用於確定心血管疾病的風險的手段和方法

2023-06-24 19:16:41 2

專利名稱：用於確定心血管疾病的風險的手段和方法
用於確定心血管疾病的風險的手段和方法本發 明涉及醫學，具體涉及內科醫學和/或心臟病學。心血管疾病技術上包括影響心血管系統的任何疾病。然而，其通常用於指與動脈粥樣硬化相關的那些疾病。在美國和大多數的歐洲國家中，心血管疾病是死亡和殘疾的第一起因。檢測到心臟問題的時候，潛在的起因(動脈粥樣硬化)通常是相當晚期了，已經進展了數十年。因此，不斷增強的重點在於通過改進風險因素諸如健康飲食、運動和避免吸菸來預防動脈粥樣硬化。冠心病(或冠狀動脈疾病(CAD))是指冠狀循環不能為心肌和周圍組織提供充足的循環。CAD是複雜的疾病，其被認為是由很多遺傳因素、環境因素及這些因素中的相互作用引起的。事實上，已經鑑定了 CAD的很多風險因素，包括吸菸、高齡、男性性別、糖尿病、高收縮壓、心絞痛的個人史、高脂肪飲食、傳染原(infectious agent)、肥胖、增加的血楽；總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)膽固醇、增加的血漿甘油三酯及降低的血漿高密度脂蛋白(HDL)膽固醇。然而，家族史是CAD最重要的獨立風險因素之一，且孿生子研究還表明遺傳因素有助於CAD的發展。CAD的高死亡率、遲發性及家族中的擬表型造成的複雜化也在這個重要疾病的遺傳解剖中呈現出大的挑戰。CAD的主要起因由緩慢發展的動脈粥樣硬化斑塊的形成和急性血栓性閉塞事件組成,導致了缺血性的併發症。由於CAD代表了人的發病率和死亡率的主要起因，存在對創新的診斷策略和治療策略的需要。目前，很難準確地預測受試者在將來是否會發展成CAD。現在，這是通過風險計算器來完成的，其並非非常準確。而且，本領域已知的風險計算器不能預測受試者是否已經緩慢地發展成斑塊形成，或是否處於急性閉塞性事件的風險中。一些臨床測試可用來評估個體是否患有心血管疾病，比如冠狀動脈或外周動脈的變窄。例如，心電圖、壓力測試(運動心電圖)、超聲心動圖、驗血(用於測試某些脂肪、膽固醇、糖和蛋白質的反常水平)被用於診斷的目的。然而，這些測試中沒有一個能可靠地預測個體患心血管疾病諸如冠狀或外周動脈疾病的風險。因此,存在對新的生物標誌物(biomarker)的需要，所述生物標誌物能夠更可靠地預測心血管疾病的風險。本發明的目的是提供用於給處於患心血管疾病的風險中的受試者的樣品分型及用於鑑別和/或治療患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者的手段和方法。本發明的又一目的是提供用於鑑別在心血管疾病治療中有用的藥物及用於監測這樣的治療的方法。本發明通過測量存在於所述患者的樣品中的miRNA，提供用於給樣品分型及鑑別和/或治療患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的患者的手段和方法。本發明還提供用於鑑別新的心血管疾病治療的手段和方法。本發明首次顯示出miRNA在血小板中的表達水平的改變與心血管疾病相關。很多人尋找心血管疾病的遺傳生物標誌物，但是從未有人用血小板來完成。例如，已經顯示，循環的miRNA是對於AMI的診斷有用的生物標誌物2_4。據報導，心肌損傷後，miR-1和miR-208兩者在血漿中是升高的。然而，可能的是，這些miRNA是自受損的心肌細胞釋放到血流中，例如因為在出院的AMI患者中，miR-1的水平恢復正常。與在心血管疾病的急性期中考察循環的miRNA的這些研究相反，本發明人是在心血管疾病的穩定期中考察存在於血小板中的miRNA，其中釋放自例如受損的心肌細胞的miRNA不再起作用。而且，由本發明人所發現的miRNA在之前的研究中並未被發現，因為在本發明之前，尋找與心血管疾病相關的miRNA的其它人並未尋求miRNA在血小板純化樣品(例如，富含血小板的血漿)中的水平。相反是在急性心血管疾病過程中測定例如血漿樣品中的miRNA水平。然而，在急性心血管疾病的過程中，幾種miRNA在全血或血漿樣品中是被上調和/或下調的(即，異常調節的)。這些異常調節的miRNA包括釋放自受損的心臟細胞的miRNA，而且包括例如釋放自對心臟損傷起作用的活化白細胞的miRNA。同時，通常伴隨急性心血管疾病的缺血性損傷已經對血或血漿中的幾種miRNA的表達水平產生影響。之前的任何研究沒有鑑別在本發明中被鑑別為心血管疾病的預測性風險因素的miRNA，因為這些miRNA沒有以允許通過由發明人所使用的篩選法(微陣列)來測定CAD患者和健康對照之間的I. 5-2倍的差異的高水平存在於心血管疾病的急性期的全血中微陣列，這種篩選方法是測試大量的總miRNA所需要的。 通過使用在血小板方面相對純的樣品即富含血小板的血漿樣品，發明人能夠鑑別存在於血小板中且在處於風險中但還未患有急性心血管疾病的受試者中被異常調節的miRNA。這些miRNA充當處於患心血管疾病的風險中的受試者的生物標誌物，且因此可以用作預測性的生物標誌物。miRNA是通過抑制mRNA的翻譯或促進mRNA的降解來抑制蛋白質合成的小的核酸分子。繼成為正常發育和生理學的重要調節器之後，已經將miRNA的異常調節的表達與許多人類疾病相關聯。結果，認為人的miRNA作為生物標誌物是非常有用的。最近，已經發現了微RNA通路在無核血小板中的存在1O現在，本發明提供這樣的見解血小板miRNA的表達特徵(expression profile)在確定受試者是否患有心血管疾病或是否處於患心血管疾病的風險中是有用的。例如，本發明表明，在與健康對照的血小板相比時，特定的miRNA在患有CAD的患者的血小板中被差異表達。在第一個實施方式中，本發明提供用於測定受試者是否處於患心血管疾病的風險中的方法，該方法包括用所述受試者的樣品來測定至少一種miRNA的(相對)表達水平，所述 miRNA 選自由 miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsaiiR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物(orthologue)組成的組，且將所述至少一種miRNA的表達水平與參考值進行比較，其中所述比較的結果指示所述個體是否患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中。優選地，所述方法為體外方法。所述參考值優選地是通過使用參考樣品來測定所述至少一種miRNA的表達水平而得到的，參考樣品優選地來自未患有心血管疾病或未處於患心血管疾病的風險中的受試者。在優選的實施方式中，所述miRNA選自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述miRNA為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物。在另一個更優選的實施方式中，所述miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物。沒有必要同時測定參考值和測試值兩者。例如，可能的是，優選地使用來自未患有心血管疾病或未處於患心血管疾病的風險中的受試者的樣品來測定參考值且反覆使用所述參考值以測定測試樣品中的所述至少一種miRNA的相對表達是否是患心血管疾病的個體風險的指示。可能的是，將已經表明是患心血管疾病的低風險的指示的表達水平用作參考值，例如來自健康個體的許多樣品中的miRNA的平均水平。另一方面，還可能能夠的是，將已經表明是心血管疾病或患心血管疾病的高風險的指示表達水平用作參考值。例如，這樣的參考值是用患有心血管疾病的個體的樣品而得到的。因此，通過將所述受試者的樣品中的任何上述miRNA的表達水平與健康個體的樣品中的表達水平或與患有心血管疾病的個體的樣品中的表達水平進行比較，測定受試者是否處於患心血管疾病的風險中是可能的。與健康個體的表達水平相當的表達水平是所述受試者未處於心血管疾病的風險中的指示。與患有心血管疾病的個體的表達水平相當的表達水平表明所述受試者處於患心血管疾病的風險中。關於相當是指表達水平優選地小於I. 8倍的差異，更優選地小於I. 5倍的差異，更優選地小於I. 3倍的差異，最優選地小於I. 2倍的差異。優選的是，在根據本發明的方法中測定選自由miR-545 :9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少兩種miRNA的表達水平。優選的是，所述 至少兩種 miRNA 中的至少一種為 hsa-miR-340* 或 miR-624*,或 hsa-miR-340* 或 miR-624*的同源物或直系同源物。更優選地，所述至少兩種miRNA中的至少一種為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物。在優選的實施方式中，所述至少兩種miRNA中的第一種為hsa-miR-340或hsa-miR-340的同源物或直系同源物,且所述至少兩種miRNA中的第二種為miR-454或miR-454的同源物或直系同源物。更優選地，在根據本發明的方法中測定選自由 miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少三種，更優選地至少四種，更優選地至少五種，更優選地至少六種，更優選地至少七種，最優選地至少八種miRNA的表達水平。在受試者的樣品中測定幾種上文所述的miRNA優選地導致了受試者患心血管疾病的風險的更為準確的評估。例如，本發明表明，如果測定了 hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合本發明的至少一種其它miRNA的表達水平，優選地為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達水平和/或miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物的表達水平，與如果測量了這些miRNA中的僅僅一種的表達水平相比，可以更為準確地測量受試者患心血管疾病的風險。同樣也適用於測定miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達水平聯合本發明的至少一種其它miRNA的表達水平，優選地為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平和/或miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物的表達水平。因此，在優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中測定至少兩種miRNA的(相對)表達水平，其中所述至少兩種miRNA中的第一種為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，且其中所述至少兩種miRNA中的第二種選自由miR-624*、miR-454*、miR-545 :9· I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組，該方法還包括將所述至少兩種miRNA的表達水平和參考值進行比較，其中所述比較的結果指示所述個體是否處於患心血管疾病的風險中。
在更優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中所述第二種miRNA選自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在甚至更優選的實施方式中，所述第二種miRNA為miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物。在最優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中所述第二種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物,所述方法還包括測定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的(相對)表達水平，且將所述第一種miRNA、第二種miRNA及又一種miRNA的表達水平與參考值進行比較，其中所述比較的結果指示所述個體是否處於患心血管疾病的風險中。在另一優選實施方式中，提供根據本發明的方法，其中測定至少兩種miRNA的(相對)表達水平，其中所述至少兩種miRNA中的第一種為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，且所述至少兩種miRNA中的第二種選自由hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545 9. l、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR_1280 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直 系同源物組成的組，該方法還包括將所述至少兩種miRNA的表達水平和參考值進行比較，其中所述比較的結果指示所述個體是否處於患心血管疾病的風險中。在更優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中所述第二種miRNA選自由miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。關於「健康受試者」或「未患有心血管疾病或未處於患心血管疾病的風險中的受試者」是指不具有相對於正常人群的增加的風險的受試者。優選地，這樣的受試者不具有超重或高膽固醇，是不吸菸者、非糖尿病患者，且不具有心血管疾病的歷史或家族史。關於「患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者」是指已經被診斷有心血管疾病和/或具有相對於正常人群的患心血管疾病的增加的風險的受試者。優選地，用包括血小板的樣品來測定存在於所述血小板中的至少一種miRNA的表達水平。然而，對於測定其表達水平，樣品中的血小板仍然完整和/或miRNA仍然存在於血小板之內是沒有必要的。例如，在測定本發明的miRNA的水平之前，血小板可以是，且優選地是裂解的。然後，用在所述樣品中測量的miRNA的量來計算存在於所述血小板中的所述miRNA的(相對)水平。使用詞語「相對」，因為沒有必要測定絕對值(例如，以pg/lX106血小板計算)，但水平優選地是相對於持家基因來測定的，持家基因比如RNU6B，RNU6B是在很多miRNA定量研究中廣泛使用的內源性參考RNA。注意，用血小板相對純的樣品，即富含血小板的血漿樣品，本發明已經鑑別了幾種miRNA，與在健康個體的血小板中的表達相比，所述幾種miRNA在處於心血管疾病的風險中的個體的血小板中被差異表達。由於本發明已經鑑別了在血小板中差異表達的幾種miRNA，在根據本發明的方法中，沒有必要使用富含血小板的樣品。例如，全血樣品可用於本發明的方法中以確定個體是否處於患心血管疾病的風險中。然而，優選避免的是，用於根據本發明的方法的樣品的製備誘導了所述血小板和/或所述樣品中的miRNA水平的改變。例如，這是假設血樣品是在沒有抗凝劑下抽取的情況。這樣的血樣品的處理誘導了血小板的活化和隨後的凝血。凝血將導致樣品中的miRNA水平的改變。
本文將miRNA的同源物定義成由於共同的祖先而相似的miRNA。DNA序列通常是相似的，不相同的。本文將miRNA的直系同源物定義成通過物種形成事件而分開的同源核酸分子。例如，直系同源基因是在因為起源於共同的祖先而彼此相似的不同物種中的基因。當然，優選的是，使用來自特定物種的miRNA直系同源物來診斷和/或治療所述特定物種中的心血管疾病。因此，在人中，當在人的樣品中測定miRNA時，優選地測定人的miRNA。在優選的實施方式中，同源物和/或直系同源物與本發明的miRNA具有至少50%的序列同一性。在更優選的實施方式中，序列同一性為至少60%，更優選地至少70%，更優選地至少80 %，更優選地至少90 %，最優選地至少95 %。本文將術語「 ％序列同一性」定義成在比對序列且任選地引入空位(如果需要)以實現最大的百分比序列同一性後，核酸序列中與感興趣的核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分數。用於比對的方法和電腦程式是本領域所熟知的。 由於測定了血小板中的miRNA的表達水平，優選使用包括血小板的樣品，例如血樣品或富含血小板的血漿樣品。因此，在優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中使用全血樣品，優選地富含血小板的血樣品。關於全血樣品是指靜脈或動脈血樣品，優選地在開放系統(即，沒有真空)中抽取的且優選地具有抗凝劑。已知真空對血細胞加壓且可導致血小板的活化和隨後miRNA水平在樣品中的改變。抗凝劑的使用防止和/或減少了血的凝固，且因此防止和/或減少了凝血引起的miRNA水平在樣品中的變化。在甚至更優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中所述樣品是富含血小板的血漿樣品。因此，本文將富含血小板的血漿定義成具有基線(即正常血漿中的血小板濃度)以上的血小板濃度的血漿。通過離心來製備富含血小板的血漿的方法是技術人員已知的。富含血小板的血漿還可以包含增加的白細胞濃度或可以不包含增加的白細胞濃度。然而，在根據本發明的方法中，優選使用具有低數目的白細胞的富含血小板的血漿樣品。優選地，相對於所述樣品中的血小板的量，所述樣品包括5%以下，更優選地2. 5%以下，更優選地I %以下，甚至更優選地O. 5%以下，最優選地O. 4%以下的白細胞。根據本發明，從在CAD患者與對照中差異表達的miRNA中，在CAD患者中，hsa-miR-1280 是下調的，且 hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-545 :9· I、hsa-miR-451、hsa_miR-454*和hsa-miR-624*是上調的。由於測試結果的可變性和個體之間的差異，本文定義的是，認為I. 5倍的下調或上調是顯著的且預測個體是否處於患心血管疾病的風險中。因此，在優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，包括測定所述樣品中的所述至少一種miRNA的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的所述至少一種miRNA的表達水平為至少I. 5倍的增加,其中所述至少一種miRNA包括選自由 miR-545 :9· I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的miRNA。在更優選的實施方式中，測定所述表達水平是否為至少I. 55，優選地至少I. 60，更優選地至少I. 65，更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的增加。在另一個優選實施方式中，提供根據本發明的方法，包括測定所述樣品中的所述至少一種miRNA的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的所述至少一種miRNA的表達水平為至少I. 5倍的減少，其中所述miRNA為hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物。在更優選的實施方式中，測定所述表達水平是否為至少I. 55，更優選地至少I. 60，更優選地至少I. 65，更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的減少。在優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. UmiR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p 及這些miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. I、miR-624*、miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，包括測定所述樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少I. 2，更優選地至少1.25，更優選地至少I. 3,更優選地至少I. 4,更優選地至少I. 5,更優選地至少I. 60,更優選地至少I. 65，更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的增加，且測定所述樣品中的第二種 miRNA的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的所述第二種miRNA的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少I. 2，更優選地至少I. 25，更優選地至少1.3,更優選地至少1.4,更優選地至少1.5,更優選地至少I. 60,更優選地至少I. 65,更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的增加，其中所述第二種miRNA選自由miR-545 :9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-615_5p及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述第二種miRNA選自由miR-624*和miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述第二種miRNA為miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物。在更優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，包括測定所述樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少1.2，更優選地至少1.25，更優選地至少I. 3,更優選地至少I. 4,更優選地至少I. 5,更優選地至少I. 60,更優選地至少I. 65，更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的增加，測定所述樣品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少I. 2，更優選地至少I. 25，更優選地至少I. 3，更優選地至少I. 4,更優選地至少I. 5,更優選地至少I. 60,更優選地至少I. 65,更優選地至少I. 75,最優選地至少I. 85倍的增加，且測定所述樣品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少I. 2,更優選地至少I. 25,更優選地至少I. 3,更優選地至少I. 4,更優選地至少I. 5,更優選地至少I. 60，更優選地至少I. 65，更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的增加。在另一優選實施方式中，提供根據本發明的方法，包括測定所述樣品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少I. 2，更優選地至少I. 25，更優選地至少1.3，更優選地至少I. 4,更優選地至少I. 5,更優選地至少I. 60,更優選地至少I. 65,更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的增加，且測定所述樣品中的第二種miRNA的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的所述第二種miRNA的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少I. 2，更優選地至少I. 25，更優選地至少I. 3，更優選地至少I. 4，更優選地至少I. 5，更優選地至少I. 60，更優選地至少I. 65，更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的增加，其中所述第二種miRNA選自由miR-545 :9. I、hsa-miR-340*和miR-454*、hsa-miR-615-5p及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述第二種miRNA選自由hsa-miR-340*和miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。 在優選的實施方式中，本發明還提供根據本發明的方法，還包括測定所述樣品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表達水平為至少I. 15倍，優選地至少I. 2，更優選地至少I. 25，更優選地至少I. 3，更優選地至少I. 4，更優選地至少I. 5，更優選地至少I. 60，更優選地至少I. 65，更優選地至少I. 75，最優選地至少I. 85倍的減少。miRNA不僅僅是個體是否處於患心血管疾病的風險中的指示物。如前所述的，miRNA能夠通過抑制mRNA的翻譯或通過促進mRNA的降解來抑制蛋白質合成。因此，miRNA是正常發育和生理學的有效調節物。miRNA表達的增加將導致其靶的蛋白質合成的抑制。在處於患心血管疾病的風險中的受試者中，觀察到hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-545 9. l、hsa-miR-451、hsa_miR-454* 和 / 或 hsa-miR-624* 的表達的增加。因此，對於治療、減弱和或預防心血管疾病，例如通過增加這些miRNA中的任一個的靶的量、表達和/或活性抵消這些增加的miRNA的作用是有用的，。例如，增加miRNA靶的量、表達和/或活性可以通過抑制所述miRNA的量、活性和/或表達，或通過提供靶本身來完成。因此，在一個實施方式中，本發明提供用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和/或巨核細胞中的選自由 miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少一種miRNA的靶的量、表達和/或活性。優選地，所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. I ,miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。更優選地，所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. l、miR-624*、miR_454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述至少一種 miRNA 為 hsa-miR-340* 或 miR-624*,或 hsa-miR-340* 或 miR-624* 的同源物或直系同源物。在甚至更優選的實施方式中，所述至少一種miRNA為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物。本發明提供了這樣的見解增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和/或巨核細胞中的選自由miR-545 9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少兩種，更優選地至少三種，更優選地至少四種，或更多種miRNA的一種或多種靶的量、表達和/或活性在治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病中是有用的。特別地，對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病，選自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少兩種miRNA的組合是特別有用的。根據本發明，增加hsa-miR-340*、miR-624*和miR-454*，或這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物的一種或多種靶的量、表達和/或活性在治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病上是最有效的。因此，在優選的實施方式中，提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，其中所述至少一種miRNA為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，該方法還包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和 / 或巨核細胞中的選自由 miR-624*、miR-454*、miR-545 :9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的靶的量、表達和/或活性。

在更優選的實施方式中，提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，其中所述又一種miRNA選自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在甚至更優選的實施方式中，所述又一種miRNA為miR-454*或miR-454的同源物或直系同源物。在最優選的實施方式中，提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，其中所述又一種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法還包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和/或巨核細胞中的miR-454的靶或miR-454的同源物或直系同源物的靶的量、表達和/或活性。在另一個優選的實施方式中，提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，其中所述至少一種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法還包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和 / 或巨核細胞中的選自由 hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545 :9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的靶的量、表達和/或活性。在更優選的實施方式中，提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，其中所述又一種miRNA選自由hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在優選的實施方式中，提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，其中所述miRNA的靶的量、表達和/或活性的所述增加是通過所述血小板和/或所述巨核細胞中的所述miRNA的表達或活性的抑制而介導的。還提供了用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和/或巨核細胞中的選自由miR-545 9. l、miR_624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少三種miRNA的一個靶或多個靶的量、表達和/或活性。優選地，所述至少三種miRNA選自由miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。最優選地，所述至少三種miRNA的第一種為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述至少三種miRNA的第二種為miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物，且所述至少三種miRNA的第三種為hsa-miR-340*或miR-340*的同源物或直系同源物。在優選的實施方式中，所述miRNA的靶的量、表達和/或活性的所述增加是通過抑制選自由所述血小板中和/或所述巨核細胞中的miR-545 9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*>hsa-miR-615~5p>hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少一種miRNA的表達或活性而介導的。優選地,所述至少一種miRNA選自由 miR-545 :9. I ,miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。更優選地，所述至少一種miRNA選自由miR-545 9. I、miR-624*、miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。優選地,所述miRNA的表達和/或活性的所述抑制是通過miRNA反義分子。miRNA反義分子是與miRNA具有高百分數的互補序列同一性的核酸分子。高互補序列同一性允許與所述miRNA的特異性結合。關於互補是指miRNA和miRNA反義分子之間的嘌呤和喃唳的特異性配對。優選地，所述miRNA反義分子與本發明的miRNA的所述互補序列同一性為至少50 %。在更優選的實施方式中，該序列同一性為至少60 %，更優選地至少70 %，更優選地至少80 %，更優選地至少90 %，最優選地至少95 %。miRNA表達減少，比如例如在患有CAD的受試者中觀察到的hsa-miR-1280的減少，將導致miRNA靶的表達增加。因此，miRNA表達減少的作用可以通過miRNA靶的量、表達和/或活性的減少來抵消。例如，這可通過增加所述miRNA的量、表達和/或活性來完成。因此，在優選的實施方式中，提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，還包括減少患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板中和/或巨核細胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的靶的量、表達和/或活性。優選地，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表達和/或活性的所述減少是通過增加所述血小板中和/或所述巨核細胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的量、表達和/或活性而介導的。在更優選的實施方式中，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表達和/或活性的所述減少是通過向所述受試者提供hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物而介導的。因此，在另一個優選的實施方式中，提供用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，包括減少患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板中和/或巨核細胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的靶的量、表達和/或活性。優選地，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表達和/或活性的所述減少是通過增加所述血小板中和/或所述巨核細胞中的hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的量、表達和/或活性而介導的。在更優選的實施方式中，hsa-miR-1280和/或其同源物和/或直系同源物的所述靶的量、表達和/或活性的所述減少是通過向所述受試者提供hsa-miR-1280和/或同源物和/或直系同源物和/或類似物而介導的。在優選的實施方式中，提供根據 本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，其中miRNA的所述同源物、直系同源物和/或類似物與所述miRNA具有至少50%的序列同一性。在更優選的實施方式中，序列同一性為至少60%，至少70%，至少80%，至少90%或至少95%。本文將miRNA的類似物定義成包括被修飾以例如增加核酸酶抵抗力，和/或增加反義核甘酸對靶序列的親和力的的一個或多個殘基的人工修飾的miRNA。在優選的實施方式中，類似物包括修飾的骨架。這樣的骨架的實例由嗎啉代骨架；氨基甲酸酯骨架；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲醯基(formacetyl)和硫代甲醯基骨架；亞甲基甲醯基骨架；核糖乙醯基(riboacetyl)骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯、磺酸酯和磺醯胺骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；及醯胺骨架來提供。還優選的是，骨架中的殘基之間的連接不包括磷原子，比如通過短鏈烷基或環烷基的核苷間連接，混合的雜原子和烷基或環烷基的核苷間連接，或一個或多個短鏈雜原子或雜環的核苷間連接所形成的連接。優選的類似物包括具有修飾的聚醯胺骨架的肽核酸(PNA)。根據鹼基對識別，基於 PNA的分子為DNA分子的真實模擬物。PNA的骨架由通過肽鍵連接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成，其中核鹼基通過亞甲基羰基鍵連接到骨架上。可選擇的骨架包括一碳延伸的吡咯烷PNA單體。由於PNA分子的骨架包括不帶電的磷酸根基團，PNA-RNA雜交體通常分別比RNA-RNA或RNA-DNA雜交體更加穩定。另外優選的骨架包括嗎啉代類似物，其中核糖或脫氧核糖被6-元的嗎啉環代替。最優選的miRNA類似物或等同物包括磷醯二胺嗎啉代寡核苷酸(phosphorodiamidatemorpholino oligomer) (PMO),其中核糖或脫氧核糖被6-元嗎啉環取代,且相鄰的嗎啉環之間的陰離子磷酸二酯連接被非離子磷醯二胺嗎啉代連接代替。在又另一實施方式中，本發明的miRNA類似物包括磷酸二酯連接中的非橋接氧之一的取代。這種修飾使鹼基配對稍微不穩定，但顯著增加了對核酸酶降解的抵抗力。優選的核苷酸類似物或等同物包括硫代磷酸酯；手性的硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；H-磷酸酯；包括3'-亞烷基磷酸酯、5'-亞烷基磷酸酯和手性磷酸酯的甲基和其它烷基磷酸酯；次磷酸酯；包括3'-氨基磷醯胺酯和氨基烷基磷醯胺酯的磷醯胺酯(phosphoramidate);硫羰基磷醯胺酯(thionophosphoramidate);硫羰基燒基磷酸酯；硫羰基燒基磷酸三酯；硒代磷酸酯或硼燒磷酸酯(boranophosphate)。本發明另一優選的miRNA類似物包括在Y 和/或Y位置處被單取代或雙取代的一個或多個糖部分，比如-OH ；-F ;可以被一個或多個雜原子中斷的取代或未取代的線性或支鏈低級(Cl-ClO)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基；0_、S-或N-烷基；0_、S-或N-稀基；0-、S-或N-塊基；0-、S-或N-稀丙基；0_燒基-O-燒基，-甲氧基,-氛基丙氧基；甲氧基乙氧基；-二甲氨基氧代乙氧基；及-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以為吡喃糖或其衍生物，或脫氧吡喃糖或其衍生物，優選地核糖或其衍生物，或脫氧核糖或其衍生物。優選的衍生化糖部分包括鎖核酸(LockedNucleic Acid) (LNA)，其中2'-碳原子連接到糖環的3'或4'碳原子上，從而形成二環糖部分。優選的LNA包括2' -O,4/ -C-亞乙基-橋接的核酸。這些取代使得核苷酸類似物或等同物對抗核糖核酸酶H和核酸酶且增加了對靶RNA的親和力。在另一實施方式中，本發明的miRNA類似物包括一種或多種鹼基修飾或取代。修飾的鹼基包括合成鹼基和天然鹼基，比如本領域已知的或將已知的肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤及喃唳喊基和嘿呤喊基的其它氣雜、脫氣、輕基、齒素、硫代、硫醇、燒基、稀基、塊基、硫代燒基衍生物。技術人員理解的是，沒有必要對反義寡核苷酸中的所有位置進行統一的修飾。此夕卜，多於一種的上述類似物可以被合併到單一的miRNA中或甚至在miRNA內的單一位置中。因此，本發明提供了這樣的見解存在於血小板中的miRNA的抑制劑在例如治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病中是有用的，所述miRNA在患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者中被過表達。因此，本發明還提供用作藥物的miRNA的抑制劑，所述miRNA選自由miR-545 9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。另一實施方式提供用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的miRNA的抑制劑，所述miRNA選自由miR-545 :9. I、miR-624*和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在優選的實施方式中，所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p 及這些 miRNA 中的 任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述至少一種miRNA選自由miR-545 9. I、miR-624*、miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在另一更優選的實施方式中，所述miRNA為hsa-miR-340*或miR-624*,或hsa-miR-340*或miR-624*的同源物或直系同源物。在患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者的血小板中，hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-545 9. I、hsa-miR-451、hsa-miR-454*、hsa-miR-624*都是過表達的。相反，在患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者的血小板中，hsa-miR-1280的表達是較低的。因此，對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病，必須增加hsa-miR-1280的表達或活性。因此，本發明還提供用作藥物的miRNA hsa-miR-1280和/或其同源物、直系同源物和/或類似物，和/或hsa-miR-1280的活化劑。在另外的實施方式中，本發明提供用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的miRNAhsa-miR-1280和/或其同源物、直系同源物和/或類似物，和/或hsa-miR-1280的活化劑。還提供了包括根據本發明的至少一種抑制劑和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。在更優選的實施方式中，藥物組合物包括至少一種miRNA的抑制劑，所述miRNA為hsa-miR-340*或其同源物或直系同源物。在更優選的實施方式中，藥物組合物包括至少一種另外的 miRNA 的抑制劑，所述 miRNA 為 miR-624* 或 miR-454*，或 miR-624* 或 miR-454*的同源物或直系同源物。在最優選的實施方式中，藥物組合物包括至少一種miR-624*的抑制劑或miR-624*的同源物或直系同源物的抑制劑；至少一種hsa-miR-340*的抑制劑或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的抑制劑；及至少一種miR-454*的抑制劑或miR-454*的同源物或直系同源物的抑制劑。在另一個更優選的實施方式中，藥物組合物包括至少一種miRNA的抑制劑，所述miRNA為miR-624*或其同源物或直系同源物。在更優選的實施方式中，藥物組合物包括至少一種另外的miRNA的抑制劑，所述miRNA為hsa-miR-340*或其同源物或直系同源物。根據本發明的這樣的藥物組合物對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病是特別有用的。因此，本發明提供根據本發明用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的藥物組合物。術語「心血管疾病」包括影響心臟、動脈和靜脈的種類廣泛的疾病。根據本發明，心血管疾病優選地伴有動脈變窄或是動脈變窄的結果。這種變窄可以但不一定嚴重到使得動脈完全被堵塞。動脈的類型可以是外周動脈(例如，臂或腿的外周動脈疾病、中風、腎衰竭或血管性痴呆)，還可以是冠狀動脈(例如，導致短暫性腦缺血發作、急性冠脈症候群或穩定性心絞痛)。因此，在優選的實施方式中，提供根據本發明的方法、根據本發明的抑制劑、藥物組合物和/或根據本發明的miRNA，其中所述心血管疾病選自由動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、短暫性腦缺血發作、中風、周圍性血管疾病、急性冠脈症候群、穩定性心絞痛、血管性痴呆和腎衰竭組成的組。由於本發明已經提供了如下見解選自由miR-545 :9. I、miR-624*和miR-454*、 hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 和 hsa-miR-1280 組成的組的 miRNA 的血小板表達預測受試者是否處於患心血管疾病的風險中，本發明還提供用於測定血小板miRNA的表達的試劑盒。因此，在一個實施方式中，本發明提供多個部件的試劑盒(kit of parts),包括能夠特異性地結合到選自由miR-545 :9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物組成的組的至少一種miRNA的至少一種分子，及在根據本發明的方法中使用所述試劑盒的說明書頁。所述試劑盒可以任選地包括一種或多種對照，和/或一個或多個標準品。在優選的實施方式中，所述至少一種 miRNA 為 hsa-miR-340* 或 miR-624*,或 hsa-miR-340* 或 miR-624* 的同源物、直系同源物或類似物。在優選的實施方式中，所述試劑盒包括能夠特異性地結合到選自由miR-545 9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物組成的組的至少兩種miRNA的至少兩種分子。在更優選的實施方式中，所述試劑盒包括能夠特異性地結合3種miRNA的至少3種分子，更優選地能夠特異性地結合4種miRNA的至少4種分子,更優選地能夠特異性地結合5種miRNA的至少5種分子，更優選地能夠特異性地結合6種miRNA的至少6種分子，最優選地能夠特異性地結合7種miRNA的至少7種分子，所述miRNA選自由miR-545 :9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280 及其同源物和直系同源物組成的組。當然，理解的是，至少兩種分子一起結合本發明的兩種miRNA，且每一種分子優選地僅結合一種miRNA。這對於至少3種，至少4種，至少5種，至少6種及至少7種分子也同樣適用。在優選的實施方式中，提供根據本發明的多個部件的試劑盒，包括能夠特異性地結合至少兩種miRNA的至少兩種分子，其中所述至少兩種分子中的第一種為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，且所述至少兩種分子中的第二種為miR-624*、miR-454*，或miR-624*或miR-454*的同源物或直系同源物。在最優選的實施方式中，提供根據本發明的多個部件的試劑盒，包括能夠特異性地結合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的至少一種分子，能夠特異性地結合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的至少一種分子，及能夠特異性地結合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物的至少
一種分子。在另一個實施方式中，提供多個部件的試劑盒，包括能夠特異性地結合選自由miR-545 9. l、miR-624*、miR_454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少兩種miRNA的至少兩種分子。甚至更優選的是，所述試劑盒包括能夠特異性地結合選自由miR-545 9. I、miR-624*、miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少三種miRNA的至少三種分子。在仍另一個實施方式中，提供試多個部件的試劑盒，包括能夠特異性地結合到選自由 miR-545 :9· I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物組成的組的至少四種miRNA的至少四種分子。在更優選的實施方式中，所述試劑盒包括能夠特異性地結合5種miRNA的至少5種分子，更優選地能夠特異性地結合6種miRNA的至少6種分子，最優選地能夠特異性地結合7種miRNA的至少 7 種分子，所述miRNA 選自由 miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、 hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 > hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物組成的組。因此，對於測定個體是否患有心血管疾病或是否處於患心血管疾病的風險中，上述試劑盒是有用的。因此，在一個實施方式中，提供根據本發明的試劑盒用於測定個體是否患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的用途。可以使用特異性地結合到本發明的miRNA上的各種分子。優選地，所述至少一種分子為核酸分子或人造的核酸分子。核酸分子由單體核苷酸的鏈組成。為了增加例如穩定性，人工修飾核酸分子。按照定義，這樣人工修飾的核酸分子是類似物。類似物包括例如肽核酸，及包括至少一種修飾的核苷酸和/或非天然核苷酸諸如例如肌苷、LNA、嗎啉代和2' -O-甲基RNA的核酸序列。技術人員易於鑑別用於根據本發明的試劑盒的能夠特異性地結合本發明的miRNA的核酸分子。能夠特異性地結合本發明的至少一種miRNA的核酸分子優選地包括與所述至少一種miRNA具有至少85%的互補序列同一性的至少7個核苷酸的序列。在更優選的實施方式中，所述核酸分子包括至少 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或至少24個核苷酸,且與所述至少一種miRNA具有至少85%的互補序列同一'丨生。在更優選的實施方式中，所述互補序列同一性為至少90%，至少95%，或100%。如上所述的，互補是指miRNA和miRNA反義分子之間的嘌呤和嘧啶的特異性配對。因此，關於互補序列同一性是指miRNA的核酸分子和反義核酸分子之間的百分比序列同一性。這樣的試劑盒可以以陣列的形式提供。陣列對於高通量篩選是特別有用的。因此，在仍另一個實施方式中，本發明提供包括固定在平臺上的分子的陣列，其中所述分子中的至少一種或幾種能夠特異性地結合到選自由miR-545 9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280 及其同源物和直系同源物組成的組的至少四種miRNA上。在另一個實施方式中，本發明提供包括固定在平臺上的分子的陣列，其中所述分子中的至少一種或幾種能夠特異性地結合到選自由miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-1280 及這些 miRNA 中任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少三種，優選地至少四種，更優選地至少五種，更優選地至少六種miRNA上。
在優選的實施方式中，提供根據本發明的陣列，其中至少部分的所述分子能夠特異性地結合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物上，至少部分的所述分子能夠特異性地結合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物上，且至少部分的所述分子能夠特異性地結合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物上。在另一個實施方式中，本發明提供包括固定在平臺上的分子的陣列，其中所述分子中的至少一種或幾種能夠特異性 地結合到選自由miR-545 9. I、miR-454*、miR-624*及其同源物和直系同源物組成的組的至少兩種，優選地至少三種miRNA上。在仍另一個實施方式中，本發明提供包括固定在平臺上的分子的陣列，其中所述分子中的至少一種或幾種能夠特異性地結合到選自由miR-545 9. I、miR-454*、miR-624*及其同源物和直系同源物組成的組的至少兩種miRNA,優選地至少三種miRNA上。在優選的實施方式中，所述至少兩種miRNA中的第一種為。例如，合成能夠結合所述miRNA中的幾種，優選地至少四種的一種分子是可能的。例如，這可以通過合成包括與至少一種miRNA具有至少85%的互補序列同一性的至少7個核苷酸的序列，還包括與至少一種其它miRNA具有至少85%的互補序列同一性的至少7個核苷酸的序列等等的核酸分子來實現。合成各自包括與至少一個miRNA具有至少85%的互補序列同一性的至少7個核苷酸的序列的幾種分子也是可能的。優選地，不同的分子與本發明的又一種miRNA具有至少85%的互補序列同一性。在更優選的實施方式中，所述核酸分子包括至少 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或至少24個核苷酸，且與所述至少一種miRNA或所述至少至少一種其它miRNA具有至少85 %的互補序列同一性。在更優選的實施方式中，所述互補序列同一性為至少90%，至少95%，或100%。根據本發明的陣列優選地包括其中每一個選擇性結合miRNA的分子。陣列優選地附有在根據本發明的方法中使用所述陣列的說明書頁。如前所述的，可以使用特異性結合到本發明的不同miRNA的各種分子。優選地，核酸分子或類似物被用於根據本發明的陣列中。在另一優選的實施方式中，存在於所述陣列上的多個分子能夠特異性地結合到選自由 miR-545 :9· I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物組成的組的至少5種，更優選地至少6種，更優選地至少7種miRNA上。在另一個優選的實施方式中，存在於所述陣列上的多個分子能夠特異性地結合到選自由 miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-1280及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少4種，更優選地至少5種,更優選地至少6種miRNA上。在一個實施方式中，本發明提供根據本發明的陣列在根據本發明的方法中優選地用於測定個體是否患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的用途。在本發明之前，用幾個其它風險因素來測定個體是否患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中。這些因素包括但不限於血壓、血膽固醇水平、血糖水平、吸菸習慣、年齡、在所述受試者中的血清C-反應蛋白水平、家族史、BMI和/或腰圍。除了根據本發明的方法外，這些風險因素仍然是有用的。因此，本發明提供根據本發明的方法，還包括將血壓、血膽固醇水平、血糖水平、吸菸習慣、年齡、在所述受試者中的血清C-反應蛋白水平、家族史、BMI和/或腰圍考慮進來，用於測定心血管疾病的風險。技術人員知道這些參數的參考值及與異常值相關的風險。可以通過本領域已知的任何方法來測定miRNA水平。技術人員能夠選擇最適合特定情況的方法。在優選的實施方式中，提供根據本發明的方法，其中用PCR比如定量實時PCR、微陣列、核糖核酸酶保護測定、免疫學方法、原位雜交和/或測序來測定miRNA的水平。這些方法是本領域所熟知的且被公布在試驗手冊中比如例如Sambrook的「MolecularCloning A Laboratory Manual」(第三版,2001,冷泉港實驗室出版社)中。由於本發明已經提供了在血小板中的本發明的miRNA的水平指示個體是否患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的見解，本發明還提供用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法。本發明利用本發明的miRNA的表達在患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者中被改變的見解，來測定候選化合物是否能夠使所述表達正常化。在本文中，關於「正常化」是指，如果這種表達在患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者中增加，那麼候選化合物能夠使所述表達減少。反之亦然，如果化合物能夠使患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者 中減少的miRNA的表達增加，該化合物就能夠使miRNA的表達正常化。因此，本發明提供用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法，包括使患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者的第一樣品的血小板與候選化合物接觸，測定相對於未接觸所述候選化合物的所述受試者的第二樣品的血小板的至少一種miRNA的表達,所述第一樣品的所述血小板的至少一種miRNA的表達水平，所述至少一種 miRNA 選自由 miR-545 :9. I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p>hsa-miR-451>hsa-miR-1280及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組，其中相對於所述第二樣品中的所述至少一種miRNA的表達，所述第一樣品中的所述至少一種miRNA的表達指示所述化合物對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病是否有用。優選地,所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. I、miR-624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-1280 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。更優選地，所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. l、miR-624*、miR_454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。還優選的是所述至少一種miRNA為hsa-miR-340*或miR-340*的同源物或直系同源物。在優選的實施方式中，提供根據本發明用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法，所述方法還包括選擇和/或分離被鑑別為對治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物。在優選的實施方式中，提供根據本發明用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述至少一種miRNA為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，該方法還包括測定選自由miR-624*、miR-454*、miR-545 :9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的表達水平,其中相對於所述第一樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達水平，所述第二樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達水平是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。在更優選的實施方式中，提供根據本發明用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或或預防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述又一種miRNA選自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述又一種miRNA為miR-454*。在最優選的實施方式中，提供根據本發明用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法,其中所述又一種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法還包括測定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達水平，其中相對於所述第一樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達且聯合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達，所述第二樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合miR-624*或miR-624*的同源物或直 系同源物的表達且聯合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。在另一優選實施方式中，提供根據本發明用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述至少一種miRNA為miR-624*，或has-miR-624*的同源物或直系同源物，該方法還包括測定選自由hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545 :9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的表達水平，其中相對於所述第一樣品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達，所述第二樣品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。在更優選的實施方式中，提供根據本發明用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法，其中所述又一種miRNA選自由hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。用本發明的方法來監測抗血小板治療的效果也是可能的。抗血小板治療利用了與血小板相互作用以阻止血小板聚集成有害的血塊的藥物。抗血小板藥物包括阿司匹林、噻氯匹定(Ticlid )、氯吡格雷(Plavix )、替羅非班(Aggrastat )和埃替非巴肽(Integrilin )。如前所述的，處於患心血管疾病的風險中的個人中的高百分比對阿司匹林治療的響應不是很好。用根據本發明的方法，識別這樣的不響應者且可以轉換到其它的藥物。因此，在一個實施方式中，本發明提供用於監測受試者中的抗血小板治療效果的方法，該方法包括測定相對於受試者的第二樣品的至少一種miRNA的表達水平，所述受試者的第一樣品的所述至少一種miRNA的表達水平,所述至少一種miRNA選自由miR-545
9.I、miR-624* 和 miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組，其中相對於所述第一樣品的所述至少一種miRNA的表達水平,所述第二樣品的所述至少一種miRNA的表達水平是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在採集所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。優選地，所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. l、miR_624*和miR-454*、hsa-miR-340*、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-1280 及這些 miRNA 中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。更優選地，所述至少一種miRNA選自由miR-545 :9. l、miR_624*、miR-454*及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在優選的實施方式中，提供根據本發明用於監測抗血小板治療的效果的方法，其中所述受試者患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中。用於根據本發明的監測抗血小板治療的效果的方法的樣品優選地包含血小板。然而，對於測定其表達水平，樣品中的血小板仍然完整和/或miRNA仍然存在於血小板之內是沒有必要的。例如，在根據本發明的方法中，可以使用全血樣品或富含血小板的血漿樣品。在優選的實施方式中，提供用於監測受試者中的抗血小板治療的效果的方法，其中所述至少一種miRNA為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物,該方法還包括測定選自由 miR-624*、miR-454*、miR-545 :9. I,hsa-miR-615-5p,hsa-miR-451 及這 些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的表達水平，其中相對於所述第一樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達,所述第二樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。在更優選的實施方式中，提供用於監測受試者中的抗血小板治療的效果的方法，其中所述又一種miRNA選自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。在更優選的實施方式中，所述又一種miRNA為miR-454*或其同源物或直系同源物。在最優選的實施方式中，提供用於監測受試者中的抗血小板治療的效果的方法，其中所述又一種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物,所述方法還包括測定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達水平，其中相對於所述第一樣品中的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達且聯合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達，所述第二樣品中的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達且聯合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。在另外的優選實施方式中，提供用於監測受試者中的抗血小板治療的效果的方法，其中所述至少一種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，該方法還包括測定選自由 hsa-miR-340*、miR-454*、miR-545 :9. I > hsa-miR-615-5p > hsa-miR-451 及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的表達水平，其中相對於所述第一樣品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達，所述第二樣品的所述miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。在更優選的實施方式中，提供用於監測受試者中的抗血小板治療的效果的方法，其中所述又一種miRNA選自由hsa-miR-340*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中的任一個的同源物和直系同源物組成的組。本發明還通過以下非限制性實例來闡述。實例不以任何的方式限制本發明的範圍。


圖I. 24位受試者的表達特徵的監督分層聚類分析(supervisedhierarchicalclustering analysis)的熱圖(heat map)(在x_軸上標明樣品)。在圖的上方將受試者標 記成對照(灰色)或病例(黑色)。以相同的順序將所描述的214個差異表達的miRNA(調整的P < O. 05)的名稱列出在表II中。色標灰色等級條(colour key grey-scale bar)表示標準化的miRNA表達水平(深灰色表示相對較低的表達；淺灰色表示相對較高的表達)。圖2. CAD患者和對照受試者的血小板中7種候選miRNA的表達特徵。每一個圖的左邊兩個條表示12位健康對照和12位CAD患者的平均miRNA表達，如通過miRNA陣列所測定的。通過實時PCR對相同的數據集進行確認(右邊的兩個條)。數據以平均值土SEM來表示且*表示與健康對照相比P < O. 05。圖3. CAD患者和對照受試者的血小板中6種候選miRNA的表達特徵。每一個圖的左邊的兩個條表示miRNA陣列群組(cohort)的平均miRNA表達(12位對照和12位患者)。通過實時PCR對兩個獨立的群組進行確認(右邊的四個條)。數據以平均值土SEM來表示且*表示與健康對照相比P < O. 05。
實施例實施例I設計和方法研究群體為了產生具有CAD遺傳易感性的研究群體5，我們選擇了一組在年輕時患有CAD (早發CAD)且具有早發心血管疾病(CVD)的陽性家族史的12位白人男性患者。這些患者具有CAD持續風險的「極端(extreme-end) 」的表型。因此，這個組對於考察血小板特異性的miRNA在CAD中的作用是理想的。患者選自我們的阿姆斯特丹的學術醫療中心(AMC)的門診診所，所述門診診所專注於早發CAD。對照組由12位健康的白人男性志願者組成，所述志願者是通過廣告招募的。這個對照組不具有CVD的歷史或陽性家族史且不允許使用任何藥物。該研究遵守赫爾辛基宣言，研究方案得到了阿姆斯特丹的AMC的醫學倫理委員會的批准，並得到了所有受試者的書面知情同意。定義早發CAD被定義成在51歲年齡之前的心臟事件。早發CVD的陽性家族史被定義成一個或多個I級家族成員或兩個或多個2級家族成員患有早發CVD (男性< 51歲且女性 30kg/m2 ;高膽固醇血症，已知採取高膽固醇血症治療。外周血收集與血小板分離用規格19 (19-gauge)的針，從肘前靜脈中無血瘀地抽取非空腹靜脈血樣品。將血收集在5個檸檬酸三鈉管(每一個5mL，包含O. 5mL O. 105M檸檬酸三鈉，BD Vacutainer)中，丟棄第一個。在剛剛取血之後，使樣品離心(180g，15分鐘，室溫，不制動)，以得到富含血小板的血漿(PRP)。用聚丙烯移液管將PRP小心地轉移到塑料管中，留下至少25%的PRP，以避免白細胞汙染。將一份酸-檸檬酸 鹽-葡萄糖(AOT)緩衝液(0.085M檸檬酸三鈉，O. IlM葡萄糖，0.071M檸檬酸)添加到5份的PRP中，且然後使PRP離心(800g，20分鐘，室溫，不制動)。丟棄含血小板較少的血漿，且將血小板沉澱(pellet)小心地重新懸浮在臺氏緩衝液(Tyrode buffer) (136. 9mM NaCl,2. 6 ImM KCl, 11. 9mM NaHCO3, 5. 55mM 葡萄糖，2mM EDTA, pH 6.5)中。使血小板懸浮液離心(800g，20分鐘，室溫，不制動)。丟棄上清液且將血小板沉澱重新懸浮在50 μ I的無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且在分離RNA之前在-80°C下存儲。通過螢光激活細胞分選術(FACS)來考察分離的血小板的汙染，使用抗CD45-APC(BDBiosciences)、CD235a-FITC(DAKO)和 CD61_PE(BD Biosciences)的單克隆抗體以分別鑑別白細胞、紅細胞和血小板。分離的血小板的純度為99. 72%。 RNA提取及miRNA表達分析基本上根據生產商用於液體樣品的方案,用mirVana PARIS試劑盒(Ambion, Inc)來從血小板中提取總RNA。改進該方案，以用等體積的酸-苯酚氯仿來提取樣品兩次，且在最後的洗滌步驟後和洗脫之前，使柱子乾燥3分鐘。將樣品從50 μ I濃縮到12 μ 1，其中5 μ I被用於陣列中。在ServiceXS (Leiden, The Netherlands),用 Illumina Human v2MicroRNABeadArray根據生產商的建議(Illumina, Inc. , San Diego, CA)來獲得MiRNA的表達特徵。使用統計軟體包R(版本2. 9. O)中的微球陣列包(beadarray package)(版本I. 12. I),預處理、概括、log轉換及分位數標準化(quantile normalized)原始數據。使用Iimma包(版本2. 18. 3),用調節的(moderated) t檢驗來評估差異表達。如果通過用Benjamini和Hochberg的方法對於多重檢驗調整的P值小於O. 05,認為MiRNA顯著地差異表達。通過樣品的分層聚類(歐幾裡得距離，全聯(complete linkage))使差異表達的miRNA(調整的p<0.05)可視化。對於詳細信息，參見網上的補充資料。通過定量實時聚合酶鏈反應的表達分析為了驗證微陣列分析，選擇在患者和對照之間差異表達的miRNA用於實時PCR。將來自RNA分離的洗脫液的8μ I的固定體積用作逆轉錄反應中的輸入。用miScript逆轉錄試劑盒(Qiagen)來使輸入RNA逆轉錄。在LightCycler480系統II (Roche)上,用HighResolution Melting Master (Roche)來進行實時 PCR。用 LinRegPCR 定量 PCR 數據分析軟體(版本11. 3. 3)來分析數據6。計算NO值後，將數據標準化成內源性對照RNU6B(AppliedBiosystems)。對於詳細信息,參見網上的補充資料。結果臨床特徵
所考察的受試者的臨床特徵顯示在表I中。我們知道沒有受試者患有糖尿病和肥胖症。外周血小板的MiRNA特徵(signature)微陣列分析鑑別在血小板中檢測到的893個成熟的人的miRNA中的214個在具有CAD的患者和健康對照之間被差異表達(調整的P < O. 05)。這214個miRNA被用於監督分層聚類分析中，所述分析基於受試者的miRNA表達特徵的相似性將受試者聚類(參見圖I) ο這種聚類分析顯示，一小組(a subset of)血小板衍生的miRNA能夠區分CAD患者和健康對照。在這214個差異表達的miRNA中，與對照相比，9個miRNA在患者中被上調至少1.5倍。而且，與對照相比，4個miRNA在患者中被被下調至少1.5倍。為了確認我們的數據的穩健性，我們還在沒有上述的異常樣品的情況下分析了我們的數據。不管我們省略了異常值的哪一種組合，6種miRNA保持顯著上調且I種miRNA保持顯著下調。上調的miRNA為 miR-340*、miR-615-5p、miR-545 :9. I、miR-451、miR-454* 和 miR-624*，且下調的 miRNA為miR-1280(參見圖2)。通過實時PCR確認miRNA陣列數據 在同一群體中，用實時PCR來確認6個上調miRNA和I個下調miRNA的陣列數據。由於與其它樣品相比RNU6B (我們的內源性對照)的表達水平始終在範圍之外，從分析中排除兩位對照受試者。所有的6個上調的miRNA也被實時PCR證明為上調的，儘管通過PCR，只有三個是統計學顯著的(miR-545 9. 1，miR-624*和miR-454* ；p 80的百位分數。對照被定義成沒有任何CAD症狀或抱怨I冠狀動脈鈣化得分< 80的百位分數。
定義早發CAD被定義成男性在51歲年齡之前及女性在56歲之前的心臟事件。早發心血管疾病(CVD)的陽性家族史被定義成一個或多個I級家族成員或兩個或多個2級家族成員患有早發CVD。CAD被定義成急性心肌梗塞(AMI)或穩定性心絞痛。通過症狀或心電圖變化臨床診斷出AMI且通過心肌壞死的標誌物的增加的血漿水平來證實，並通過如根據冠狀造影單一血管疾病所顯示的冠狀動脈阻塞來證實。通過症狀臨床診斷出穩定性心絞痛且通過如根據冠狀造影所顯示的在至少2個血管中的顯著的冠狀動脈狹窄(> 70% )來證實。以如下的方式定義風險因素高血壓採取高血壓治療或在半小時的Dinamap測量中3次獨立測量的未治療的收縮壓> HOmmHg或舒張壓> 90mmHg ;超重BMI > 25kg/m2 ;高膽固醇血症總的未治療的膽固醇水平> 8mmol/l或在事件之前採取高膽固醇血症治療；吸菸目前吸菸；糖尿病2次獨立測量的空腹葡萄糖>6. 9mmol/l或非空腹> 11. lmmol/1或已知米取糖尿病治療。所有上述群組遵守赫爾辛基宣言。研究方案得到了阿姆斯特丹的AMC的醫學倫理 委員會的批准，且得到了所有受試者的書面知情同意。外周血收集與血小板分離用規格19的針，從肘前靜脈中無血瘀地抽取非空腹靜脈血樣品。將血收集在5個檸檬酸三鈉管中(每一個5ml，含有0.5ml O. 105M檸檬酸三鈉，BD Vacutainer)。未用第一個樣品來分析。在剛剛取血之後，使樣品離心(180g，15分鐘，在室溫下，不制動)，以得到富含血小板的血漿(PRP)。用聚丙烯移液管，將PRP的上層小心地轉移到塑料管中，以避免白細胞汙染。將一份酸-檸檬酸鹽-葡萄糖(AOT)緩衝液(O. 085M檸檬酸三鈉，O. IlM葡萄糖，O. 071M檸檬酸)添加到5份PRP中，且然後使PRP離心(800g，20分鐘，在室溫下，不制動)。丟棄含血小板較少的血漿，且將血小板沉澱小心地重新懸浮在臺氏緩衝液(136. 9mMNaCl, 2. 6ImM KC1，11. 9mMNaHC03，5. 55mM 葡萄糖，2mM EDTA, pH 6. 5)中。使血小板懸浮液離心(800g，20分鐘，在室溫下，不制動)。丟棄上清液且將血小板沉澱重新懸浮在50 μ I的無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中且在分離RNA之前在-80°C下存儲。通過螢光激活細胞分選術(FACS)來考察分離的血小板，使用抗 CD45 (BD Biosciences)、CD235a (DAKO)和 CD61(BDBiosciences)的單克隆抗體以鑑別白細胞、紅細胞和血小板。通過FACS分析,分離的血小板的純度為99. 72%。RNA 分離根據生產商用於液體樣品的方案,用mirVana PARIS試劑盒(Ambion. Inc.)來分離血小板RNA。改進方案，以用等體積的酸-苯酚氯仿來提取樣品兩次，且在最後的洗滌步驟後和洗脫之前，使柱子乾燥3分鐘。將樣品從50 μ I濃縮到12 μ 1，其中5 μ I被用於如下所述的Illumina陣列中。通過定量實時PCR的表達分析為了確認微陣列分析，選擇在患者和對照之間差異表達的miRNA以用於實時PCR。將來自RNA分離的洗脫液的8μ I的固定體積用作逆轉錄反應中的輸入。用miScript逆轉錄試劑盒(Qiagen)或TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems)來使輸入RNA逆轉錄。用 HighResolution Melting Master (Roche)來進行 miR340*、miR451 和 miR624*的實時 PCR。通過 TaqMan MicroRNA 測定(Applied Biosystem)和 LightCycler480probemaster (Roche)來進行 miR454*、miR545 :9. I 和 miR615_5p 的實時 PCR。兩個實時 PCR 均在LightCycler480系統II (Roche)上進行。用LinRegPCR定量PCR數據分析軟體版本12. 3來分析MiR340*、miR451和miR624*。用LinRegPCR定量PCR數據分析軟體版本12. 5來分析MiR454*和miR545 :9. I。至今，還沒有確立標準化的方案以標準化且確認miRNA的含量。出於該目的，在計算NO值後，將數據對於血小板計數和miRNA223兩者標準化，miRNA 223在所有的受試者中的表達是類似的。使用用於Windows的社會科學統計包(StatisticalPackage for the Social Sciences, SPSS)版本 11. 0 (SPSS. Chicago IL),將結果表不成平均值土SEM。由於分布不是正態的，miRNA被log轉換。對於所有的分析，認為P值< O. 05表示在統計學上有顯著性差異。
結果候選miRNA的確議確認群組I在確認群組I中，通過實時PCR，首先確認通過微陣列分析鑑別的7個差異表達的miRNA。該群組由40位患有早發CAD的選定患者和40位健康匹配對照組成。在陣列分析中觀察到的7個miRNA中，與對照相比，2個miRNA (miR340*和miR624*)在患者中被顯著上調(圖3)。確認群組II在首次確認後，我們在第二個，我們的早發CAD門診診所的患者的更為通常的組中確認我們的結果。這個群組由4個家族組成，包括27位患者和40位家族成員。在陣列分析中觀察到的7個miRNA中，與對照相比，2個miRNA(miR340*和miR624*)在患者中被顯著上調(圖3)。藥物使用和血小板miRNA表達為了考察使用藥物是否會影響兩個候選miRNA(miR340*和miR624*)的miRNA表達水平，在我們服用藥物和不服用藥物的對照個體中測定這些miRNA的表達，如方法部分所描述的。有趣的是，藥物並沒有使結果改變。表I :臨床特徵
臨床特徵患者(η = 12)對照(η = 12)
收集數據時的年齡(歲，(SD))~ 46(6.5)45(7. 0)
CAD開始的年齡(歲，(SD)) 42(7.6)不適用
目前吸菸(數目；(％ ))W)1(8)
高膽固醇血症2(17)O
高血壓2(17)O
表2 :圖I中所描述的214個差異表達的miRNA的名稱(調整的P < 0. 05) Ihsa-miR-659〔0173U 14 hsalmiR-1206〔0174U 15 hsalmiR-1205〔0175U 16 hsalmiR-646〔0176U 17 hsa-miR-367*
〔0177〕 18 HSI268〔017s 19 HSI177〔0179U 20 hsa-miRI455-3pI--I0180U 21 hsalmiR-1243〔0181〕 22 HSI265· I〔0182U 23 hsa-miR-491—3p〔01 Su 24 HSI23〔0184U 25 HSI106〔0185U 26 hsa-miR-214* 〔0186U 27 HSI25〔0187U 28 HSI168I--I0188U 29 hsa-miRI548i〔0189U 30 hsa-miR-20b*
〔019s 31 HSI182. I
〔0191U 32 hsalmiR-572
〔0192U 33 hsalmiR—106a :9· I
〔0193U 34 hsalmiR-663
〔0194U 35 hsalmiR-596
I--I0195U 36 solexa-15144487
I--I0196U 37 hsa-miR-581
〔0197U 38 HSI141
〔0198U 39 hsa-miR-138-2*
〔0199U^2
28
40hsa-miR-58341hsa-miR-64142hsa-miR-516a~3p, hsa_miR-516b*43hsa-miR-64744HS—284. I45hsa-miR-518d_3p46hsa-miR-560 :9. I47solexa-9578-86 48hsa-miR-61449hsa-miR-548m50hsa-miR-123151HS—4052hsa-miR-50753HS—71. I54hsa_miR-146a*55hsa_miR-520b，hsa-miR-520c_3p，hsa-miR_520f56HS—304—b57IIS—26758hsa-miR-57059hsa-miR-14460HS—4961hsa-miR-64862hsa_miR-526b63hsa-miR-63464HS—17065hsa-miR-120066hsa-miR-14767hsa-miR-126968hsa-miR-34669hsa_miR-1255b70hsa-miR-548c-3p71HS—9072hsa-miR-125873HS—9574hsa-miR-56975HS—14776hsa-miR-100*77hsa-miR-126178hsa-miR-195*
權利要求
1.用於確定受試者是否處於患心血管疾病的風險中的方法，所述方法包括用所述受試者的樣品來測定至少一種HiiRNA的(相對)表達水平，所述miRNA選自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280 及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組，且將所述至少一種miRNA的表達水平和參考值進行比較，其中所述比較的結果指示所述個體是否處於患心血管疾病的風險中。
2.根據權利要求I所述的方法，其中測定至少兩種miRNA的(相對)表達水平，其中所述至少兩種miRNA中的第一種為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，且所述至少兩種miRNA中的第二種選自由miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615-5p>hsa-miR-451>hsa-miR-1280及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組，所述方法還包括將所述至少兩種miRNA的表達水平和參考值進行比較，其中所述比較的結果指示所述個體是否處於患心血管疾病的風險中。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述第二種miRNA選自由miR-624*、miR-454*、hsa-miR-451及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述第二種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法還包括測定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的(相對)表達水平，且將所述第一種miRNA、第二種miRNA及又一種miRNA的表達水平與參考值進行比較，其中所述比較的結果指示所述個體是否處於心血管疾病的風險中。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中使用全血樣品。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，包括測定所述樣品中的所述至少一種miRNA的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的所述至少一種miRNA的所述表達水平為至少I. 50倍的增加，其中所述miRNA選自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA 中任一個的同源物和直系同源物組成的組。
7.根據權利要求2-5中任一項所述的方法，包括測定所述樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 50倍的增加，且測定所述樣品中的所述第二種miRNA的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的所述第二種miRNA的表達水平為至少I. 50倍的增加。
8.根據權利要求4或5所述的方法，包括測定所述樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 50倍的增加；測定所述樣品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 50倍的增加；且測定所述樣品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的miR-454和/或miR-454的同源物和/或直系同源物的表達水平為至少I. 50倍的增加。
9.根據權利要求3-8中任一項所述的方法，還包括測定所述樣品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表達水平是否相對於未處於心血管疾病的風險中的健康個體的樣品中的hsa-miR-1280或其同源物或直系同源物的表達水平為至少I. 50倍的減少。
10.用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的方法，包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和/或巨核細胞中的選自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA 中任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少一種miRNA的靶的量、表達和/或活性。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述至少一種miRNA為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，所述方法還包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和/或巨核細胞中的選自由miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的靶的量、表達和/或活性。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述又一種miRNA選自由miR-624*、miR_454*、hsa-miR-451及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述又一種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法還包括增加患有所述疾病或處於患所述疾病的風險中的受試者的血小板和/或巨核細胞中的miR-454的靶或miR-454的同源物或直系同源物的靶的量、表達和/或活性。
14.根據權利要求10-13中任一項所述的方法，其中所述miRNA的靶的量、表達和/或活性的所述增加是通過抑制所述血小板和/或所述巨核細胞中的所述miRNA的表達或活性而介導的。
15.用作藥物的miRNA的抑制劑，所述miRNA選自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. l、hsa-miR-615-5p、hsa_miR-451 及這些 miRNA 中任一個的同源物和直系同源物組成的組。
16.用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病的miRNA的抑制劑，所述miRNA選自由 hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組。
17.一種藥物組合物，包括至少一種根據權利要求15所述的抑制劑和藥學上可接受的賦形劑。
18.根據權利要求17所述的藥物組合物，其中所述組合物包括至少一種miRNA的抑制齊U，其中所述miRNA為hsa-miR-340或hsa-miR-340的同源物或直系同源物。
19.根據權利要求18所述的藥物組合物,其中所述組合物還包括至少一種miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的抑制劑。
20.根據權利要求19所述的藥物組合物,其中所述組合物還包括至少一種miR-454*或miR-454*的同源物或直系同源物的抑制劑。
21.根據權利要求17-20中任一項所述的藥物組合物，用於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病。
22.根據權利要求1-14中任一項所述的方法，或根據權利要求16所述的抑制劑，或根據權利要求21所述的藥物組合物，其中所述心血管疾病選自由動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、短暫性腦缺血發作、中風、周圍性血管疾病、急性冠脈症候群、穩定性心絞痛、血管性痴呆和腎衰竭組成的組。
23.多個部件的試劑盒，包括能夠特異性地結合到選自由hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9· I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280 及這些 miRNA 中任一個的同源物和直系同源物組成的組的至少一種miRNA上的至少一種分子，在根據權利要求1-9中任一項所述的方法中使用所述試劑盒的說明書頁，及任選地一個或多個對照和/或一個或多個標準品。
24.根據權利要求23所述的多個部件的試劑盒，包括能夠特異性地結合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物的至少一種分子，能夠特異性地結合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物的至少一種分子,及能夠特異性地結合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物的至少一種分子。
25.核酸分子的陣列，包括固定在平臺上的分子，其中至少部分的所述分子能夠特異性地結合到選自由 hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及其同源物和直系同源物組成的組的至少四種miRNA上。
26.根據權利要求25所述的陣列，其中至少部分的所述分子能夠特異性地結合到hsa-miR-340*和/或hsa-miR-340*的同源物和/或直系同源物上，至少部分的所述分子能夠特異性地結合到miR-624*和/或miR-624*的同源物和/或直系同源物上，且至少部分的所述分子能夠特異性地結合到miR-454*和/或miR-454*的同源物和/或直系同源物上。
27.用於鑑別對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病有用的化合物的方法，包括使患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的受試者的第一樣品的血小板與候選化合物接觸，測定相對於未接觸所述候選化合物的所述受試者的第二樣品的血小板的至少一種miRNA的表達,所述第一樣品的所述血小板的至少一種miRNA的表達水平,所述miRNA選自由 hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-1280及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組，其中相對於所述第二樣品中的所述至少一種miRNA的表達,所述第一樣品中的所述至少一種miRNA的表達指示所述化合物對於治療、減弱、延遲和/或預防心血管疾病是否有用。
28.用於監測受試者中的抗血小板治療效果的方法，所述方法包括測定相對於受試者的第二樣品的至少一種miRNA的表達水平，所述受試者的第一樣品的所述至少一種 miRNA 的表達水平，所述至少一種 miRNA 選自由 hsa-miR-340*、miR-624*、miR-454*、miR-545:9. l、hsa-miR-615-5p、hsa-miR-451、hsa_miR-1280 及這些 miRNA 中任一個的同源物和直系同源物組成的組，其中相對於所述第一樣品的所述至少一種miRNA的表達水平，所述第二樣品的所述至少一種miRNA的表達水平是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。
29.根據權利要求26所述的方法，其中所述受試者患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中。
30.根據權利要求27-29中任一項所述的方法，其中所述至少一種miRNA為hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物，所述方法還包括測定選自由miR-624*、miR-454*、miR-545:9. I、hsa-miR-615_5p、hsa-miR-451 及這些 miRNA 中任一個的同源物和直系同源物組成的組的又一種miRNA的表達水平，其中相對於所述第一樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達,所述第二樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合所述又一種miRNA的表達是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血 小板的治療。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述又一種miRNA選自由miR-624*、miR_454*、hsa-miR-451及這些miRNA中任一個的同源物和直系同源物組成的組。
32.根據權利要求31所述的方法，其中所述又一種miRNA為miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物，所述方法還包括測定miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達水平，其中相對於所述第一樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平聯合miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達且聯合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達，所述第二樣品的所述hsa-miR-340*或hsa-miR-340*的同源物或直系同源物的表達水平和miR-624*或miR-624*的同源物或直系同源物的表達且聯合miR-454或miR-454的同源物或直系同源物的表達是所述抗血小板治療的效果的指示，且其中所述受試者在所述第一樣品和所述第二樣品之間已經接受了抗血小板的治療。
全文摘要
本發明涉及醫學，具體涉及內科醫學和/或心臟病學。本發明通過測量存在於患者的樣品中的miRNA，提供用於給樣品分型及鑑別和/或治療患有心血管疾病或處於患心血管疾病的風險中的患者的手段和方法。本發明還提供用於鑑別新的心血管疾病治療的手段和方法。
文檔編號C12Q1/68GK102884206SQ201180019868
公開日2013年1月16日 申請日期2011年4月21日 優先權日2010年4月21日
發明者E·E·J·M·克裡莫斯, 莎拉·約翰娜·平託-希茨馬 申請人:阿姆斯特丹大學學術醫學中心