結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法

2023-06-25 09:29:31

專利名稱：結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術中色素蛋白質材料領域，具體涉及新型的結合藻紅膽素(PEB)的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法。
背景技術：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光複合物的功能組分。根據其吸收光譜和螢光光譜特徵，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(all叩hycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結合形成特定的構象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發射約 580nm的螢光；PEC吸收約570nm的可見光，發射約630nm的螢光；CPC吸收約620nm的可見光，發射約640nm的螢光；APC吸收約650 660nm的可見光，發射約660 670nm的螢光。CPE結合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。
CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(Tooley A J, Cai Y A, GlazerA N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98 (19) : 10560 10565)。與前人的方法不同，我們發現Anabaena sp. PCC7120中a"M朋基因編碼betal55裂合酶，在其它藍藻中也存在同源的betal55裂合酶。這類betal55裂合酶不僅能催化藻藍膽素PCB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成藻藍蛋白類螢光蛋白質，還能催化藻紅膽素PEB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結合生成一種新型的結合了PEB的藻藍蛋白類螢光蛋白質。藻紅膽素PEB可由H01、 PebA、 PebB協同催化生成
(Alvey， R. M., Karty, J. A. etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis inFremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and PigmentBiosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)， 2448-2463 (2003))。在絕大部分的藍藻和紅藻中，都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋白、APC脫輔基蛋白、betal55裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有異形胞的藍藻中存在PEC;隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中的APC的基因。
藻膽蛋白類螢光蛋白質可以應用於食品、化妝品、醫藥和生物工程領域。目前使用的藻膽蛋白類螢光蛋白質主要從藍藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723，2002.04.17。 一種水華藍藻製備藻藍蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產新型的藻藍蛋白。藻藍蛋白類螢光蛋白質具有優良的螢光性質，這種結合PEB的新型藻藍蛋白，為開發新型螢光探針提供了更多的選擇。本方法為藻藍蛋白類色素蛋白質功能材料應用於食品、化妝品、醫藥和生物工程領域奠定了基礎。

發明內容
本發明的目的在於提供一種結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，它是應用betal55裂合酶催化PEB與藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結合，從而製備新型藻藍蛋白類螢光蛋白質(天然狀態下藻藍蛋白類脫輔基蛋白是與PCB結合)。將含有betal55裂合酶基因、藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表達質粒依次轉入宿主菌，得到相應的工程菌，通過如此設計的基因工程菌生產新型藻藍蛋白類螢光蛋白質。
本發明的技術方案是這樣的 一種結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆於表達載體中，得到betal55裂合酶表達質粒；
(2) 用基因工程方法，將藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆於第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和peZ^或其同源基因克隆於第三個表達載體中，得到力o7和pe/^表達質粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因peM或其同源基因克隆於第四個表達載體中，得到pe^表達質粒；
(5) 將betal55裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、力o7和pe力5表達質粒及peW表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程生產結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質；發酵後，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質。
本發明的技術方案也可以是這樣的 一種結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備
方法，包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基 因或其同源基因同時克隆於表達載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達質粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和/^力5或其同源基因克隆於第 三個表達載體中，得到Z o7和； e/^表達質粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因peW或其同源基因克隆於第四個表 達載體中，得到peW表達質粒；
(4) 將betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達質粒、力o7和pe65表達質粒及/ eM表達質粒 依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應用此工程 菌通過發酵工程生產結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質；發酵後，按常規蛋白質提純技 術，提純得到相應的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質。
上述結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法中，所述的宿主菌為大腸杆；所 述的betal55裂合酶基因是指與^a/ ae朋sp. PCC7120中3"MW基因同源的基因；所述的 藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^afee朋sp. PCC7120或M J柳i/ os"s sp. PCC7603中 M"基因同源的基因。
本發明與現有技術相比，具有以下優點
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產藻藍蛋白類螢光蛋白質，大腸桿菌繁殖快， 可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節省能源；
3、 通過大腸桿菌生產，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結合PEB的新型藻藍蛋白，具有與天然藻藍蛋白不同的光譜特性，為發展螢光藻 膽蛋白類色素蛋白質功能材料提供更多選擇。


圖l為本發明中A115339催化下生成的結合PEB的藻藍蛋白類螢光蛋白質的吸收與螢光 光譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為螢光光譜。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步地詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。 實施例1
實施例1:
(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋&e朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， h肌V70s〃s sp. PCC7603和CaJ"力ri;f sp. PCC7601部分序列己經測定。力/ a6a朋a sp, PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ c5、 a〃5"JJ久Z o7); M Ja/w'/7as"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpci9); CW"力r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和peZ^)。通過基因工程方法，將勘s&e朋 sp.PCC7120中的a^5^J9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-aJ^5J3A在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將」朋6朋朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/ c^克隆於Novagen公 司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-cpM，在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白 B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因c; "在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因 W7MW在pETDuet-l中，處於第二個多克隆位點勘/II和J力o I之間；PEB合成酶基因是3 個(力o厶peM和peM)，力o7和/ eZ^在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位 點7Vfco I和屍W I之間，/ eM在第二個多克隆位點A^e I和J力o I之間，在pACYCDuet-1 中第二個多克隆位點5g7II和Wol之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-a^53J久pET30-c; c仏pCDFDuet-力o7-; eZ^和pACYCDuet-; e似轉入大 腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7.0的 LB培養基中，37。C振蕩培養至0仏。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過狙2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。其吸收與螢光光譜見附圖1中所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為螢光光譜。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式如下
從新鮮塗布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種於5mLLB培養基，37°C振蕩培養過夜;取100pL飽和培養物，無菌轉接至5mL LB培養基，37。C振蕩培養至0D6。。=0. 3 0.4時，將菌液轉移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lniin (10000g， 4'C)棄去上清，收集沉澱菌體；用lmL預冷的O. lmol/LCaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g， 4°C)去上清，菌體沉澱用10(^L預冷的0.1mol/L CaCl2重懸，放置於冰上，加入一定量的構建好的質粒，混勻後冰浴放置30min， 42'C熱休克90s，冰浴5min後加入300nL LB培養基，37°C低速振蕩培養45min，無菌塗布在含有相應抗生素的LB培養基平板上，倒置於37。C培養箱至形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，振蕩培養至飽和；分別從中取lOO)aL轉接至5ml含相應抗生素的LB培養基中；37°0振蕩培養至0D6。。=0. 5-0. 7時，冰浴約30min，加入IPTG誘導表達；避光、2CTC、 150轉/分，表達約12小時。離心收集細胞，細胞加入緩衝液重懸；通過光譜儀測其產物螢光量，選取螢光產量高的菌株進行大量表達。
實施例2
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^ a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成，yK ^7M'/7oms sp. PCC7603和CW"/ r"sp. PCC7601部分序列已經測定。sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc仏W7MJ義力o/);M 7a/77i/70ws sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpc^); CW"Ari;f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe/^)。通過基因工程方法，將力朋6朋朋sp.PCC7120中的a775^39基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-aL 533仏在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^a&e朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-cpc^(C84S)，在大腸桿菌中能表達脫 輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因c;x^(C84S)在pET30中是在ScoRV和Z力o I兩個酶切位點之間；裂合 酶基因a^5JJ^在pETDuet-l中，處於第二個多克隆位點5g7II和i7wl之間；PEB合成酶基 因是3個(力o厶peM和/ eM), Z o7和； e/^在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個多 克隆位點餘ol和屍WI之間，在第二個多克隆位點7fefel禾[]J7 oI之間，pe似在 pACYCDuet-1中第二個多克隆位點餘JII和化ol之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-aWMW、 pET30-cpc飢C84S) 、 pCDFDuet-Z o7-pe/^和pACYCDuet-peW 轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0 的LB培養基中，37'C振蕩培養至0Ds。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入 緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類 螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例3
(1)從GeneBank中可以査到，藻種勘a/w， sp. PCC7120的全序列已經測定完成， ^ Ja/zuV7as〃ssp. PCC7603和Ca〗"/ r^sp. PCC7601部分序列已經測定。^ aZ ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc仏a775^3久 M7a/wV os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc5); Ca7oz^ri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe/^和peZ^)。通過基因工程方法，將^^&e/7a sp.PCC7120中的a775JJ9基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/7c5克隆於Novagen公司的 pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-c/x^"W^^郛，在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白類脫輔基 蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peZ^)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-Z o7-pe/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(z eM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因c;x^和裂合酶基因aWMJ9在pETDuet-l中，cpc^處於第一個多克 隆位點，酶切位點是￡coR I和屍"I ， a^5^J^處於第二個多克隆位點^gill和i7w I之間； PEB合成酶基因是3個(力o入peM和； eZ^)，力o7和pe/^在同一個載體pCDFDuet-l中，/ o7 在第一個多克隆位點辰o I和屍sU之間，peM在第二個多克隆位點AWe I和J/ o I之間，pe似 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點勘JII和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-cpc&aWSJJA pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-peZ^轉入大腸桿菌， 當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7.0的LB培養基 中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細 胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅 膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例4(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力朋朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， yK sp. PCC7603和CaJ"力W;rsp. PCC7601部分序列已經測定。^朋Z ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c/7c5、 aL^ J久力o7); 尨"/m'770s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc5); C3J"/ n';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和々eM)。通過基因工程方法，將」朋力ae朋 sp. PCC7120中的a775^J9基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)克隆於Novagen公 司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-c々c5 (C84S) -a^MJA在大腸桿菌中能表達藻藍 蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和； eM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o -pei^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因(C84S)和裂合酶基因a"M39在pETDuet-l中，c; c^處於第 一個多克隆位點，酶切位點是^coR I和屍"I , a^5J滯處於第二個多克隆位點^71I和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o入peM和pe/^)，力o7和； eZ^在同一個載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個多克隆位點Abo I和I之間，； eM在第二個多克隆位點yWe I和J力o I 之間，/ e^在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點份JII和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-cpc5 (C84S) -a^55J久pCDFDuet-Z o -peM和pACYCDuet-pe^轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH7.0的 LB培養基中，37。C振蕩培養至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例5
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^ a力ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成，vK 7朋w'"osiAS sp. PCC7603和CW"/ rj>sp. PCC7601部分序列已經測定。J"a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏a^5^J久力o7);J/.^/w'/7oms sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpc必；CaJ"力riz sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和/ eM)。通過基因工程方法，將^ 3力ae朋sp.PCC7120中的3醜5"^基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-a7753J9，在大腸桿菌中能表達betal 55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a6ae朋sp. PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^克隆於Novagen公司的表達載體pCOLADuet-l中，所得質粒叫pC0LADuet-cpc5，在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o 和/^6幼克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^,在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-peM,在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc^在pCOLADuet-l第一個多克隆位點^coR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a^5J3^在pETDuet-l中，處於第二個多克隆位點^^1I禾[！ i7 oI之間；PEB合成酶基因是3個(力o入pe^和pe/^)，力o7和pe力5在同一個載體pCDFDuet-1中，力o/在第一個多克隆位點Afco I和屍W I之間，peM在第二個多克隆位點AWe I和/力o I之間，pe^在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點設JII和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把
所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同
11樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-aW5"M久pCOLADuet-cpc厭pCDFDuet-力o7-; e/^和pACYCDuet-peW轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例6
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種/!朋/ a謹sp. PCC7120的全序列己經測定完成，#."肌'"os"s sp. PCC7603和sp. PCC7601部分序列已經測定。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc5、 3L^ J義力oO;# 7ayw'/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序列中找到所需基因(cpcv9); Ca"t力n'x sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe/^)。通過基因工程方法，將^a&e朋印.PCC7120中的a77MJ9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-a^5JJA在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a力朋朋sp.PCC7120中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cp"(C84S)克隆於Novagen公司的表達載體pC0LADuet-1中，所得質粒叫pC0LADuet-cpc5(C84S),在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-Z o卜peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)在pC0LADuet-1第一個多克隆位點化oR I和Pst I兩個酶
12切位點之間；裂合酶基因a^MW在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點^^711和J/w I之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶和peZ^)，力o7和/ eM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點I和屍"I之間，peM在第二個多克隆位點M/e I和J力o I之間，； e/^在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點和I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aW5^3P 、 pC0LADuet-cpc^(C84S) 、 pCDFDuet-Z o7-peZ^和pACYCDuet-;^W轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至OD柳為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37t:振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例7
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^a/ ae朋sp.PCC7120的全序列己經測定完成，必7a/w'/ os"s sp. PCC7603和CWotArixsp. PCC7601部分序列已經測定。」朋&e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019,可從所查到序列中找到所需基因(cpc5、 a^5^3久
J柳i/ owAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpt^); CW"Ar^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe^^)。通過基因工程方法，將力朋tee/7asp.PCC7120中的s775339基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-W753J9，在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將髮J柳i/7awssp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc5克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-c/^A在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-力o7-在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質粒叫pACYCDuet-/ eM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpcA在pET30中是在fcoRV和iT oI兩個酶切位點之間；裂合酶基因a^MW在pETDuet-l中，處於第二個多克隆位點A^II和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o7、 / e/^禾n/ eZ^)，力o7和pe/^在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個多克隆位點I和屍st I之間，peM在第二個多克隆位點AWe I和i7 o I之間，； e/^在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點％711和化ol之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-aWMJA pET30-cpc厭pCDFDuet-Z o卜; eZ^和pACYCDuet-pe^轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7.0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。實施例8
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^7a&e朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成，7柳i/ os"s sp. PCC7603和CaJ"/ r&sp. PCC7601部分序列已經測定。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc從a"53J義力o/);必7a77i/3os^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(c/ c)9); 6^"/ n';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
14AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和； eM)。通過基因工程方法，將力朋6ae朋sp.PCC7120中的a^5J滯基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-a^5^JA在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將必^/w'/7M^ sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpcMC84S)克隆於Novagen公司的表達載體pET30中，所得質粒叫pET30-"cMC84S)，在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-/ o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e^)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質粒叫pACYCDuet-; eZ^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5(C84S)在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a"M滯在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點處7II和J/ oI之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶peM和peM)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-l中，Z o7在第一個多克隆位點vVcoI和屍WI之間，peM在第二個多克隆位點M/el和Z力ol之間，在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點5^11和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-a^5^3義pET30-c/ c5(C84S) 、 pCDFDuet-力W-peZ^和pACYCDuet-/ e^轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L, 20。C至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。 實施例9
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^/7a6ae朋sp. PCC7120的全序列已經測定完成， 7a/M'"aszAssp. PCC7603和"Joz^ri義sp. PCC7601部分序列已經測定。力/7a力ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc仏a7^^^久力o7); M 7a/w'/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc5); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(; eM和peZ^)。通過基因工程方法，將^7a力ae"a sp. PCC7120中的a^5JJ9基因和7a肌'/ ostAS sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因 cpc^克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpc5"aL^5^J"在大腸桿菌 中能表達藻藍蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o/-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5和裂合酶基因a7^^39在pETDuet-1中，cpc^處於第一個多克 隆位點，酶切位點是^boR I和At I ， a^MW處於第二個多克隆位點^WII和Z力o I之間； PEB合成酶基因是3個(力o7、 peM和peM)， 7 o7和； eM在同一個載體pCDFDuet-l中，力o/ 在第一個多克隆位點Abo I和屍"I之間，peM在第二個多克隆位點AWe I和J力o I之間，pe^ 在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點^^1I和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-c; c&aW5^3久pCDFDuet-力o卜pe/^和pACYCDuet-/ e/W轉入大腸桿菌，
當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37。C振蕩培養至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例10
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經測定完成，;K 7a/MV7a Ay sp. PCC7603和CaJot力ri;f sp. PCC7601部分序列已經測定。^朋Z ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏a7753J久力o7);
7a/M'/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(c/7C歷；C3J"/ r& sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(/ eM和peM)。通過基因工程方法，將力朋6ae朋sp. PCC7120中的a^5"JJ^基因和尨^肌V70s"s sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc沃C84S)克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫pETDuet-cpc沃C84S)-a^5^W，在大腸桿菌中能表達藻藍蛋白類脫輔基蛋白B和betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe力歷克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質粒叫pCDFDuet-力W-在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpc5 (C84S)和裂合酶基因aL M滯在pETDuet-1中，cpc^處於第一個多克隆位點，酶切位點是&dU和屍"I ， s^M滯處於第二個多克隆位點^71I和i7wI之間；PEB合成酶基因是3個(力o入paM和peM)， Z o7和peZ^在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和戶"I之間，peM在第二個多克隆位點M/e I和J力o I之間，peZ^在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點和屈o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4)將pETDuet-c/ c5 (C84S) -W75^3R pCDFDuet-力o7-pe/^和pACYCDuet-pe/W轉入 大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的 LB培養基中，37'C振蕩培養至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(5-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細 胞後，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅 膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例11
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋力ae/ a sp. PCC7120的全序列已經測定完成， ;K 7a肌V os"ssp. PCC7603和CaJ"力ri義sp. PCC7601部分序列已經測定。力朋6ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(c/ c仏aW5J^^、 Z o7); 必7a肌V70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc^); CaJ"/ ri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(/ eM和peM)。通過基因工程方法，將^3&e朋 sp.PCC7120中的aL 5JJ9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-1中，所得質粒叫 pETDuet-a^5J^^，在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將M7柳j'/ omssp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因cpc^克隆於Novagen 公司的表達載體pCOLADuet-l中，所得質粒叫pC0LADuet-c;x^，在大腸桿菌中能表達脫輔基 蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和克隆於Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-z eZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質粒叫pACYCDuet-/ e似，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因"c5在pC0LADuet-1第一個多克隆位點fcoR I和Pst I兩個酶切位點之間；裂合酶基因a775"JJ^在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點《^HI和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o入/5eM和peZ^)，力o7和peM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o/在第一個多克隆位點Afco I和屍W I之間，; eM在第二個多克隆位點7W/e I和義力o I之間，peM在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點5Wn和之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-aW5"息pC0LADuet-，仏pCDFDuet-力。7-peM和pACYCDuet-peM轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
實施例12
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種」朋6a, sp. PCC7120的全序列已經測定完成，M 7a肌'/7os"s sp. PCC7603和CaJ"力n;sp. PCC7601部分序列已經測定。」"a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c/ c仏3775^3義力o/);M 7a肌V o^As sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(cpc5); C^"Ark sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peW和peM)。通過基因工程方法，將^s力ae朋sp.PCC7120中的W75^J9基因克隆於Novagen公司的pETDuet-l中，所得質粒叫pETDuet-a77533義在大腸桿菌中能表達betal55裂合酶。
根據GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下遊引物中設計的酶切位點，把目標片段轉入相應質粒中同樣的酶切位點上。
(2) 將必^肌'/7o^s sp. PCC7603中的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因c/x^(C84S)克隆於Novagen公司的表達載體pCOLADuet-1中，所得質粒叫pCOLADuet-cpc5(C84S)，在大腸桿菌 中能表達脫輔基蛋白藻藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆於Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質粒叫pCDFDuet-力o7-; eZ^，在大腸桿菌中能同時表達HOI和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eM)克隆於Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質粒叫pACYCDuet-/ e^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因cpcS(C84S)在pC0LADuet-l第一個多克隆位點￡boR I和Pst I兩個酶 切位點之間；裂合酶基因a"5^39在pETDuet-1中，處於第二個多克隆位點5《71I和J力o1 之間；PEB合成酶基因是3個(力o厶； e^和/ eM)，力o/和/ e/^在同一個載體pCDFDuet-1 中，力o7在第一個多克隆位點tVco I和屍st I之間，/ eM在第二個多克隆位點We I和J力o I 之間，在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點5《JII和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據基因序列設計引物，分上下遊， 一對；上遊下遊引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產物轉化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aW5JJ9 、 pCOLADuet-cpcS(C84S) 、 pCDFDuet-力o7-peZ 5和 pACYCDuet-pe/^轉入大腸桿菌，當這些質粒都轉入大腸桿菌後得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種於pH 7. 0的LB培養基中，37'C振蕩培養至0D卿為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1畫1/L， 2(TC至37 'C振蕩表達約12小時，生產藻藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B;離心收集菌體細 胞，加入緩衝液、破碎細胞後，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻 藍蛋白類螢光蛋白質藻紅膽素-藻藍蛋白B。
將所用到的質粒的組合轉入大腸桿菌中的轉化方式與實施例1相同。
上述製備方法適用於採用各種藍藻中的betal55裂合酶、藻藍蛋白類脫輔基蛋白、藻紅 膽素生物合成酶基因或其同源基因來製備藻藍蛋白類螢光蛋白質，但涉及到微生物菌種公開 的問題，本發明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍藻」朋6朋朋sp. PCC7120和已經部分 測序的M ^3肌'/7os^ sp. PCC7603和CsJ"力r^ sp. PCC7601為例對本發明方法加以說明，本 領域的技術人員可以根據上述公開的內容採用其它原料實施本發明。
權利要求
1. 一種結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，其特徵在於包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta155裂合酶基因或其同源基因克隆於表達載體中，得到beta155裂合酶表達質粒；(2)用基因工程方法，將藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆於第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因ho1和pebB或其同源基因克隆於第三個表達載體中，得到ho1和pebB表達質粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆於第四個表達載體中，得到pebA表達質粒；(5)將beta155裂合酶表達質粒、脫輔基蛋白表達質粒、ho1和pebB表達質粒及pebA表達質粒依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發酵工程生產結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質；發酵後，按常規蛋白質提純技術，提純得到相應的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質。
2. —種結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，其特徵在於包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因和藻藍蛋白類脫輔基蛋白基 因或其同源基因同時克隆於表達載體中，得到betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達質粒；(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力W和pe/^或其同源基因克隆於第 三個表達載體中，得到/ o7和pe6^表達質粒；(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因/^M或其同源基因克隆於第四個表 達載體中，得到pe^表達質粒；(4) 將betal55裂合酶和脫輔基蛋白表達質粒、力o 和pe/^表達質粒及表達質粒 依次轉入配套的宿主菌，當這些表達質粒都轉入宿主菌後，得到相應的工程菌，應用此工程 菌通過發酵工程生產結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質；發酵後，按常規蛋白質提純技 術，提純得到相應的結合藻紅膽素的藻藍蛋白類螢光蛋白質。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的betal55裂合酶基因是指與 力朋6ae朋sp. PCC7120中a^^JJ^基因同源的基因。
5. 根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因是 指與力朋6朋77a sp. 0:7120或尨7<3^'"0 ^ sp. PCC7603中c; t^基因同源的基因。
全文摘要
本發明公開了一種結合藻紅膽素(PEB)的藻藍蛋白類螢光蛋白質的製備方法，是通過應用藻膽蛋白beta155裂合酶催化藻紅膽素與藻藍蛋白類脫輔基蛋白共價結合，製備結合PEB的藻藍蛋白類螢光蛋白質。本發明的方法應用生物過程生產藻藍蛋白類螢光蛋白質，是一種環境友好的生產方法，藻藍蛋白類螢光蛋白質能應用於食品、保健與醫藥功能材料領域，特別是應用為生物和醫學分子監測領域的螢光探針。
文檔編號C12N15/60GK101475950SQ20081002562
公開日2009年7月8日 申請日期2008年1月3日 優先權日2008年1月3日
發明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發有限公司;華中科技大學