksA基因作為mukB突變的一個多拷貝抑制基因，也已被獨立地分離出來，所述mukB突變是染色體分配所需要的。第三種類型是截短的脂蛋白A(rlpA)基因。
基因degP看來控制細胞-外膜蛋白酶DegP(HtrA)的合成。degP-缺陷突變體被Beckwith和Strauch(出處同上)首先構建並重組入大腸桿菌染色體中。HtrA具有約500kDa的高分子量，它是一個熱-休克蛋白，其蛋白質水解活性對於大腸桿菌在高溫下如超過42℃的存活是必不可少的(Skorko-Glonek等人，Gene，16347-52(1995))。大量通常不穩定的細胞-外膜蛋白可以由degP突變來穩定(Strauch and Beckwith，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851676-1580(1988))。最近，據報導，通過電子顯微鏡檢查和化學交聯分析發現，HtrA蛋白表現為由兩組六聚體環構成的十二體(Kim等人，J.Mol.Biol.，2941363-1374(1999))。蛋白底物，通過例如暴露於高溫或經歷二硫鍵還原作用而發生的解摺疊，對於它們進入雙環形HtrA的內部空間是必不可少的，在所述內部空間可發生肽鍵裂解(Kim等，出處同上)。
在各種缺陷蛋白酶的菌株中已生產了許多異源多肽。然而，其中有很多菌株的產物滴度相對低下和/或菌株生長不佳。因此需要提供一種細菌菌株，它在不引起產物修剪但提供高滴度產物的蛋白酶中有缺陷。
發明概述因此，本發明就是如權利要求書所要求的那樣。一方面本發明提供一種大腸桿菌菌株，它缺乏分別編碼蛋白酶DegP和Prc的染色體degP和prc，但攜有(harbor)或包括突變的spr基因，所述突變的spr基因的產物抑制攜有prc突變體的菌株所顯現的生長表型。優選地，所述菌株不缺乏編碼蛋白酶III的染色體ptr3和/或編碼蛋白酶OmpT的染色體ompT。優選地，為了在高-細胞密度大腸桿菌發酵過程的穩定期存活，通過向degPΔ prcΔ菌株引入突變的spr基因，來對大腸桿菌菌株進行基因工程改造。
在另一實施方案中，所述菌株包括編碼與該菌株異源的多肽的核酸，優選蛋白水解-敏感多肽，更優選真核生物多肽。
在另一實施方案中，本發明提供生產異源多肽，即與該菌株異源的多肽的方法。該方法包括首先培養缺乏編碼蛋白酶Prc的染色體prc並攜有或包括突變的spr基因的大腸桿菌菌株，所述突變的spr基因的產物抑制由攜有prc突變體的菌株所顯現的生長表型。該菌株還包含編碼所述異源多肽的核酸。進行培養，以使所述核酸表達。在此方法的第二步驟中，從所述菌株回收多肽，不論從細胞質，周質還是培養基中回收，優選從周質或培養基，最優選從整個發酵液中回收。優選地，所述多肽是Apo2配體或抗體，包括抗體片段。
附圖簡述

圖1A-1E顯示用於製備pY0317(即抗-VEGF Fab的生產質粒)的表達盒的完整核苷酸和胺基酸序列(分別是SEQ ID NO1和2)。粗體殘基表示得自最初的鼠A.4.6.1抗體的CDR殘基。斜體和下劃線殘基表示抗原結合所需要的鼠框架殘基。
圖2A和2B顯示pY0317(圖2A)的質粒圖解和pY0317tet20(圖2A和2B)的質粒構建。
圖3顯示pAPApo2-P2RU的質粒圖解。
圖4顯示人Apo-2配體cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO3)及其衍生的胺基酸序列(SEQ ID NO4)。核苷酸447位(在SEQ ID NO3中)的「N」用來指示該核苷酸鹼基可以是「T」或「G」。
圖5描述大腸桿菌菌株59A7，49A5和43H1的衍生物的圖解。
圖6描述49A5株(prc-陽性株)的發酵細胞小團的2-D凝膠結果，所述菌株可表達作為異源多肽的rhuFab′2抗-CD18-LZ融合物。所有與LC-相關的斑點均被圈出。
圖7描述43H1(prc-陰性株)的發酵細胞小團的2-D凝膠結果，所述菌株可表達作為異源多肽的rhuFab′2抗-CD18-LZ融合物。該凝膠中，LC-裂解產物消失。
圖8顯示用AME5TM/反相柱測定所分辨的五個峰，以此比較所分辨的rhuFab′2 LZ(xCD18)抗體片段的分配。Y軸是峰1-5的具體峰面積。X軸顯示三種rhuFab′2 LZ(xCD18)生產株，43H1(prc-)，49A5(prc+)和58H2(prc-修復的43H1)。帶粗輪廓線的灰色條是LC-115；黑色條是LC，白色條是LC二聚物，帶有細輪廓線的灰色條是Fab-樣分子，磚塊-樣模式條是Fab′2-LZ。能夠看出，峰1(LC-115)從prc-缺失株中消失。
圖9顯示，沒有突變的spr基因的prc-陰性株(pS1130轉化的58B3)(正方形)和帶有突變的spr基因的prc-陰性株(pS1130轉化的59A7)(菱形)的標準化高-細胞密度發酵的生長圖譜，其用OD550與發酵小時的函數表示。
圖10描述，人源化抗-CD18κLC序列(SEQ ID NO5)，及假定的LC降解產物的理論pI值。用斜線突出顯示的(highlighted)裂解被質譜分析證實。見下面表3。
圖11描述具有用不同宿主和三種蛋白的七個泳道的凝膠圖。此凝膠圖表明，20-kD LC剪切物(LC182)不存在於表達抗-VEGF Fab和抗-組織因子Fab′2-LZ融合分子的43H1 (prc-)細胞中。泳道1是抗-組織因子F(ab′)2 LZ6xHis，宿主株33B6；泳道2是抗-組織因子F(ab′)2 LZ 6xHis，宿主株43H1；泳道3是抗-CD18 F(ab′)2 LZ 6xHis，宿主株49A5；泳道4是抗-CD18 F(ab′)2LZ 6xHis，宿主株41H1；泳道5是pBR322，宿主株49A5；泳道6是抗-VEGFFab，宿主株43H1；泳道7是抗-VEGF Fab，宿主株43E7。符號HC和H代表重鏈，而LC和L代表輕鏈。
圖12描述59A7株(prc-陰性株)的搖瓶細胞小團的2-D凝膠結果，所述菌株可表達抗-VEGF Fab(pY0317tet20)作為異源多肽。在該凝膠中，LC-裂解產物和在prc-陽性細胞中發現的兩種HC-裂解片段消失。僅在59A7株中檢測到的兩種不同HC剪切物也在圖中顯現，它們是OmpT-裂解產物，或者是Ptr3-裂解產物。
圖13描述60C1株(prc-陽性株)的搖瓶細胞小團的2-D凝膠結果，該菌株可表達作為異源多肽的抗-VEGF Fab(pY0317tet20)。該凝膠中，檢測到多重LC-裂解片段和兩重HC-裂解片段。
優選實施方案的詳細說明定義本文所用「多肽」一般指具有約十個以上胺基酸的肽和蛋白質。「異源」多肽是指相對於所用宿主細胞而言外來的那些多肽，例如大腸桿菌產生的人蛋白。所述多肽可以是原核多肽或真核多肽，但是優選它是真核多肽，更優選哺乳動物多肽。
哺乳動物多肽的實例包括例如下列分子，腎素，一種生長激素，其包括人生長激素；牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；血小板生成素；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如凝血因子VIIIC，凝血因子IX，組織因子和von Willebrand因子；抗-凝血因子，如蛋白C；心房利鈉因子(atrial naturietic factor)；肺表面活性物質；血纖維蛋白溶解酶原激活物，如尿激酶或人尿或組織型血纖維蛋白溶解酶原激活物(t-PA)；鈴蟾素(bombesin)；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子-β；ErbB2結構域(一個或多個)例如2C4的抗體(WO01/00245；雜交瘤ATCC HB-12697)，其與ErbB2胞外結構域的一個域(例如ErbB2的約殘基22至約殘基584的區域中任何一個或多個殘基，包括兩個端點位置)相結合；腦啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；米勒(mullerian)-抑制物質；鬆弛肽A-鏈；鬆弛肽B-鏈；鬆弛肽原；小鼠促性腺激素-相關肽；微生物蛋白，如β-內醯胺酶；脫氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管內皮細胞生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯蛋白；蛋白A或D；類風溼因子；神經營養因子，如腦衍生的神經營養因子(BDNF)，神經營養蛋白-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神經生長因子如NGF；心營養蛋白(cardiotrophin)(心臟肥大因子)如心營養蛋白-1(CT-1)；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子，如aFGF和bFGF；表皮生長因子(EGF)；轉化生長因於(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1，TGF-2，TGF-3，TGF 4或TGF-5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，如CD-3，CD-4，CD-8和CD-19；紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白(BMP)；幹擾素，如幹擾素-α，-β和-γ；血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白細胞介素(IL)，如IL-1到IL-10；抗-HER-2抗體；Apo2配體；超氧化物歧化酶；T細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如AIDS包膜的一部分；轉運蛋白；歸巢受體；地址素；調控蛋白；抗體；和上述所列任一多肽的片段。
優選的目的多肽包括各種多肽，如HSA，BSA，抗-IgE，抗-CD20，抗-IgG，t-PA，gp120，抗-CD11a，抗-CD18，2C4，抗-VEGF，VEGF，TGF-β，活化素，抑制素，抗-HER-2，脫氧核糖核酸酶，IGF-I，IGF-II，腦IGF-I，生長激素，鬆弛肽鏈，生長激素釋放因子，胰島素鏈或胰島素原，NGF，NT-3，BDNF，Apo2配體和尿激酶。特別優選的哺乳動物多肽是抗體，其包括全長抗體，抗體片段，和Apo2配體。更優選這些抗體是人抗體或人源化抗體。這些抗體包括例如抗-IgE，抗-IgG，抗-Her-2，抗-CD11a，抗-CD18，抗-CD20和抗-VEGF，2C4，BSA或HSA。更加優選地，抗體是抗-CD18，抗-VEGF，抗組織因子，2C4，抗-Her-2，抗-CD20，抗-CD40或抗-CD11a抗體。涵蓋在多肽定義之內的抗體片段，包括例如Fab，Fab′，Fab′2或Fab′2-亮氨酸拉鏈(LZ)，最優選抗-CD18 Fab′2-LZ，抗-組織因子Fab′2 LZ-6xhis，抗-VEGF Fab，抗-CD8 his-標記的Fab′2 LZ和抗-CD18 lys-標記的Fab′2LZ。
本文所用「蛋白水解敏感」多肽的描述語，是指無論在天然狀態還是在分泌期間，傾向於，易於或已被一種或多種大腸桿菌蛋白酶裂解的多肽。
「高細胞密度」發酵或培養，是指這樣的一種方法，其通常首先分批地添加一些營養素以使細胞生長，並利用O2消耗和葡萄糖消耗之間的關係來通過容易測量的溶解氧而控制葡萄糖加入。如在下面實施例中進一步詳述的那樣，為達到更高細胞密度，可以連續地添加氨，而且可以在發酵的某些階段添加微量營養素(例如P，K，S，和Mg)以支持細胞生長。
「突變的spr基因，其基因產物抑制由攜有prc突變體的菌株所顯現的生長表型」，是指帶有Hara等(1996，出處同上)報導的序列的大腸桿菌prc抑制基因(spr)(編碼Prcsup)，或者是一個突變基因，前提是所述基因產物抑制帶有prc突變體的菌株的生長表型的作用。優選地，所述突變由一個點突變構成。最優選的是點突變W148R，其中TGG密碼子變成CGG，這導致胺基酸148由色氨酸變為精氨酸。
本文術語「抗體」使用其最廣義的定義，並特別包括完整單克隆抗體，多克隆抗體，由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們顯示所需的生物活性。
本文所用術語「單克隆抗體」，是指得自基本上同質的抗體群體的抗體，即屬於此群體的單個抗體，除可能少量存在天然發生的突變之外均相同。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。除其特異性之外，單克隆抗體的優勢還包括可以被合成而不受其它抗體汙染。修飾詞「單克隆」是指抗體得自基本上均質的抗體群體的特性，不應理解為需要通過任何特定方法來製備抗體。例如，本發明使用的單克隆抗體可以由Koehler等人在Nature，256495(1975)上首先描述的雜交瘤方法製得，或者由重組DNA方法製得(參見例如美國專利4,816,567)。「單克隆抗體」也可以使用在文獻，例如Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體文庫分離得到。
本文單克隆抗體特別地包括「嵌合」抗體以及這些抗體的片段(只要它們顯示所需的生物活性)，其中所述抗體的重鏈和/或輕鏈的一部分與來源於某具體物種或者屬於某特定抗體類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，而所述鏈(一條或多條)的其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類或亞類的抗體的相應序列相同或同源(美國專利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA，816851-6855(1984))。本文中目的嵌合抗體包括「靈長源化(primatized)」抗體，它包括來源於非-人靈長類(例如舊大陸猴，猿等)的可變區抗原結合序列和人恆定區序列。
「抗體片段」包括完整抗體的一部分，優選包括其抗原-結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段；二價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段(一個或多個)形成的多特異性抗體。
「完整抗體」是包括抗原-結合可變區以及輕鏈恆定區(CL)和重鏈恆定區CH1，CH2和CH3的抗體。恆定區可以是天然序列恆定區(如，人的天然序列恆定區)或其胺基酸序列變體。優選地，完整抗體具有一種或多種效應功能。
抗體「效應功能」，是指可歸因於抗體Fc區(天然-序列Fc區或帶有胺基酸序列變異的Fc區)的那些生物學活性。抗體效應功能的實例包括C1q結合，補體依賴性細胞毒性，Fc受體結合，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，吞噬作用，細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)的下調，等等。
根據重鏈恆定區的胺基酸序列，可將完整抗體分為不同″類″。完整抗體有五大類IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些類還可進一步分為「亞類」(同種型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。對應於不同類抗體的重鏈恆定區分別稱作α，δ，ε，γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結構和三維構象為大家所熟知。
「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性」和「ADCC」是指一種細胞-介導的反應，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒細胞(例如自然殺傷(NK)細胞，中性粒細胞和巨噬細胞)識別結合在靶細胞上的抗體並隨後引起靶細胞裂解。介導ADCC的初級細胞，NK細胞，僅僅表達FcRIII，而單核細胞表達FcRI，FcRII和FcRIII。FcR在造血細胞上的表達總結於Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9457-492(1991)一文第464頁的表3中。為評定目的分子的ADCC活性，可以進行體外ADCC測定，如美國專利5,500,362或5,821,337所描述的測定。對於此類測定有用的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細胞。或者，或另外，可以在體內評定目的分子的ADCC活性，例如，在Clynes等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95652-656(1998)公開的動物模型中進行測定。
「人效應細胞」是表達一個或多個FcR並執行效應功能的白細胞。優選地，至少表達FcRIII並執行ADCC效應功能的細胞。介導ADCC的人白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)，自然殺傷(NK)細胞，單核細胞，細胞毒性T細胞，和中性粒細胞，以PBMC和NK細胞為優選。這些效應細胞可以分離自其天然來源，例如，本文所述的血液或PBMC。
「天然抗體」通常是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈還有規則間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對排列，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對排列。人們確信，特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面。
術語「可變」所指事實為可變區某些部分的序列在不同抗體之間有很大差異，它們可在各個特定抗體對其特定抗原的結合和特異性方面發揮作用。然而，該變異性不是均勻地分布於抗體的整個可變區。它集中於輕鏈和重鏈可變區中三個稱為超變區的節段中。可變區中保守性較高的區域稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區各包括4個FR，主要採取β摺疊構象，由形成環狀連接的三個超變區相連接，而在某些情況下可形成β摺疊結構的一部分。每條鏈的超變區都可通過FR緊密靠近，並與其它鏈的超變區緊密靠近，從而形成抗體的抗原結合位點(見Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。這些恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出各種效應功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)。
本文所用術語″超變區″，是指抗體中負責與抗原-結合的胺基酸殘基。超變區通常包含來自″互補決定區″或″CDR″的胺基酸殘基(如輕鏈可變區中的殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequence of proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或來自″超變區環″的那些殘基(如輕鏈可變區中的殘基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。″框架區″或″FR″殘基是那些可變區的殘基而不是本文定義的超變區殘基。
用木瓜蛋白酶消化抗體可產生兩個相同的各帶有單個抗原結合位點的抗原結合片段(稱為「Fab″片段)和一個殘餘的「Fc″片段，Fc段的名稱反應了其易於結晶的能力。經胃蛋白酶處理可產生具有兩個抗原結合位點並仍然能交聯抗原的F(ab′)2片段。
「Fv」是含有完整的抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。此區由緊密地非共價連接的一個重鏈可變區與一個輕鏈可變區的二聚體組成。在這個構象中每個可變區的三個超變區相互作用，在VH-VL二聚體表面限定一個抗原結合位點。這六個超變區共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或Fv上僅含有三個抗原特異性超變區的一半)也具有識別和結合抗原的能力，但與完整的結合位點相比其親和力較低。
Fab片段還包括輕鏈恆定區和重鏈的第一個恆定區(CH1)。Fab′段與Fab片段的差別在於Fab′片段在重鏈CH1的羧基末端多出幾個殘基，包括抗體鉸鏈區多出的一個或多個半胱氨酸。Fab′-SH在本文中是指恆定區半胱氨酸殘基帶有至少一個游離巰基的那種Fab′。F(ab′)2抗體片段最初產生為Fab′片段對，在Fab′之間具有鉸鏈區半胱氨酸。抗體片段的其它化學偶聯也是眾所周知的。
脊椎動物任何物種的抗體的「輕鏈」，可依據其恆定區胺基酸序列而歸為兩個完全不同的類型κ型和λ型。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包括抗體的VH和VL結構域，且這些結構域存在於單個多肽鏈上。優選地，Fv多肽在VH和VL結構域之間還包含一個多肽接頭，其能使scFv形成抗原結合所需的結構。關於scFv的綜述，見Plückthunin The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，vol.113，Rosenburgand Moore eds.(Springer-Verlag，New York，1994)，pp.269-315。抗-ErbB2抗體scFv片段在WO93/16185；美國專利5,571,894和美國專利5,587,458中描述。
術語「二價抗體」是指具有兩個抗原結合位點的小分子抗體片段，這些片段含有在一條多肽鏈(VH-VL)上相連的一個重鏈可變區(VH)和一個輕鏈可變區(VL)。利用一個非常短的接頭可使同一條鏈上的兩個結構域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。例如在EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人，Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中有對二價抗體的更詳細描述。
「人源化」型非人(例如嚙齒類動物)抗體是包含非人免疫球蛋白最小序列的嵌合抗體。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，但其中受者超變區的殘基被具有所需特異性，親和力和能力的非人源物種如小鼠，大鼠，家兔或非人靈長類的抗體(供體抗體)的超變區殘基所取代。在有些情況下，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基被對應的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受者抗體或供體抗體中不存在的殘基。這些修飾旨在進一步改善抗體性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個，通常兩個可變區的全部，其中超變環全部或基本上全部對應於非人免疫球蛋白的相應部分，而FR序列全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恆定區的至少一部分。詳見Jones等，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等，Nature332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
「分離的」抗體是已從其天然環境的組成中鑑定，分離和/或回收的抗體。其天然環境的汙染成分是幹擾抗體的診斷或治療應用的物質，可包括酶，激素和其它蛋白質的或非蛋白質的溶質。在優選的實施方案中，該抗體的純度應達到(1)經Lowry法確定抗體重量的95％以上，最優選抗體重量的99％以上，(2)所達程度足以用離心杯(spinning cup)序列分析儀測出至少15個殘基的N端或內部胺基酸序列，或(3)通過SDS-PAGE以及還原或非還原條件下的考馬斯亮藍染色，優選銀染色所證實的同質性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為該抗體的自然環境中的至少一種組分將不存在。然而一般情況下，分離的抗體可通過至少一個純化步驟來製備。
術語″控制序列″，是指在特定宿主生物中表達可操作地連接的編碼序列所必要的DNA序列。適宜於原核生物的控制序列包括啟動子，任選還包括操縱子序列，和核糖體結合位點。
當將核酸置於與另一核酸序列功能相關的位置時，該核酸是「可操作連接的」。例如，如果希望將多肽表達為參與該多肽分泌的前蛋白，可將前序列或分泌前導序列的DNA與該多肽的DNA可操作連接；啟動子如果能影響編碼序列的轉錄，可將該啟動子與編碼序列可操作連接；或者，核糖體結合位點可與編碼序列可操作連接，只要此位點所處位置有利於翻譯。通常，「可操作連接」意味著參與連接的DNA序列是鄰接的，在分泌前導序列的情況下，是鄰接的並且在閱讀狀態。連接通過在方便的限制性酶切位點連接而完成。如果不存在這樣的酶切位點，則根據常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
在本文中，″細胞″，″細胞系″和″細胞培養物″的表述互換使用，並且所有這些命名均包括後代。因此，單詞″轉化體″和″轉化的細胞″包括原始主體細胞和由其傳代的培養物，而不考慮傳遞次數。也應理解，由於有意或無意的突變，所有後代在DNA含量上可能並不完全相同。從最初轉化的細胞中篩選出的具有同樣功能或生物學活性的突變後代被包括在內。任何地方出現的不同命名可以從本申請的內容明確。
實現本發明的模式本發明提供缺乏分別編碼蛋白酶DegP和Prc的染色體degP和prc，並攜有突變的spr基因的大腸桿菌菌株，所述突變的spr基因的產物抑制由隱藏prc突變體的菌株所顯現的生長表型。所述菌株任選地更進一步缺乏編碼蛋白酶III的染色體ptr3和/或編碼蛋白酶OmpT的染色體ompT。
在另一實施方案中，所述菌株包括編碼與該株異源的多肽的核酸。所述菌株優選用核酸轉化，如應用重組表達載體一樣，其中所述核酸優選DNA(cDNA或基因組DNA)。
另一方面，本發明提供生產此種異源多肽的方法。在該方法中，培養也包含編碼此多肽的核酸的上述大腸桿菌菌株，從而表達所述核酸。然後從該菌株回收所述多肽。可以從菌株的周質或培養基回收。優選地，培養在發酵罐中進行，更優選在高細胞-密度發酵的條件下進行。
以常規方式應用培養參數並進行多肽生產，如下述方法。
A.核酸及其修飾的選擇編碼目的多肽的核酸適宜為任何來源的RNA，cDNA或基因組DNA，只要其編碼此目的多肽即可。篩選在大腸桿菌中表達異源多肽(包括其變體)的合適核酸的方法為大家所熟知。
如果要生產單克隆抗體，那麼，編碼單克隆抗體的DNA可用常規方法很容易地分離和測序(舉例來說，利用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優選來源。DNA分離後，可將其置於表達載體中，然後用此表達載體轉化本文的細菌宿主細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
本領域已有關於使非人類抗體人源化的方法的描述。優選地，人源化抗體中已導入一或多個源自非人類的胺基酸殘基。這些非人類胺基酸殘基常稱為「引進的」殘基，其通常來自「引進的」可變區。人源化基本按照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988))，將超變區序列用人抗體的相應序列來取代。因此，這樣的「人源化」抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中完整的人類可變區的相當一部分被非人類物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些超變區殘基且可能有一些FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。
對用於製備人源化抗體的人重鏈和輕鏈可變區進行的選擇，對降低抗原性非常重要。根據所謂「最適應」方法，對比(against)已知的人可變區序列的整個文庫篩選出嚙齒類抗體可變區序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(FR)(Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法是用衍生自人類所有抗體輕鏈或重鏈特定亞型的的共有序列的特定框架區。相同的框架可用於數種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化後保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產物來製備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型不但已有商品，而且是本領域技術人員所熟悉的。現有用於描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構象結構的電腦程式。通過觀察這些展示結果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。通過這種方法，可從受者和引進序列中選出FR殘基並組合，從而得到所需抗體性質，如對靶抗原的親和力增加。總之，超變區殘基直接並且最主要涉及對抗原結合的影響。
本申請還考慮了人源化抗體或親和力成熟的抗體的各種形式。例如，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，如Fab，其可任選與一個或多個靶向試劑偶聯以製備免疫偶聯物。或者，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是完整的抗體，例如完整的IgG1抗體。
可從大腸桿菌直接回收Fab′-SH片段，並經化學偶聯形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology，10163-167(1992))。依據另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養中分離F(ab′)2片段。其它產生抗體片段的技術對本領域技術人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)(WO93/16185；美國專利5,571,894和美國專利5,587,458)。抗體片段也可以是「線性化抗體」，舉例如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同抗原表位的結合特異性的抗體。示例性雙特異抗體可以與Dkk-1蛋白的兩個不同抗原表位相結合。雙特異性抗體可製備成全長抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。
依據另一種方法，可將具有所需結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恆定區序列融合。該融合優選與包含鉸鏈區的至少一部分，CH2及CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定區融合。優選使含有輕鏈結合所需位點的第一重鏈恆定區(CH1)出現在至少在一種融合中。可將編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA，以及必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉染至適當細菌宿主生物。這使得在使用三種非等比的多肽鏈進行構建的實施方案中，能非常靈活地調整三種多肽片段的相互比例，以獲得最佳產量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產時或所述比例無特別意義時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。
在該方法的一個優選實施方案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的帶有第一種結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二種結合特異性)構成。已發現這種不對稱結構有利於從不必要的免疫球蛋白鏈的混合(combination)中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特異性分子的一半上存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離容易。此方法公開於WO94/04690中。製備雙特異性抗體的進一步細節，見例如Suresh等，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據美國專利5,731,168所述的另一種方法，可以基因工程改造一對抗體分子之間的界面，使得從重組細胞培養中獲得的異二聚體的百分比最大。優選的界面包括抗體恆定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中，源於第一種抗體分子界面上的一條或多條胺基酸小側鏈被較大側鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側鏈大小相同或相近的互補「溝」可通過將胺基酸大側鏈用小側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二種抗體分子的界面上形成。此機制使得異二聚體的產量比不必要的終產物如同二聚體的高。
雙特異性抗體包括交聯抗體或「異源偶聯的」抗體。例如，可使異源偶聯物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯，使另一抗體與生物素偶聯。已有觀點認為，這類抗體可用於將免疫系統細胞導向不必要的細胞(美國專利4676980)，也可用於治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。異源偶聯抗體可通過任何適當的交聯方法製備。適當的交聯製劑和多種交聯技術為本領域已知，可參見美國專利4676980。
從抗體片段製備雙特異性抗體的技術已在文獻中描述。例如，雙特異性抗體可利用化學偶聯製備。Brennan等，Science 22981(1985)中描述了將完整抗體經蛋白水解製備成F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基複合劑亞砷酸鈉存在時被還原，從而穩定相鄰的二巰基，並阻止分子間二硫鍵的形成。生成的Fab′片段之後被轉化為硫代亞硝基苯甲酸鹽(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經巰基乙胺還原成Fab′-硫醇(thio)，再與等克分子量的另一種Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產生的雙特異性抗體可作為酶的選擇性固定所用的試劑。
另外，可從大腸桿菌直接回收Fab′-SH片段，並經化學偶聯形成雙特異抗體(Shalaby等，J.Exp.Med.，175217-167(1992))。
直接從重組細胞培養物中製備並分離雙特異性抗體片段的各種技術也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈製備雙特異性抗體(Kostelny等，J.Immunol.，148(5)1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過基因融合而連接。使抗體的同二聚體在鉸鏈區被還原成單體，然後被再氧化形成抗體的異二聚體。該方法也可用於製備抗體同二聚體。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))描述的「二價抗體」技術提供了另一種製備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(VH)，其通過接頭與輕鏈可變區(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個結構域之間無法配對。因此，一片段上的VH和VL結構域被迫與另一片段上的互補VL和VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此外還報導了另一種用單鏈Fv(sFv)二聚體來製備雙特異性抗體的策略(Gruber等，J.Immunol.，1525368(1994))。
還考慮了二價以上的抗體。例如可製備三特異性抗體(Tutt等，J.Immunol.，14760(1991))。
用本領域已知的的各種方法製備編碼多肽變體的核酸分子。這些方法包括但不限於從天然來源分離(在存在天然胺基酸序列變體的情況下)，或通過對該多肽之早期製備的變體或非變體形式進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變，PCR誘變或盒式誘變來製備。
優選修飾本發明抗體的效應功能以便，例如，提高與Fc受體的結合。這可以通過在抗體Fc區引入一或多個胺基酸取代而獲得。或者，或另外，可在Fc區引入半胱氨酸殘基，使得在此區形成鏈間二硫鍵。
為了延長該抗體的血清半衰期，可在該抗體(尤其抗體片段)中摻入一個補救受體結合表位，如美國專利5,739,277所述。本文中術語「補救受體結合表位」是指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc區中負責延長該IgG分子的體內血清半衰期的表位。
本文還考慮抗體的其它修飾。例如，可以使抗體與多種非蛋白質多聚物中的一種，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯(polyoxyalkylene)，或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物連接。
B.核酸插入複製型載體為了在適宜啟動子控制下在細菌中表達，適當地將異源核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入複製型載體中。許多載體可用於此目的，適當載體的選擇主要取決於要被插入載體的核酸的大小和要被載體轉化的具體宿主細胞。每種載體根據與其相容的具體宿主細胞而包含不同的元件。依具體的宿主種類不同，載體組分通常包括但不限於一個或多個下述組分信號序列，複製起始點，一個或多個標記基因，啟動子和轉錄終止序列。
一般來說，包含複製子和源於同宿主細胞相適合的物種的控制序列的質粒載體被用來與大腸桿菌宿主聯用。載體通常攜帶複製位點，以及能夠在轉化細胞中提供表型選擇的標誌序列。例如，通常使用pBR322轉化大腸桿菌，pBR322是來源於大腸桿菌的質粒(參見例如，Bolivar等人，Gene，295(1977))。pBR322含有氨苄青黴素和四環素抗藥性基因，並由此提供鑑定轉化細胞的簡便方法。pBR322質粒或其它細菌質粒或噬菌體也通常包含或在修飾後包含能被大腸桿菌宿主使用的啟動子，以表達選擇標誌基因。
(i)信號序列組分編碼本文目的多肽的DNA不僅可以直接表達，而且還可作為與另一多肽，優選信號序列或在成熟多肽的N末端上具有特異性裂解位點的其它多肽的融合來表達。通常，信號序列是載體的一個元件或者是被插入載體中的多肽DNA的一部分。所選異源信號序列應當是被宿主細胞識別並加工(即被信號肽酶裂解)的一種序列。
對於不識別和加工天然或真核生物多肽信號序列的原核宿主細胞，信號序列則被選自，例如，鹼性磷酸酶，青黴素酶，1pp或熱穩定腸毒素II前導區的原核生物信號序列替換。
(ii)複製起點組分表達載體包含能使該載體在一或多種所選宿主細胞中進行複製的核酸序列。在多種細菌中，這樣的序列眾所周知。來自質粒pBR322的複製起始點適合於大多數革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌。
(iii)選擇基因組分表達載體通常包含選擇基因，也稱為選擇性標誌物。該基因編碼為生長在選擇性培養基中的轉化的宿主細胞的存活或生長所必需的蛋白質。未用包含選擇基因的載體轉化的宿主細胞將不能在培養基中存活。選擇性標誌物與本發明使用和定義的遺傳標誌分隔開。典型的選擇基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨苄青黴素，新黴素，氨甲喋呤或四環素等的抗性，(b)彌補並非由遺傳標記造成的營養缺陷型缺陷，或(c)提供從複合培養基中不能得到的關鍵營養物質，例如編碼桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個實例是利用藥物阻滯宿主細胞的生長。在這種情況下，那些被目的核酸成功轉化的細胞產生能賦予藥物抗性的蛋白，從而在選擇過程中得以存活。這樣的顯性選擇實例使用藥物新黴素(Southern等人，J.Molec.Appl.Genet.，1 327(1982))[FLD1]，黴酚酸(Mulligan等人，Science，2091422(1980))[FLD2]和潮黴素(Sugden等人，Mol.Cell.Biol.，5410-413(1985))[FLD3]。以上舉出的三個實例利用在真核控制下的細菌基因來傳遞能對抗相應藥物G418或新黴素(遺傳黴素)，xgpt(黴酚酸)或潮黴素的抗性。
(iv)啟動子組分用於產生目的多肽的表達載體含有可被宿主生物識別並與編碼目的多肽的核酸可操作地相連的適宜啟動子。適用於原核宿主的啟動子，包括β-內醯胺酶和乳糖啟動子系統[Chang等，Nature，275615(1978)；Goeddel等，Nature，281544(1979)]，阿拉伯糖啟動子系統(Guzman等人，J.Bacteriol.，1747716-7728(1992))，鹼性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel，Nucleic acids Res.，84057(1980)；EP36776)，和雜化(hybrid)啟動子如tac啟動子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。然而，其它已知的細菌啟動子也是適宜的。它們的核苷酸序列業已公開，從而令熟練工作人員能夠使用可提供任何所需的限制酶切位點的連接子或銜接子(adaptor)，可操作地將這些核苷酸序列與編碼目的多肽的DNA連接(Siebenlist等人，Cell，20269(1980))。
用於細菌系統的啟動子通常還含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其與編碼目的多肽的DNA可操作連接。可用限制性內切酶消化使該啟動子從細菌源DNA上脫附並插入到含有所需DNA的載體中。
(v)載體的構建及分析使用標準連接技術可構建包含上述所列一個或多個組分的適宜載體。分離的質粒或DNA片段按所需形式裂解，剪裁和再連接，以產生所需要的質粒。
為了分析證實所構建質粒中的正確序列，將連接混合物用於轉化大腸桿菌K12株294(ATCC31，446)或其它菌株，並用相應的氨苄青黴素或四環素抗性選擇出成功的轉化體。製備來自轉化體的質粒，用限制性內切酶消化進行分析，和/或用Sanger等人Proc.Natl.Acad Sci.USA，745463-5467(1977)或Messing等人，Nucleic Acids Res.，9309(1981)的方法，或用Maxam等人，Methods in Enzymology，65499(1980)的方法測序。
C.宿主細胞選擇和轉化適宜作為本文表達質粒的親本宿主的大腸桿菌宿主包括大腸桿菌W3110(ATCC27，325)，大腸桿菌294(ATCC31，446)，大腸桿菌B和大腸桿菌X1776(ATCC31，537)。這些實例是解說性的而非限制性的。上述菌株的任何突變細胞也可用作起始宿主，然後起始宿主進一步突變以便至少包含本文所需的最小基因型。大腸桿菌菌株W3110是優選的親本宿主，因為它是重組DNA產物發酵的通用宿主。用作親本宿主的起始大腸桿菌宿主範例以及它們的基因型，包括於下表中
還優選製備36F8株過程中的中間物，即27B4(美國專利5,304,472)和35E7(一種比27B4生長好的自發耐熱菌落分離物)。另一種適宜的菌株是具有於1990年8月7日授予的美國專利4,946,783所公開的突變體周質蛋白酶的大腸桿菌菌株。
本發明菌株可以通過親本菌株的染色體整合或其它技術來生產，包括下面實施例中所陳述的那些技術。
編碼所述多肽的核酸被插入宿主細胞中。優選地，這可以通過用上述表達載體轉化宿主細胞並在為了誘導各種啟動子而酌情改良的常規營養培養基上培養而完成。
轉化是指將DNA引入生物以便複製DNA，使其成為染色體外元件或染色體整合物。根據所用的宿主細胞的不同，使用適合於所述細胞的標準技術進行轉化。如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)一書1.82部分所述的使用氯化鈣進行的鈣處理，通常用於原核細胞或包含細胞壁實體屏障的其它細胞。另一轉化方法利用聚乙二醇/DMSO，如Chung and Miller，Nucleic AcidsRes.，163580(1988)所述。還有一種方法是利用稱為電穿孔的技術。
D.培養宿主細胞總體上如Sambrook等人(出處同上)所述，在適宜培養基中培養可用於生產目的多肽的原核細胞。培養條件，如溫度，pH等等，是前述為了篩選用於表達的宿主細胞而使用的那些，並且是本領域普通技術人員顯而易見的。
使用鹼性磷酸酶啟動子時，用於生產本發明目的多肽的大腸桿菌細胞在適宜培養基中培養，在所述適宜培養基中，鹼性磷酸酶啟動子可以被部分或完全誘導，總體如Sambrook等(出處同上)所述。培養需求決不在缺乏無機磷酸鹽或磷酸鹽飢餓水平的情況下發生。首先，培養基所含無機磷酸鹽的量超出誘導蛋白質合成的水平並足以使細菌生長。隨著細胞生長和利用磷酸鹽，其降低培養基中的磷酸鹽水平，從而導致誘導合成多肽。
除了碳，氮和無機磷酸鹽源外，也可引入適當濃度的任何其它必需的培養基組分，它們可以單獨引入，或作為與另一組分或介質的混合物(如複合氮源)而引入。培養基的pH可以是約5-9的任何pH，主要取決於宿主生物體。
如果啟動子是誘導型啟動子，那麼，為了使誘導發生，通常使用高細胞密度方法將細胞培養至一定光密度(如A550約200)，以此啟動誘導(例如，通過添加誘導物，通過耗竭培養基組分等)，從而誘導編碼目的多肽的基因表達。
E.檢測表達情況基因表達可以直接在樣本中測定，例如用常規的Southern印跡法，用於定量mRNA轉錄的Northern印跡法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)，斑點印跡(DNA分析)或原位雜交，它們使用基於多肽序列適當標記的探針。可以使用各種標記物，最普通的是放射性同位素，尤其是32p。然而，也可使用其它技術，例如為了引入多核苷酸中而使用生物素-修飾的核苷酸。生物素在以後作為與抗生物素蛋白或用各式各樣標記物(如放射性核素，螢光體，酶等)標記的抗體相結合的位點。或者，使用檢定法(assays)或凝膠(gels)檢測蛋白質。
為了表達的基因產物的分泌，宿主細胞在足以使基因產物分泌的條件下進行培養。這些條件包括例如允許細胞進行分泌的溫度，營養物和細胞密度。而且，所述條件是細胞能進行基本細胞功能(蛋白的轉錄、翻譯、和將蛋白從一個細胞空間轉移至另一細胞空間)的條件，如本領域技術人員已知的那樣。
F.純化多肽下列單獨或聯合使用的方法是適當純化方法的實例，所用的具體方法取決於多肽種類在免疫親和柱或離子-交換柱上分級分離；乙醇沉澱；反相HPLC；疏水性-相互作用層析法；矽層析；離子-交換樹脂層析如S-SEPHAROSETM和DEAE；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉澱；和使用例如SEPHADEXTMG-75的凝膠過濾。
用常規的抗體純化方法可以將單克隆抗體從培養基中適當地分離出來，所述方法例如蛋白A-Sepharose，羥基磷灰石層析，凝膠電泳，透析或親和層析。
參考下列實施例，可以更全面地理解本發明。然而，不應當將實施例理解為對本發明範圍的限定。所有文獻和專利引證引入本文作為參考。
實施例1材料與方法A.表達質粒1.表達rhuFab′2 LZ(xCD18)和標記的衍生物的質粒pS1130質粒pS1130是美國專利6,180,367和6,258,560描述的基於pBR322的質粒。rhuFab′2 LZ(xCD18)合成受大腸桿菌鹼性磷酸酶(AP)啟動子調控。當AP啟動子被磷酸鹽耗盡所誘導，其形成二-順反子信使RNA，其中依次有STII信號-κ輕鏈編碼序列；STII信號-重鏈編碼序列，繼之以亮氨酸拉鏈序列。λ轉錄終止子的位置靠近翻譯終止密碼子。
pcyc34質粒pcyc34是pS1130的tacII啟動子副本(counterpart)。
pxCD18-7T3該含有兩個獨立的翻譯單位的雙-啟動子質粒，pxCD18-7T3，允許輕鏈轉錄與重鏈轉錄的暫時分開。如在pS1130一樣，其輕鏈保持在phoA啟動子的控制之下。而在pxCD18-7T3上，λt0轉錄終止子跟隨輕鏈編碼序列。在該終止子下遊添加tacII啟動子以控制重鏈片段/C-末端亮氨酸拉鏈的轉錄(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。第二個λto轉錄終止子跟隨此編碼序列。STII信號序列的沉默密碼子變體用於引導兩個鏈的分泌(Simmons and Yansura，Nature Biotechnology，14629-634(1996))。具體地說，修飾STII信號序列中的核苷酸，從而使輕鏈的TIR相對強度為7和重鏈的TIR相對強度為3，而且在輕鏈和重鏈前面的信號序列其最後三個核苷酸都是GCT。在該雙-啟動子系統中，phoA啟動子序列以及抗體輕鏈和重鏈的DNA與在pS1130中的相同。
pAB3質粒pAB3設計成能在鹼性磷酸酶啟動子控制下在大腸桿菌周質中表達抗-CD18 F(ab′)2(Kikuchi等人，Nucleic Acids Res.，9(21)5671-5678(1981))並且具有一個亮氨酸拉鏈而且是His-標記的。熱穩定腸毒素II信號序列(Picken等人，Infect.Immun.，42269-275(1983))在輕鏈和重鏈之前，並且在重鏈的C-末端上融合了酵母GCN4亮氨酸拉鏈，後隨6個組氨酸殘基。輕鏈和重鏈編碼序列與重鏈基因後的λ0轉錄終止子呈多順反子構型(Scholtissek and Grosse，Nucleic Acids Res.，153185(1987))。
通過連接三個DNA片段構建質粒pAB3，所述片段中，第一片段是除去了KpnI-SphI小片段的載體pS1130。連接的第二部分是來源於pS1130的大約645鹼基對的KpnI-HindIII片段。連接的最後部分是具有下列序列的合成DNA雙鏈體5′-AGCTTGTCGGGGAGCGCCATCACCATCACCATCACTAAGCATG(SEQ ID NO6)ACAGCCCCTCGCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTC-5′(SEQ IDNO7)pAB21質粒pAB21是pAB3的衍生物，其中重鏈C-末端的6個組氨酸殘基被6個賴氨酸殘基取代。該質粒以與pAB3相同的方式進行構建，不同的是連接中所用的合成DNA如下5′-AGCTTGTCGGGGAGCGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGTAAGCATG(SEQ ID NO8)
ACAGCCCCTCGCGTTTTTCTTTTTCTTTTTCATTC-5′(SEQ ID NO9)2.表達抗-TF Fab′2 LZ-6xhis的質粒構建D3H44-F(ab′)2(亦稱pD3h44f2)用於引導抗-組織因子Fab′2亮氨酸拉鏈-6xhis產生，該質粒除HC和LC的可變區從xCD18 VL/VH變為xTFVL/VH之外，具有與pAB3一樣的主鏈DNA序列。該質粒的構建描述在2001年9月27日公開的WO01/70984中。
具體地說，首先，如下製備表達抗-TF Fab(D3H44-F(ab))的質粒用於在大腸桿菌中誘變和表達F(ab)s的質粒pEMX1已在Werther等人J.Immunol.，1574986-4995(1996)一文中描述。簡要地講，質粒含有編碼人κ亞群I輕鏈(VLκI-CL)共有序列，人亞群III重鏈(VHIII-CH1)共有序列和鹼性磷酸酶啟動子的DNA片段。VL和VH共有序列的使用已經描述在下列文獻中Carter等人，Bio/Technology，10163-167(1992)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992)。
在含有脫氧尿苷的pEMX1模板上進行定點誘變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985))。6個CDRs改為鼠D3序列；包括在各個CDR內的殘基來自CDR定義的序列(sequence-based CDR definitions)(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，Ed.5，PublicHealth Service(National Institutes of Health Bethesda，MD，(1991))，不同的是CDR-H1，它按照Kabat等人(出處同上)和Chothia等人Nature，342877-833(1989)對CDR-H1的定義，即CDR-H1定義為重鏈中H26-H35殘基的延伸。因此，D3H44-F(ab)編碼由6個完整鼠CDR序列和完整人框架(VLκ亞群I和VH亞群III)組成的F(ab)。
D3H44-F(ab′)2形成如下向D3H44-F(ab)的C-末端加入重鏈鉸鏈(CPPCPAPELLGG；SEQ ID NO10)，然後加入GCN4亮氨酸拉鏈和純化所用的(his)6標記(見上面對於pAB3亮氨酸拉鏈和hisx6標記的描述)。
3.表達抗-VEGF FA的質粒pY0317親和力成熟的抗-VEGF Fab蛋白質Y0317描述在Chen等人J.Mol.Biol.，293865-881(1999)一文中。簡要地，為了構建生產pY0317的質粒，將表達盒克隆入大腸桿菌質粒pBR322的框架中的EcoRI位點(Sutcliffe，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90(1978))。表達盒含有至少下列基本組分(1)控制轉錄的phoA啟動子；(2)終止轉錄的λt0終止子；和(3)促進翻譯的來源於大腸桿菌trp或熱穩定腸毒素II(STII)基因或者兩者的聯合的Shine-Dalgarno序列。細菌表達盒的基本組分為本領域技術人員所已知，並業已描述在例如下述文獻中Kikuchi等人，Nucleic Acids Res.，9(21)5671-5678(1981(描述phoA啟動子)；Scholtissek and Grosse，Nucleic AcidsRes.，153185(1987)(描述λt0終止子)；Yanofsky等人，Nucleic Acids Res.，96647-6668(1981)(描述trp)；Picken等人，Infect.Immun.，42269-275(1983)(描述STII)；和Chang等人，Gene，55189-196(1987)(描述trp和STII SD序列的聯合使用)。另外，STII信號序列或其沉默密碼子變體位於pY0317的輕鏈和重鏈編碼序列之前以生產抗-VEGF Fab，並引導該蛋白質分泌入周質。Picken等人，Infect.Immun.，42269-275(1983)；Simmons and Yansura，Nature Biotechnology，14629-634(1996)。為生產重組蛋白質而被插入EcoRI位點的1952-鹼基對表達盒的核苷酸和胺基酸序列示於圖1(分別為SEQ IDNOS1和2)。
使用以前描述其它抗體所用的方法(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.894285-4289(1992)；Presta等人，J.Immunol.，1512623-2632(1993)；Werther等人，J.Immunol.1574986-4995(1996))，通過使鼠A.4.6.1(Presta等人Cancer Res.，574593-4599(1997)單克隆抗體人源化而產生RhuFab V2Y0317。簡要地講，使用RT-PCR從生產鼠單克隆抗體的雜交瘤細胞中分離編碼muMAb A.4.6.1可變輕鏈和可變重鏈的cDNAs。克隆這些cDNAs並與人CL和人CH1結構域融合(Werther等人，J.Immunol.，1574986-4995(1996))，產生小鼠-人嵌合Fab。將6個互補決定區(CDRs)(圖1中粗體表示)移植入預先人源化的編碼人κ亞群I輕鏈共有序列和人亞群III重鏈共有序列的抗體載體中(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289(1992))。僅僅將CDR殘基轉入人框架就導致與VEGF抗原的結合降低1000倍。靠近CDRs的數個框架殘基(圖1中用斜體和下劃線表示)也進行改變，以改善與靶的結合(Presta等人，Cancer Res.574593-4599(1997))。總之，改變CDR以外的7個重鏈殘基和1個輕鏈殘基。然後將重鏈和輕鏈移入噬菌體-展示載體(Baca等人，J.Biol.Chem.，27210678-10684(1997))，取代phGHam-g3的hGH基因(Bass等人，Proteins，8309-314(1990))。應用定點誘變造成VL Met4Leu改變以排除蛋氨酸氧化，並造成VHThr231Leu改變以易於基因III融合物的克隆。該載體被稱為Y0101，用作起點以優化CDR與VEGF抗原的結合(Muller等人，Structure，61153-1167(1998))。據發現，僅在CDRs H1和H3的突變改善結合，將它們整合入最後版本pY0317中。由pY0101質粒變為pY0317質粒的改變是Thr28Asp，Asn31His，His101Tyr，Ser105Thr。所有這些改變均在可變重鏈區。pY0317質粒是Fab噬菌體展示載體。該質粒的質粒圖解示於圖2A。
pY0317tet20構建質粒pY0317tet20以引導rhuFab V-2在大腸桿菌中生產。圖2A和2B顯示從pY0317開始的質粒構建流程圖。質粒pY0317tet20是眾所周知的pBR322質粒的改良形式。639-鹼基對AvaI-PvuII片段已經從該質粒的pBR322部分去除。此刪除去除了參與拷貝數控制的rop基因(Cesareni等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，796313-6317(1982))。因而該質粒具有的拷貝數較pBR322稍微提高。為生產重組蛋白質，將一種有1952-鹼基對的表達盒(圖1)插入EcoRI位點中。質粒pY0317tet20對四環素和β-內醯胺抗生素均有抗性。表達盒含有單一拷貝的串聯連接的輕鏈和重鏈。由大腸桿菌phoA啟動子引導各個基因轉錄為單一雙順反子mRNA(Chang等人，Gene，44121-125(1986))。每條鏈的翻譯-起始信號由大腸桿菌STII(熱穩定腸毒素)Shine-Dalgarno序列提供。各條鏈的翻譯以23-殘基STII信號肽為起點(Picken等人，Infection and Immunity，42269-275(1983))，所述STII信號肽引導翻譯的肽跨越細胞質膜轉運進入周質間隙。然後STII信號肽被大腸桿菌前導肽酶除去。分泌進入周質後，輕鏈和重鏈摺疊成它們的天然構象並由分子間二硫鍵共價連接。
通過修飾pY0317，將四環素抗性置於最後的載體上(見圖2A和2B)。pY0317的3642-鹼基對SapI/ApaI片段包括pBR322的複製起點，β-內醯胺酶基因，phoA啟動子，整個輕鏈和重鏈(VH)氨基末端的一半，將該片段連接到p6G4V11N35A.PEG的2738-鹼基對SapI/ApaI片段上。此第二片段含有重鏈的CH1區和來自pBR322的四環素-抗性基因。此片段也包含適合於蛋白質位點-特異性修飾的位於重鏈羧基末端的額外四個胺基酸。用BssHII/HpaI消化去除包括四個額外的殘基和CH1區的區域並用pY0317的BssHII/XbaI片段取代，復原原始的重鏈序列和刪去位點特異性修飾區。先進行XbaI消化，用Klenow和脫氧核苷酸添補突出端。繼之用BssHII消化凝膠純化433-鹼基對片段。質粒的最後操作是用刪除了639-鹼基對AvaI-PvuII的pBR322的NheI/NdeI片段取代pBR322的NheI至NdeI片段。最後的質粒，pY0317tet20，抵抗四環素和β-內醯胺抗生素，並且含有phoA啟動子和編碼抗-VEGF的輕鏈和重鏈的基因。
4.表達Apo2L的質粒pAPApo2-P2RU在2001年1月4日公開的WO01/00832中描述。簡要地講，如圖3所示構建的該質粒編碼共表達的Apo-2L(胺基酸殘基114-281)和由pro2和argU編碼的tRNA′s，共表達受鹼性磷酸酶啟動子調節。基於pBR322的質粒(Sutcliffe，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90(1978))pAPApo2-P2RU用於在大腸桿菌中生產Apo-2L。如同描述質粒phGH1時所述那樣，表達Apo-2L所需的轉錄和翻譯序列由鹼性磷酸酶啟動子和trp Shine-Dalgarno提供(Chang等人，Gene，55189-196(1987))。Apo-2L的編碼序列(從114到281)位於該啟動子和Shine-Dalgarno序列的下遊，它前面是一個起始蛋氨酸。編碼序列包括編碼Apo-2L(圖4所示)的殘基114-281的核苷酸(圖4所示(核苷酸和胺基酸的序列分別為SEQ ID NOS3和4))，只不過為了消除潛在的二級結構而將編碼Pro119殘基的密碼子改為「CCG」而不再是「CCT」。編碼λto轉錄終止子(Scholtissek等人，NucleicAcids Res.，153185(1987))的序列跟隨在Apo-2L編碼序列之後。
另外，該質粒也包括用於表達tRNA′s pro2(Komine等人，J.Mol.Biol.，212579-598(1990))和argU/dnaY(Garcia等人，Cell，45453-459(1986))的序列。用PCR從大腸桿菌W3110中克隆這些基因，並置於λto轉錄-終止子序列的下遊。該質粒賦予生產宿主以四環素和氨苄青黴素抗性。
B.細胞轉化製備相關株的感受態細胞並使用標準程序用適當質粒予以轉化，選出成功的轉化細胞並在培養基中生長。對於四環素抗性質粒，從含有20μg/ml四環素(LB+Tet20)的LB平皿中選出轉化細胞，劃線-純化，在30℃含有20μg/ml四環素的LB肉湯中置于振蕩器/孵箱內生長，然後貯存於-80℃DMSO。
在質粒pxCD18-7T3和pcyc34的情況下，將另一種質粒pMS421與pxCD18-7T3或pcyc34一起共-轉化。pMS421是基於pSC101的過度表達lacIq抑制基因的質粒，該lacIq抑制基因抑制tacII啟動子的誘導直至加入IPTG以解除抑制，該基因還賦予質粒以壯觀黴素和鏈黴素抗性。該質粒提供lacIq染色體基因，該基因受控於來自lacIq株的它自身的啟動子控制，且該基因已插入相容性質粒pSC101中。
C.抗體提取通過在含有20μL 0.1mM EDTA(pH8.0)和10μL溶菌酶(6mg/ml)的500μL 200mM Tris-HCl(pH8.0)中懸浮20OD-mL細胞小團，製備大腸桿菌細胞的可溶性組分。使混合物渦旋，超聲處理7-10個脈衝，然後4℃15,000rpm離心15分鐘。離心後的上清液級分被稱作高-鹽提取物(HSE)。餘下的小團用於不溶性級分的分析。
D.蛋白質鑑定在4-12％線性丙烯醯胺梯度凝膠(購自Novex)中進行單向SDS-PAGE凝膠電泳。具體地說，使用的系統是NOVEXNuPageTM系統，由NuPAGEBis-TRJS Pre-Cast Gels組成(用於低到中分子量的蛋白)。
按照Champion等人，Electrophoresis，20(4-5)994-1000(1999))描述的那樣，進行雙向凝膠電泳，在第一方向應用固定的pH梯度(pH3-10)，在第二方向應用線性丙烯醯胺梯度(9-18％T)(購自Amersham Pharmacia Biotech)。使用銀/考馬斯染色，氨基末端測序和質譜分析聯合進行蛋白質鑑定。為了分析凝膠，按Champion等人所述(出處同上)，將大腸桿菌裂解物(～40μg蛋白質)與再水合溶液合併。18cm長pH3-10非線性固定pH梯度(IPG)的凝膠條帶(Amersham Pharmacia Biotech)用於總共50,000Vh的等電點聚焦。
按照製造商所述，將事先已上樣(Preparatively loaded)的凝膠印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(ProBlott；Applied Biosystems)上。使用20分鐘Edman循環和PVDF-電印跡蛋白序列分析用的多樣本水平流反應器，進行NH2-末端測序(Henzel等人，Analytical Biochemistry，267148-160(1999))。根據從凝膠上洗脫下來的樣本的MALDI-TOF質譜分析和毛細LC-MS(Champion等人，出處同上)，估計輕鏈特異性斑點的分子量。
E.靶蛋白種類測定如下所述，AME5TM-反相雙柱檢定法(AME5TM/Rp雙柱檢定法)用於抗-CD18 F(ab′)2 LZ滴度的測定。
F.AME5TM/RP雙柱檢定法1.儀表配置和設備以雙柱梯度布局安裝INTEGRALTM工作站(購自PerSeptive Biosytems)。含有固定在控制-孔徑的玻璃(CPG)上的抗-輕鏈(κ)Fab抗體(AME5TM)的親和柱用於捕獲靶蛋白。溫度控制在60℃的反相柱用於進一步分辨捕獲的抗體種類。活化的醛免疫親和樹脂(AL-20)，反相POROS樹脂(R220)和柱-包裝(packing)裝置，購自PerSeptive Biosytems(Cambridge，MA，USA)。CPG EmptyPEEK柱，30×2.1mm(100μm)，購自Upchurch Scientific(Oak Harbor，WA，USA)。使用ACRODISCTMPF注射器5-微米過濾器(購自Gelmar Sciences)過濾大腸桿菌樣本。
2.AME5TM抗-人κFAb (his-gly)4his-(lys)的純化含有9.4mM磷酸鈉，136.9mM氯化鈉和2.7mM氯化鉀的pH7.2的磷酸鹽緩衝液(PBS)在本文中稱作加樣緩衝液。單克隆抗體得自鼠FAb，自大腸桿菌糊狀物中純化並為了本文的目的被稱作AME5TMFAb hgk的AME5TM抗-人κFAb(his-gly)4his-(lys)3。大腸桿菌糊狀物得自27C7細胞的10-升發酵。將細胞懸浮於pH7.0的20mM磷酸鈉，0.25M氯化鈉，10mM氯化鎂和2mM咪唑中，用顯微流化器勻漿。通過添加0.2％聚乙烯亞胺(PEI)和離心，澄清大腸桿菌提取液。通過離子交換和固相金屬離子-螯合(IMAC)層析的聯合，純化已澄清的提取液。螯合SEPHAROSE FAST FLOWTM和SPSEPHAROSE FAST FLOWTM樹脂購自Amersham Pharmacia。
3.固定AME5TMFAb hgk以活化甘油-包被的CPG將純化的Fab固定到高碘酸-活化的甘油-包被的控制孔徑玻璃(CPG)上，以製備親和樹脂。使用改良的Roy等人J.Chromatography，303225-228(1984)的方法，將AME5TMFAb hgk抗體固定到活化的甘油-包被的CPG上。
用純水將乾燥的CPG弄溼，裝入層析柱，用1％偏高碘酸鈉(SigmaS-1878TM)在柱中反覆循環30分鐘進行活化。然後，將活化的樹脂洗入pH7.2的20mM磷酸鈉，0.15M氯化鈉(偶聯緩衝液)中。
在含有1μg/ml還原劑氰基硼氫化鈉(Sigma S8628)的偶聯緩衝液中，濃度大約5mg/mL的AME5TMFAb hgk抗體，在活化的樹脂層析柱中反覆循環。通過280nm處吸光度的減小來監測抗體與樹脂的偶聯。當吸光度不再減少時，用偶聯緩衝液洗下所有殘餘抗體並予以回收。用起始量和反應完成後的回收量之差確定偶聯密度，並以mg FAb/mL樹脂的形式報告。
然後，在有1μg/ml氰基硼氫化鈉的條件下，使pH8.0的1M乙醇胺(ICN，目錄號#151078)反覆循環2小時，以便使樹脂上的所有殘餘活性位點發生反應。接著，將樹脂洗入含有0.01％硫柳汞(GDL International)的偶聯緩衝液中，供貯存。該樹脂在加入任何蛋白質之前，用平衡緩衝液和待用的洗脫緩衝液預循環三次。
4.試劑和測定方法溶劑庫是溶劑1A，親和加樣緩衝液；溶劑1B，反相含水緩衝液和親和洗脫緩衝液，0.1％TFA溶於水；溶劑2A，水，溶劑2B，反相有機洗脫緩衝液，0.09％TFA/80％乙腈。注射50μL在加樣緩衝液中的大腸桿菌HSEs(1∶2稀釋)或發酵肉湯的上清液。正如通過比較空白試驗，製備試驗(production run)和來自製備試驗(production run)的親和力-捕獲(AME5TM)材料的2-D凝膠所確定的那樣，在發酵細胞提取物中發現的所有形式的抗-CD18均被這種AME5TM抗體捕獲。在降低了非特異性吸附(通過用PBS洗)後，將親和柱與反相柱連線，通過稀酸洗脫來轉移捕獲的組分。隨後用窄梯度乙腈洗脫反相柱來分辨這些組分。通過測定280nm處的吸收度進行檢測，通過與按照類似方法處理的標準品的峰面積進行比較來定量完整抗體。
G.層析圖的峰的鑑定該測定法將抗-CD18片段分辨成為五個與抗體相關的峰，它們代表下列抗體片段峰1LC-115(κ輕鏈的115個胺基酸的降解產物)峰2未裝配的游離輕鏈和穀胱甘肽化(glutathionated)-輕鏈峰3輕鏈二聚物峰4Fab-樣片段峰5Fab′2-LZ或Fab′2片段純化的批量抗-CD18 F(ab)′2釋放材料(5mg/ml)用作標準品。得自49A5/pS1130的高-細胞密度發酵的大腸桿菌提取物冷凍於-70℃並用作陽性對照。參與比較的所有樣品上樣時的細胞質量相等。
H.總HC/LC POROSTM反相測定為評定發酵生產的輕鏈和重鏈片段的總量，使用另一種反相HPLC測定法(RP-HPLC)。為了總的抗體表達，在100μL完整肉湯中添加100μL 0.2MTRIS 8.0。超聲處理10個脈衝後，加入650μL pH9的胍-HCl/50mM TRIS和50μL 2M DTT，並在室溫溫育15分鐘。加樣上柱之前，加入200μL乙腈並濾過大小-排阻旋轉柱(size-exclusion spin column)(Pharmacia)。取5μL該懸浮液，用POROSTM反相測定法分析。
對於反相方法而言，使用帶Perseptive POROSTMR-1反相柱的HEWLETT-PACKARDTM1100 HPLC。柱加熱到60℃進行測定，監測278nm處的UV吸收度。用含0.1％三氟乙酸的28％乙腈水溶液平衡柱。接著將25μL樣本加樣上柱，使用28％到38％的線性乙腈梯度洗脫20分鐘，繼之在95％乙腈中再生17分鐘並在28％乙腈中再平衡。通過與標準品比較來鑑定輕鏈峰和重鏈峰，並用HEWLETT-PACKARDTM質量選擇檢測器分析予以證實。類似地製備並分析空白試驗的發酵樣本，以決定檢驗的適當基線，在所述空白試驗中，使用相同的宿主但質粒不含重鏈和輕鏈序列。使用HEWLETT-PACKARDTM1100軟體進行峰面積積分，將標準品加入空白試驗樣本中來製作標準曲線，從而測定樣品中各種成分的相對量。
對可溶性樣品而言，按離子交換試驗所述製備裂解物。通常，用650μL6M胍-HCl，50mM TRIS-HCl，pH9稀釋100μL樣本。然後，加入50μL 2M二硫蘇糖醇(新鮮解凍的)，繼之加入200μL乙腈，在加樣到HPLC之前用0.2μm濾過器過濾。
不溶性裂解物樣品也進行類似分析，方法是將細胞提取後得到的用PBS-洗滌的不溶性小團再懸浮於100μL 0.2M TRIS 8.0中並充分混合。然後，加入pH9的650μL 6M胍-HCl/50mM TRIS-HCl，50μL 2M DTT和200μL乙腈。然後過濾樣本，使用分析可溶性裂解物樣本的相同方法分析10μL該濾過樣本。
I.CSX試驗用HPLC陽離子交換層析來分析抗-CD18 Fab′2 LZ的消化。具體而言，樣本至少1∶1稀釋，取250μl加樣到Hewlett-Packard 1090 HPLC系統上的保持在55℃的BAKERBONDJTM羧基-sulfon(CsX)50×4.6-mm柱(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)。樣品使用大約5至50mM梯度的磷酸鈉(pH7.0)洗脫14分鐘，峰通過278nm處的UV吸光度來監測。鑑定含有抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉鏈的峰，並通過與純標準品比較而予以定量。
J.細胞系構建
rhuFab′2 LZ(xCD18)發酵所用宿主是大腸桿菌W3110的衍生物(Bachmann，Cellular and Molecular Biology，Vol.2 Washington，D.C.American Society for Microbiology，1987)，pp.1190-1219)，並被命名為49A5，58B3，59A7，43H1，58H2，45F8，41H1和33D3。圖5描述大腸桿菌菌株59A7，49A5和43H1的演變。
1.49A5株49A5的完整基因型是ΔfhuA phoA ΔE15Δ(argF-lac)169 deoC2degP41(Δpstl-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr)ΔfucP ΔmalE。作為起始株的大腸桿菌W3110是大腸桿菌K-12的F′-和λ-陰性衍生物。已知它在rrnD和rrnE之間有一個染色體倒位(Bachmann.，出處同上；Hill and Harnish，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787069-7072(1981))。在Tn10插入fhuA基因後通過對Tn10的不精確切除而將fhuA基因(先前叫做tonA)從W3110上刪除。產生的菌株，1A2，對於噬菌體T1，T5和80具有抗性。
兩個刪除突變體phoA ΔE15(Sarthy A.等人，J.Bacteriol.，145288-292(1981))和Δ(arg-lac)169(Schweizer等人，Mol.Gen.Genet.，192293-294(1983))用proC基因中的連接的Tn5插入通過P1共-轉導同時引入菌株1A2中。轉座子的精確切除使proC基因復原。phoA ΔE15突變消除了鹼性磷酸酶的表達，而該Δ(argF-lac)169突變導致該菌株(稱作7C1)的lac-表型。
通過P1共-轉導來引入deoC2突變，後者消除了脫氧核糖磷酸醛縮酶表達。deoC基因座與蘇氨酸生物合成基因座遺傳連鎖。通過Tn10的插入和不精確切除可產生蘇氨酸營養缺陷型。然後，用P1噬菌體(在deoC2突變體上生長)將蘇氨酸營養缺陷型轉導為蘇氨酸原養型。所得菌株6C9不能在作為碳源的0.2％胸苷中生長，該事實證實deoC2突變體的存在。
通過轉導引入degP41(ΔPstl-Kanr)突變，一種在周質蛋白酶基因上的突變。通過用卡那黴素-抗性基因取代degP基因的一部分，從而在體外構建此種突變(Strauch and Beckwith，J.Bacteriol.，1712689-2696(1989))。這不是轉座子，但其允許利用卡那黴素抗性選擇刪除變體。所得菌株稱作23E3。
通過同質基因子作用(homogenotization)引入ilvG2096 (Valr)突變(Lawther等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78922-925(1981)。該突變修復導致野生型大腸桿菌K-12對纈氨酸敏感的移碼突變。用含有ilvG2096(Valr)標誌和氨苄青黴素-抗性基因的質粒pAH29(Lawther等人，出處同上)轉化菌株23E3。通過篩選纈氨酸抗性的氨苄青黴素-敏感的克隆，鑑定稱為33B6的菌株(該菌株自發地丟失所述質粒和獲得所需等位基因)。
最終，引入碳水化合物-利用通路上的兩種突變，使得通過簡易的碳水化合物利用試驗即可將此宿主與其它重組宿主區分開來。通過PCR構建fucP和malE的缺失突變體，並分別整合入含有β-內醯胺酶和果聚糖蔗糖酶(levan sucrase)的質粒載體中(Bass等人，出處同上)。將每個完整質粒重組至不支持該質粒載體獨立複製的W3110衍生物的染色體中(Bass等人，出處同上)。然後，用生長在W3110衍生物上的P1噬菌體將菌株33B6轉導為羧苄青黴素抗性菌株，所述W3110衍生物的染色體上整合了fucP刪除質粒。該衍生物不再表達果聚糖蔗糖酶，因此，選出蔗糖抗性菌株，從中篩選喪失羧苄青黴素抗性且不能利用巖藻糖的菌株。經PCR證實，所得菌株即49B2攜帶預計的fucP缺失。
重複這些步驟以摻入malE缺失。使用P1噬菌體將菌株49B2轉導為羧苄青黴素抗性菌株，並使其生長在所攜malE缺失質粒整合入染色體中的49B2菌株上。然後，選出蔗糖-抗性衍生物，從中篩選喪失羧苄青黴素抗性且不能利用麥芽糖的菌株，用PCR證實malE缺失的存在。
菌株49A5包括如下的重要特性·抵抗T1噬菌體。
·當磷酸鹽耗竭時(這是用於誘導產物合成的條件)，不過度生產鹼性磷酸酶。
·缺乏蛋白酶。
·對纈氨酸毒性不易感。
·能夠通過碳水化合物利用試驗與其它宿主區別開。
2.菌株58B3菌株58B3也來源於33B6菌株。通過P1轉導將Δprc::pS1080基因型(Bass等人，出處同上；Metcalf等人，Gene，1381-720(1994)引入菌株33B6(56G4)的kans衍生物中，選擇在42℃低鹽的半-強度(half-strength)LB中不能良好生長的菌落。kans菌株攜帶來源於pKS16(Strauch and Beckwith，1989，出處同上)的degP缺失，產生卡那黴素敏感的表型。因此，58b3菌株是同時攜帶degP和prc缺失的kans菌株。
58B3菌株的完全基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 KansilvG2096(Valr)Δprc。
3.菌株59A7該菌株是通過將Prc抑制基因(Spr突變體)引入58B3菌株而構建的。將51B9株(tonA prc prc sup zeg722::Tn10)的P1噬菌體裂解物轉導進入用於選擇tet-抗性菌落和篩選Prc抑制基因表型(在42℃低鹽半-強度LB中生長良好)的58B3株中。該新菌株稱作58F1。Δprc突變體在42℃不能存活，通過接種在Malloy平皿上而除去四環素-抗性基因，產生叫做59A7的tets-敏感菌株。59A7的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 deoCdegP41 IN(rrD-rrE)1 KansilvG2096(Valr)Δprc sprW148R。
原始51B9株具有Prc抑制基因Spr，後者攜帶點突變W148R，與43H1和59A7株中的Spr相同。
4.43H1株43H1株的完整基因型與49A5的非常類似W3110 ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 degP41(Δpstl-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096(Valr) ptr3 ΔompTprc::kanr sprW148R。它比49A5多攜帶三種蛋白酶標誌，Ptr3，OmpT和Prc。該株在Spr中具有點突變(W148R)。它是kanr。
5.58H2株用生長在42E3株上的P1噬菌體將43H1株轉導為tetr。該株(58F9)修復prc::kanr突變；因此，變成kans。然後，該株接種在基本葡萄糖醛酸培養基上以去除eda::Tn10。產生的新菌株58H2是kans，並變成帶有野生型prc的三重-蛋白酶突變體。58H2的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoAΔE15Δ(argF-lac)169 degP41(Δpstl-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096(Valr) ptr3 ΔompTsprW148R。
6.45F8株45F8的完整基因型是W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 degP41 KansΔompT ptr3 ilvG2096(Valr) phoS*(T104)。這是帶有三重-蛋白酶標誌的phoS株。
7.41H1株
41H1的完整基因型是適應37℃溫度(T-adapted at 37℃)的W3110ΔfhuA phoS*(T104)Δ(argF-lac)169 degP41(Δpstl-Kanr)ptr3 ilvG2096(Valr)。它是帶有兩重-蛋白酶標誌的phoS株。
8.33D3株33D3的完整基因型是W3110 ΔfhuA ptr3 lacIq lacL8 ΔompT degP41(ΔpstI-kanR).構建說明見例如美國專利5,789,199。
K.搖瓶和發酵培養為了搖瓶實驗，使用含5μg/ml AMPICILLINETM抗生素的Luria-Bertani(LB)肉湯和C.R.A.P.基本培養基。如下製備C.R.A.P.基本培養基將3.57g(NH4)2SO4，0.71g檸檬酸鈉-2H2O，1.07g KCl，5.36g酵母提取物和5.36gHYCASE SF-SHEFFIELDTM混合，用KOH調整pH為7.3，用去離子水將體積調整為872mL。然後高壓滅菌混合物並冷卻至55℃。加入110mL pH7.3的1M MOPS緩衝液，11mL 50％葡萄糖和7.0mL 1M MgSO4。
本文使用的大腸桿菌發酵工藝是上面定義的高-細胞-密度方法。為達到較高細胞密度，連續添加氨，且在發酵的某些階段添加額外的微量營養素(例如P，K，S，和Mg)以支持細胞生長。降低營養素的量，結果形成另一種方法，其中培養液最終光密度較低但產物的質量相同，該方法在本文稱作低-細胞-密度方法。
裝有在10-15％DMSO中的培養物的1.5mL單個小瓶在1L搖瓶中的500mL LB培養基中解凍，所述培養基補充有0.5mL四環素溶液(5mg/ml)和2.5mL 1M磷酸鈉溶液。將該種子培養物於30℃培養約16小時，然後用於接種10-升發酵罐。
發酵始於約6.5L的培養基，其中有約4.4g葡萄糖，100mL 1M硫酸鎂，10mL微量元素溶液(100mL鹽酸，27g氯化鐵六水合物，8g硫酸鋅七水合物，7g氯化鈷六水合物，7g鉬酸鈉二水合物，8g硫酸銅五水合物，2g硼酸和5g硫酸錳一水化物，終容積1升)，20mL四環素溶液(乙醇中5mg/ml)，10mL FERMAX ADJUVANT 27TM(或某些同等的抗-泡劑)，1袋HCD鹽(37.5g硫酸銨，19.5g磷酸氫二鉀，9.75g磷酸二氫鈉二水合物，7.5g檸檬酸鈉二水合物和11.3g磷酸二氫鉀)以及200g NZ胺A(蛋白質水解物)。發酵在30℃10進行，氣流為slpm，並控制在pH7.0±0.2(儘管在某些情況下偶有偏移超出這一範圍)。改變發酵罐的背壓和攪拌速率，以便控制發酵罐中的氧轉移速率，並從而控制細胞呼吸速率。
用取自搖瓶的含有細胞的培養基接種發酵罐後，根據計算機的計算將濃縮葡萄糖溶液添加到發酵罐中，使培養物在發酵罐中生長達到高細胞密度。需要控制pH時，也將氫氧化銨(58％溶液)和硫酸(24％溶液)添加到發酵罐中。某些情況下也進一步加入抗-泡劑來控制泡沫。當培養物達到大約40OD550的細胞密度時，向發酵罐中加入另外100mL 1M硫酸鎂。此外，當培養物達到大約20OD550時，以2.5mL/min的速度向發酵罐中加入濃縮鹽(由溶於1L水的約10g硫酸銨，26g磷酸氫二鉀，13g磷酸二氫鈉二水合物，2g檸檬酸鈉二水合物和15g磷酸二氫鉀組成)，並一直繼續到約1250mL被加入到發酵物中。發酵通常繼續72-80小時。
發酵期間，一旦達到發酵的溶解氧設定點，就根據溶解氧探測信號補加濃縮的葡萄糖溶液，以控制設定點的溶解氧濃度。因而，在這種控制模式中，對發酵罐工作參數(如能影響發酵中輸氧能力的攪拌速率或背壓)的操縱可相應地控制細胞的氧攝取速率或代謝速率。
質譜儀被用於監測發酵尾氣的組成，並能夠計算發酵中的吸攝取率和二氧化碳釋放率。
當培養至約220OD550的細胞密度時，用近12個小時將攪拌速率從開始的1000rpm降低為近725rpm。
被pMS421和pcyc34(其中tacII啟動子用於控制重鏈和輕鏈的表達)轉化的細胞，或者被pMS421和雙-啟動子質粒pxCD18-7T3(其中tacII啟動子用於控制重鍊表達)轉化的細胞，經發酵使培養物達到220OD550的細胞密度，約12小時後，加入50mL 200mM IPTG，以便誘導pcyc34的重鏈和輕鏈合成和誘導pxCD18-7T3的重鏈合成。
結果A.發現並鑑定了κ輕鏈裂解產物對懸浮在SDS樣本緩衝液(SDS凝膠電泳的常見市售產品)中的可溶性大腸桿菌提取物(見材料與方法部分的HSE)和剩餘小團進行SDS-PAGE分析。樣品來自攜帶pS1130質粒的49A5株為生產rhuF(ab)′2LZ(xCD18)而進行高細胞密度(HCD)發酵期間收集的20OD-mL小團。在可溶組分中，鑑定出κLC裂解片段，長度為115個胺基酸。在不溶性組分中，鑑定出κLC裂解片段，長度為182個胺基酸。所有這些片段轉移到PVDF膜上，並進行測序。兩者都具有正確的N-末端作為κ-LC的加工形式。用質譜分析測定質量分別是12488.5和19857.2Da。對於LC-115的蛋白水解裂解位點在殘基Val115和Phe116之間，而LC-182的蛋白水解裂解位點在殘基Ser182和Lys183之間。僅有一個位點看起來像典型的Prc剪切位點。
發酵結束時的另一份大腸桿菌20OD-mL小團(pellet)用雙向凝膠電泳分析。將該小團的大腸桿菌細胞裂解物(～40μg蛋白)與按Champion等人(出處同上)描述的再水合溶液合併。在49A5/pSS1130發酵所得細胞的2-D凝膠圖上，將所述產物凝膠與(49A5/pBR322)發酵在類似時間點所得細胞小團的空白2-D凝膠進行比較，以此鑑定κ-輕鏈-特異性斑點。小團選自兩個發酵的相同時間點，從而假定這些細胞處在可比的代謝狀況下。所有κLC斑點用鹼性磷酸酶-偶聯的抗-人κLC抗體經免疫印跡而鑑定。
除了1-D凝膠分析所鑑定兩種主要剪切物(clips)外，2-D凝膠還顯示完整LC，完整LC的同等型，和至少另外5個次要的LC-剪切物(參見圖6)。洗脫相應的斑點並測序。所有LC-特異性肽具有正確的N-末端，表明它們被充分加工，其中的STII信號被裂解。用質譜儀分析所有這些肽以測定大致的質量。由於次要剪切物的量非常少，故不能獲得正確的質量來確定那些片段的剪切位點。
有三個次要剪切物與κLC-115剪切物聚集在pI值9左右。第四個的pI值6.5左右，第五個的pI值與LC-182剪切物相同，為6左右。為判斷這些LC片段的溶解性，將相同小團的HSE加樣到2-D凝膠上。LC182片段僅存在於不溶性級分中。
B.Prc是負責裂解κ-輕鏈的唯一蛋白酶對加載了細胞的不溶性級分的1-D SDS-PAGE凝膠電泳進行比較，所述細胞源自表達抗-CD18 Fab′2 LZ分子的大腸桿菌蛋白酶突變體49A5，45F8，41H1和43H1的四個不同發酵。四種樣本中有三種出現LC-182蛋白水解性裂解(prc-缺失株43H1中沒有)，表明Prc蛋白酶可能參與κ-LC裂解。峰1對應於LC-115剪切物，它出現在49A5株(prc-陽性)的樣本中，當與AME5TM/RP雙-柱試驗所分辨的層析圖進行比較時，從43H1樣本中消失。該試驗選擇性吸附含有κ-LC的抗體類型，然後將它們分成五個峰，如上面材料與方法部分所述。
當分析43H1細胞團的2-D凝膠時，發現不僅LC-115和LC-182片段從凝膠中消失，而且所有其它LC-相關小片段也消失(見圖7)。這一結果強烈提示，Prc是負責κ-LC裂解的唯一酶。所述43H1細胞團得自低-細胞-密度發酵。
C.構建菌株以證實Prc是唯一參與κ-輕鏈裂解的酶1.prc-缺失株變成prc-陽性株通過將43H1株(帶有四重蛋白酶標誌物的prc-陰性宿主)修復變成三重-蛋白酶的prc-陽性株(58H2)，獲得Prc是參與κ-LC裂解的唯一酶的證據。菌株42E3攜帶eda-51::Tn10，其與prc可共轉導。用生長在42E3株上的P1噬菌體將43H1株轉導為tetr。修復所得菌株(58F9)以進行prc::kanr突變；因此，菌株變成kans。然後，將該菌株鋪在基本葡萄糖醛酸培養基上以去除eda::Tn10。所得新菌株58H2變成帶有野生型prc的三重蛋白酶突變體。該分離物為轉導或者自發的Eda+分離物。用PCR證實prc-陽性基因型。該58H2株仍然攜帶來源於43H1的prc抑制基因(sprW148R)且為kans。通過AME5TM/RP雙-柱試驗檢測在此58H2株中LC-剪切物的再現(見圖8)。
2.從天然菌株上刪除prc基因而變成prc-陰性菌株如上所述，49A5株是prc野生型菌株。當prc缺失被引入該菌株骨架以構建58B3株並且用AME5TM/RP雙-柱法測定細胞提取物時，LC-115剪切物(峰1)消失。該58B3株源自33B6株，後者僅僅攜帶一種蛋白酶標誌，DegP。通過P1轉導將Δprc::pS1080(Bass等人，出處同上；Metcalf等人，出處同上)引入33B6的kans衍生物(56G4)中，以產生degP Δprc兩種-蛋白酶株，59A7。
所有七個菌株其裂解結果匯總見表1。
表1表達抗-CD18 F(ab)′2亮氨酸拉鏈的大腸桿菌宿株
D.提高rhuFab′2 LZ(xCD18)在prc-陰性宿主的產量1.搖瓶結果表達rhuFab′2 LZ(xCD18)的三個菌株(49A5，43H1和58H2)首先在30℃LB肉湯+Amp中生長過夜。然後同樣地將所有培養物接種入含有25mLC.R.A.P.基本培養基+Amp的搖瓶中，並於30℃繼續搖動過夜。收集20OD-mL小團，製做可溶性裂解物(HSE)。530μl中的25μl加樣到AME5TM/反相柱中。
圖8表示由此測定法分解的五個峰的直方圖。Y軸是峰1-5(參見材料與方法)的具體峰面積。X軸表示生產rhuFab′2 LZ(xCD18)的菌株。兩個prc+株，49A5和58H2，產生幾乎等量的產物，並且兩者都顯示幾乎等量的LC-115片段(峰1)，而Δprc株(43H1)在峰1幾乎沒有產物但在峰5卻有更多產物。該圖顯示分開的抗體片段。在43H1宿主觀察到比在49A5和58H2宿主更高量的可溶的、完整的LC和LC二聚物。在搖瓶中，prc-宿主產生比天然prc菌株幾乎多5倍的rhuFab′2 LZ(xCD18)產物。
2.發酵結果基於AME5TMRP雙-柱測定法，通過標準化高細胞密度(HCD)發酵物得到的rhuFab′2 LZ(xCD18)滴度均值在野生型prc宿主(49A5，n＝6)是893mg/L。從43H1/pS1130發酵物可以觀察到滴度升高將近兩倍。43H1和49A5宿主分別在搖瓶(5x)和發酵(＜或等於2x)滴度之間的顯著差異有推測但不限於任一種意見，可能是由於產物分泌效率的不同。當分析搖瓶小團的總裂解物時，在prc-陽性基礎菌株(background)中僅僅50％抗體片段正確加工，而來源於43H1搖瓶細胞或所有發酵源自的細胞(prc-陽性和prc-陰性)其裂解物則顯示100％正確加工。發現Prc蛋白加工是secY，secA依賴性的(Hara等人，1991，出處同上)。不受任何一種意見的限制，據信搖瓶結果表明Prc蛋白與抗體片段競爭移位(translocation)。
3.測定抗體片段的總表達按照材料與方法部分所述，進行整個肉湯發酵樣本的POROSTM柱測定，以評定抗體摺疊和裝配的效率。當比較源自不同宿主的三種抗-CD18HCD發酵物的整個肉湯樣本的等量注射物(injections)時，發現43H1發酵物與49A5發酵物表達的HC量類似，但完整κ-LC的量更高(見表2)。43H1的rhuFab′2 LZ xCD18)滴度是1830mg/L，而49A5的rhuFab′2 LZ xCD18)滴度是887.8mg/L。59A7發酵物不僅產生額外的抗體片段，也產生rhuFab′2LZ(xCD18)的最高滴度，其為2403mg/L。
表2周標準化HCD發酵工藝表達rhuFab′2lz(xCD18)的不同菌株其抗體片段的總表達和Fab′2-LZ滴度
E.穩定期存活需要Prc抑制基因人們發現，攜帶degP和prc缺失的58B3株顯示，在表達抗-CD18 Fab′2LZ分子的HCD發酵物其生長的延長靜止期溶解。在接種後50小時開始細胞溶解。它僅產生320mg/L的rhuFab′2 LZ(xCD18)，而59A7/pS1130發酵物在靜止期維持良好生長直至72小時的HCD發酵物達到高細胞密度(約300OD550-mL)。圖9顯示兩種發酵物的生長比較。也發現在此菌株本底(background)中兩個HC和LC片段的超高表達，使rhuFab′2 LZ(xCD18)分子的產量提高到2403mg/L。在採自58B3和59A7prc-缺失株的樣本中，也都沒有發現κ-LC剪切物。
本文從作為自發突變即prc缺失突變體耐熱逆轉株的40A6株(prc::kanspr)分離prc抑制基因(spr)(編碼prcsup)。對該基因測序並繪製接合圖譜後，發現其位於大腸桿菌染色體上約48min處。其PCR產物的核苷酸序列與Hara等人，1996(出處同上)報導的大腸桿菌spr基因匹配，除外在胺基酸148位的一個點突變，在胺基酸148位TGG密碼子變為CGG，這導致色氨酸殘基變為精氨酸(W148R)。當將prc抑制基因引入59A7株時具有W148R突變。據報導，野生型spr基因編碼外膜部分的脂蛋白，後者被懷疑是肽聚糖-水解酶(Hara等人，1996，出處同上)。
通過與Prc抑制基因相連接的Tn10而將Prc抑制基因引入59A7株中，選出既具有四環素抗性又能夠在42℃半-強度LB低-鹽平板上生長的共-轉導子。新的點突變發生在用Malloy平皿消除Tn10的時候。
根據58B3相對於59A7株的抗-CD18 Fab′2發酵結果，證實Prc抑制基因是Δprc突變體成功生長所必需的，特別是高細胞密度大腸桿菌發酵時。該菌株被稱作58B3，其攜帶除spr(W148R)外與59A7完全相同的基因型，且50小時後在標準化HCD發酵物中不能保持存活。
F.由於Prc剪切位點的位置，Prc缺失突變體可提高各種抗體生產水平圖10顯示人源化κLC序列(SEQ ID NO5)。潛在Prc剪切物的計算的pI值示於表3。
表3潛在Prc剪切物的計算的pI值
不受任何一種意見的限制，根據圖10和表3，據信Prc蛋白酶從κ-LC的C-末端開始剪切9或18個胺基酸而成為LC序列，然後逐漸地向N-末端消化(chewed)，從而為絲氨酸特異性蛋白酶開展工作打開S/K位點。另一κLC類(或許在不同摺疊狀況下)大多裂解至115個胺基酸是可能的。許多潛在的裂解產物具有與在2-D凝膠上發現的κLC斑點匹配很好的分子量和計算pI值。
圖11表明，prc缺失株(43H1)從表達抗-VEGF Fab，抗-CD18 Fab′2 LZ，抗-CD18 Fab′2-LZ-6xHis分子和抗-組織因子Fab′2-LZ-6xHis分子的細胞中清除了LC-182剪切物。來源於cab2826(33B6/D3H44-F(ab′)2)和cab2847(43H1/D3H44-F(ab′)2)的發酵樣本是旨在表達抗-組織因子Fab′2 LZ-6xhis分子的高細胞密度發酵物。此發酵工藝是與上述抗-CD18 Fab′2 LZ發酵物所用相同的標準化HCD工藝。Cab2793是旨在表達抗-CD18 Fab′2 LZ-6xHis分子的49A5/pAB3發酵物。Cab2846是旨在表達抗-CD18 Fab′2 LZ分子的41H1/pS1130發酵物。JJ81(43H1/pY0317)和JJ67(43E7/pY0317)發酵物旨在為了製造抗-VEGF Fab。Cab2814是(49A5/pBR322)，空白髮酵物，其含有類似質粒主鏈但沒有表達抗體的基因。
用TRIS/EDTA/溶菌酶提取20-OD發酵小團以除去可溶性HSEs。其餘小團懸浮在400μL添加了20μL β-巰基乙醇的1xSDS樣本緩衝液中，然後在一加熱塊(heat block)上95℃加熱5分鐘。然後，取5μl加樣到4-12％NUPAGETM凝膠上。此33B6，41H1，49A5和43E7株是prc-陽性株。此43H1株是prc-陰性株。所有得自prc-株的天然樣本均具有19.8-kD LC降解產物。該cab2829(33B6/pD3H44TB)發酵樣本(其表達抗-TF Fab)也可檢測到相同大小的LC-降解片段。對所有這些片段進行胺基酸序列分析，發現它們具有正確的N-末端LC序列。
G.59A7株顯示在搖瓶中表達抗-CD18 His-和Lys-標記的Fab′2 LZ和Apo2L胞漿蛋白的優越性表4所示的其它搖瓶數據表明，59A7株表達pAB3(抗-CD18 His-標記的Fab′2 LZ)較43H1株和49A5株好。59A7株表達pAB21(Lys-標記的Fab′2LZ)比33B6株好2.4倍。59A7株和43H1表達pS1130(沒有標記的Fab′2 LZ)比49A5株好2.9倍。然而，發酵結果一直顯示59A7株在pS1130表達方面優於43H1株。
對於非-抗體胞漿蛋白Apo2L，表達在59A7株的比活性(specific activity)比表達在43E7株(搖瓶中)的高約20-30％。既然43E7株生長至更高的OD550，那麼總的表達也類似。43E7株是沒有prc和spr的ompT ptr3 degP株。
表4搖瓶培養物中在59A7和其它株表達的各種蛋白的更高特異性滴度
H.59A7株顯示通過發酵表達抗-CD18 Fab′2 LZ的優越性表5表明，59A7株在自雙-啟動子質粒pxCD18-7T3表達抗-CD18 Fab′2LZ方面優於33D3株，而在自質粒pcyc34表達抗-CD18 Fab′2 LZ方面優於49A5株。
表5通過發酵59A7株與使用兩個不同質粒的33D3株和49A5株相比抗-CD18 Fab′2 LZ表達的更高特異性滴度菌株 質粒 CSX測定的抗-CD18 Fab′2 LZ滴度(mg/L)(平均數)33D3 pxCD18-7T3/pMS421 250059A7 pxCD18-7T3/pMS421 400049A5 pcyc34/pMS421 341.359A7 pcyc34/pMS421 2067.1
討論在本操作中，研究了κ-LC在表達抗-CD18 Fab′2-LZ分子的大腸桿菌細胞中的降解。先前的研究已經顯示許多潛在的Prc底物，但最可確定的是(asbest as can be ascertained)，沒有人報導發現作為這種蛋白酶底物的抗體片段。本文證實Prc是在大腸桿菌細胞內部參與κLC裂解的唯一蛋白酶。此Prc蛋白似乎是選擇性地在分立的位點裂解κ-LC，這產生兩個主要的剪切物(LC-115與LC-182)和五個額外的小裂解產物，如從2-D凝膠結果中觀察到的那樣。既然主要剪切物之一是不符合Prc剪切位點特性(Keiler等人，出處同上)的S/K裂解產物，對其做了更充分地研究。現已發現，大腸桿菌細胞中κ輕鏈的降解與大腸桿菌周質蛋白酶(Prc/Tsp)有關。用分析方法(1-D/2-DSDS PAGE，質譜學和N-末端序列分析)，從採自表達抗-CD18 F(ab)′2亮氨酸拉鏈分子的各種蛋白水解-缺陷株的大腸桿菌提取物中鑑定κ輕鏈-裂解產物，證實Prc/Tsp是唯一負責κ輕鏈裂解的蛋白酶。
發現，degP prc缺失與prc抑制基因(spr突變體)的特定結合是一個能夠產生極其大量的重組蛋白質或較高比活性蛋白的獨特大腸桿菌菌株，本文用Apo2配體和活化抗體作為例證。
與野生型株或其它蛋白水解-缺陷株的抗體表達相比，本文用degP prcspr株發酵產生高細胞密度生長(達300OD或更多)和高產量的rhuxCD18Fab′2亮氨酸拉鏈產物。
在已經聯合degP prc spr的優選59A7株中，本文的發酵工藝使得72小時生產的細胞乾重為100-200g/L且伴有活化抗體產生增加超過200％。該59A7株的完整基因型是W3110 ΔfhuA phoA ΔE15Δ(argF-lac)169 deoCdegP41 IN(rrD-rrE)1 kansilvG2096(Valr)Δprc sprW148R。其親株是58B3，除沒有prc抑制基因spr外，與59A7株具有相同的遺傳標誌。此58B3株不能在大腸桿菌高細胞密度發酵工藝的靜止期持續生長。其產生的抗體產物較攜帶degP缺失標誌及其它與59A7株相同的基因型的天然prc株(49A5)低，除外49A5是卡那黴素-抗性的prc天然株，而59A7是卡那黴素-敏感的Δprc株。
因此，業已發現，prc抑制基因(spr)的存在對於degP prc缺失株，尤其在高細胞密度發酵工藝中，而且也在低細胞密度發酵工藝中良好生長並產生高水平抗體是必不可少的。
DegPΔ單一-蛋白酶突變體及其它包括degPΔ的多種-蛋白酶-缺陷株不產生超高水平的重組產物。早些時候提到的兩個菌株，degP rpoH和degPprc，比與之比較的許多其它菌株表達更多的產物，但遠非59A7株表達的那樣多。更具體地說，沒有spr抑制基因，帶有degP prc聯合的58B3株在產生抗體片段方面不顯示任何優勢，用抗-CD18 Fab′2 LZ分子作為例證。
所提供的分析結果證明表達人源化抗-CD18 F(ab)′2-亮氨酸拉鏈分子的大腸桿菌中的κLC，其裂解與周質C-末端加工蛋白(Prc)有關。Prc蛋白是唯一負責κ輕鏈裂解的蛋白酶，這通過雙向電泳和對抗體產生株的基因操作得以證明。為證實Prc蛋白酶確實是參與κLC裂解的唯一酶，當Δprc株修復成為天然prc株時，κLC-裂解產物重新出現。類似地，當prc基因從天然prc株上缺失時，LC-裂解產物消失。兩個菌株構建物均通過P1轉導進行。
另外提供的是對採自有或者沒有prc缺失的大腸桿菌蛋白水解突變體的抗-CD18 F(ab)′2-亮氨酸拉鏈分子的滴度進行比較。數據證明59A7株是抗體表達的高生產者。描述了為表達抗-CD18 F(ab)′2-亮氨酸拉鏈分子所構建的各種核酸；所有轉化進入59A7株的表達質粒都比degPΔ單一蛋白酶突變體或沒有spr的degp prc突變體產生更高量的抗體片段。另一菌株43H1，其除ompP和ptr3突變之外還具有degP prc spr的基因型，儘管43H1株與59A7中有相同的spr突變，但生長不如59A7株好，這是由於它在520位由T變為C，導致148位胺基酸由W變為R。43H1株產生的抗-CD18 Fab′2 LZ滴度高於degP株(49A5)產生的滴度，但不象59A7株在發酵罐裡產生的那樣高。
據報導，Prc蛋白酶在幾個分立的位點上裂解其底物，但卻具有相當寬泛的序列特異性(Keiler等人，出處同上)。本文業已發現，κ-LC片段的Prc裂解位點位於恆定區，該域是通常被用來構建不同人源化抗體表達質粒的主鏈序列。根據本文的結果，可以預期Prc缺失突變體將提高在大腸埃希氏菌細胞中表達的各種抗體片段(如Fab，Fab′，Fab′2(有或者沒有亮氨酸拉鏈)包含全長抗體)的滴度。也預期，抗體片段其在HC的C-末端側面帶有His標記或Lys標記序列會有幫助。
發現59A7株在表達pAB3方面優於49A5株，在搖瓶中特異表達Apo2L胞漿蛋白方面優於43E7株，並在通過發酵表達pS1130和pcyc34(pS1130的tacII啟動子副本)方面優於43H1和49A5株。此外，它在表達雙-啟動子質粒pxCD18-7T3方面優於33D3株。
實施例2材料與方法A.表達質粒質粒D3H44-F(ab′)2為實施例1所述的。
質粒pY0317tet20為實施例1所述的。
B.菌株用於xVEGF Fab表達的菌株與實施例1描述的其它菌株相似。其為大腸桿菌W3110的衍生物，命名為60C1。該60C1株的完整基因型是W3110ΔfhuA Δ(argF-lac)169 ptr3 degP41 KansΔompT ikvG2096(Valr)Δ(nmpc-fepE)ΔssrA。與45F8株相類似，其攜帶沒有prc的三重蛋白酶標誌。
43H1，59A7和33B6株全部描述在實施例1中。
C.培養方法按照實施例1所述進行搖瓶中的培養。表達xTF Fab′2 LZ-6xhis分子的搖瓶培養物的生長於30℃延續到42小時，在不同生長期取兩組樣本用來對比。在xVEGF Fab表達的比較中，雙份培養物生長，僅取24小時時間點的樣本。
D.蛋白鑑定按照實施例1描述的那樣進行2-D凝膠電泳。
結果搖瓶培養物的數據見下表6。如實施例1中對於rhuFab′2 LZ(xCD18)生產所明確的那樣，Prc-株43H1和59A7株在產物(抗-VEGF Fab′和抗-組織因子Fab′2 LZ-6xhis)產量上優於Prc+株60C1和33B6。
圖12該2-D凝膠圖表明表達抗-VEGF Fab(pY0317tet20)的prc缺失(59A7株，prc-陰性株)消除了所有降解的抗-VEGF LC和兩個降解的xVEGFHC片段(在prc-陽性株發現)，儘管在59A7發現兩個分離的HC剪切物，該剪切物為OmpT-或者Ptr3-裂解的產物。圖13該2-D凝膠圖表明表達作為異源多肽的抗-VEGF Fab(pY0317tet20)的60C1株(prc-陽性株)其含有多個降解的抗-VEGF LC和兩個降解的HC片段。
表6xVEGF Fab在prc+/-宿主和xTF Fab′2 LZ-6xhis在prc+/-宿主中搖瓶培養數據的比較
權利要求
1.一種大腸桿菌菌株，其缺乏分別編碼蛋白酶DegP和Prc的染色體degP和prc，並攜有突變的spr基因，所述突變的spr基因的產物抑制由攜有prc突變體的菌株所顯現的生長表型。
2.權利要求1的菌株，其不缺乏編碼蛋白酶III的染色體ptr3或編碼蛋白酶OmpT的染色體ompT。
3.權利要求1的菌株，其包括編碼與該菌株異源的多肽的核酸。
4.權利要求3的菌株，其中所述多肽是蛋白水解敏感性多肽。
5.權利要求3的菌株，其中所述多肽是真核生物多肽。
6.權利要求5的菌株，其中所述多肽是哺乳動物多肽。
7.權利要求3的菌株，其是用所述核酸轉化的。
8，製備多肽的方法，包括(a)培養大腸桿菌菌株，所述菌株缺乏編碼蛋白酶Prc的染色體prc但攜有突變的spr基因，所述突變的spr基因的產物抑制由攜有prc突變體的菌株顯現的生長表型，所述菌株包含編碼與所述菌株異源的多肽的核酸，致使所述核酸被表達，和(b)從所述菌株回收所述異源多肽。
9.權利要求8的方法，其中所述多肽是蛋白水解敏感性多肽。
10.權利要求8的方法，其中所述培養在發酵罐中進行。
11.權利要求10的方法，其中所述培養在高細胞密度發酵條件下進行。
12.權利要求10的方法，其中所述培養在低細胞密度發酵條件下進行。
13.權利要求8的方法，其中所述的多肽從菌株的周質或培養基中回收。
14.權利要求8的方法，其中所述多肽是抗體或Apo2配體。
15.權利要求14的方法，其中所述多肽是抗體。
16.權利要求15的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
17.權利要求15的方法，其中所述抗體是全長抗體。
18.權利要求15的方法，其中所述抗體是抗-CD18，抗-VEGF，抗-組織因子，2C4，抗-Her-2，抗-CD20，抗-CD40或抗-CD11a抗體。
19.權利要求15的方法，其中所述抗體是抗體片段。
20.權利要求19的方法，其中所述抗體片段具有輕鏈。
21.權利要求20的方法，其中所述輕鏈是κ輕鏈。
22.權利要求19的方法，其中所述抗體片段是Fab，Fab′，Fab′2或Fab′2-亮氨酸拉鏈融合物。
23.權利要求22的方法，其中所述抗體片段是抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉鏈融合物，抗-組織因子Fab′2-亮氨酸拉鏈融合物或抗-VEGF Fab，它們帶有或不帶有組氨酸或賴氨酸標記。
24.權利要求22的方法，其中所述抗體片段是抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉鏈融合物，帶有6-組氨酸標記的抗-組織因子Fab′2-亮氨酸拉鏈融合物，抗-VEGF Fab，帶有6-組氨酸標記的抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉鏈融合物和帶有6-賴氨酸標記的抗-CD18 Fab′2-亮氨酸拉鏈融合物。
全文摘要
本發明描述了一種大腸桿菌菌株，它缺乏分別編碼蛋白酶DegP和Prc的染色體degP和prc，並攜有突變的spr基因，所述突變的spr基因編碼抑制由攜有prc突變體的菌株所顯現的生長表型的蛋白。優選地，該菌株包括編碼與此菌株異源的多肽的核酸以便從中生產異源多肽。
文檔編號C12N15/57GK1526010SQ01822659
公開日2004年9月1日 申請日期2001年12月7日 優先權日2000年12月14日
發明者克裡斯蒂娜·Y·C·陳, 克裡斯蒂娜 Y C 陳 申請人:傑南技術公司