生產2-脫氧蟹肌醇(doi)的細菌及使用其生產2-脫氧蟹肌醇(doi)的方法

2023-06-09 20:13:26 3

專利名稱：生產2-脫氧蟹肌醇(doi)的細菌及使用其生產2-脫氧蟹肌醇(doi)的方法
技術領域：
本發明涉及一種由蔗糖生產2-脫氧蟹肌醇Q-deoxy-scyllo-inosose ；D0I)的細菌和使用其生產DOI的方法。
背景技術：
2-脫氧蟹肌醇(以下也稱作D0I)為可用作藥物原料和化學工業資源的有用物質。 例如，根據日本特開2000-236881號公報可知，2-脫氧蟹肌醇可以使用重組DOI合成酶由葡糖-6-磷酸(G-6-P)通過短工序生產，其中，所述重組DOI合成酶是使用大腸桿菌得到的。 進而，例如如國際公開2006/109479號說明書所述，也已經開發了使用表達DOI合成酶的大腸桿菌由葡萄糖以一步法生產DOI的方法。由此，可以由來自植物的資源得到葡萄糖，再由該葡萄糖來生產DOI。但是，根據Journal of Biotechnology,Vol. 129,pp. 502-509(2007)可知，國際公開2006/109479號說明書中記載的生產DOI的方法中，在使用葡萄糖作為原料的同時，為了菌體的增殖/生長，還需要甘露糖醇，而甘露糖醇是一種稀少且昂貴的糖。根據Journal of Biotechnology, Vol. 129，pp. 502-509 (2007)，可知在野生型大腸桿菌中表達DOI合成酶時 DOI的生產率僅為1.5g/L，為了達到高生產率5g/L)，需要同時破壞大腸桿菌所具有的下述3個酶的基因，即磷酸葡糖異構酶(pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(ZWf)及葡糖磷酸變位酶(Pgm)。由此可以得到下述結論葡萄糖進入糖酵解系統的代謝途徑被完全阻斷，因此為了菌體的增殖/生長，還需要可用於糖酵解系統的糖(例如甘露糖醇)。另外，還可知為了得到同樣高的DOI生產率，雖然也可以僅同時破壞pgi基因和zwf基因2個基因，但由於此時如果以葡萄糖作為唯一的碳源則菌體也不能增殖，所以用於菌體增殖/生長的甘露糖醇也是必需的。另一方面，已知蔗糖為比葡萄糖還廉價的糖原料。蔗糖為廢糖蜜的主成分，人們期待同化蔗糖生產DOI的大腸桿菌在生產可用於工業的廉價的DOI方面是有用的。但是，同化蔗糖生產DOI的細菌到目前為止還完全不存在。例如，根據日本特開2001-346578號公報，微生物同化蔗糖的機制大致分為蔗糖 PTS (Phosphoenolpyruvate :Carbohydrate Phosphotransferase System)禾口蔴糖非 PTS 兩種。經由蔗糖非PTS的情況下，微生物直接攝入蔗糖，然後分解成葡萄糖和果糖。另一方面， 經由蔗糖PTS的情況下，微生物攝入蔗糖時將蔗糖磷酸化，轉化為蔗糖-6-磷酸。然後在微生物內部分解成葡糖-6-磷酸和果糖。S卩，即使經由任意機制，來自蔗糖的果糖也首先以未被磷酸化的形式出現在微生物內部。並且為了使上述未被磷酸化的果糖(以下稱作非磷酸化果糖)進入糖酵解系統，需要將果糖異構化為葡萄糖或將其磷酸化。但是，FEMS Yeast Res, Vol.5, pp.1055-1062 (2005)、PNAS, Vol. 98(26)，pp.15257-15259(2001)、及 J Bacteriology, Vol. 184(19)，pp. 5307-5316(2002)指出，該微生物為大腸桿菌時，將非磷酸化果糖異構化為葡萄糖的活性、將果糖磷酸化的活性均非常低。因此，即使成功地使大腸桿菌內部出現非磷酸化果糖，但只要不採用特別的方法，則不能期待該大腸桿菌同化非磷酸化果糖。Can. J. Microbiol.，Vol. 45，pp. 418-422 (1999)公開了通過在大腸桿菌中只導入蔗糖水解酶基因(cscA)而能夠使大腸桿菌以蔗糖為原料進行增殖。另一方面，以蔗糖為原料由大腸桿菌生產DOI中重要的一點是利用來自蔗糖的果糖實現菌體的增殖/生長。因此上述文獻中自始至終只公開了蔗糖和葡萄糖被攝入菌體內的信息，完全沒有公開來自蔗糖的果糖以何種程度被同化的數據。

發明內容
如上所述，由於需要葡萄糖來生產D0I，另外還需要作為高價糖的甘露糖醇等來使菌體增殖，所以現有已知的生產DOI的大腸桿菌在工業生產DOI方面存在問題。因此，本發明的目的在於提供一種生產DOI的大腸桿菌及使用其生產DOI的方法， 所述生產DOI的大腸桿菌能夠由作為廉價糖的蔗糖有效地生產D0I。本發明是鑑於上述情況完成的，本發明的生產DOI的大腸桿菌及生產DOI的方法如下。[1] 一種生產DOI的大腸桿菌，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中，至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，同時被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統或具有被增強的 2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統。[2]如[1]所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中只具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因。[3]如[1]或[2]所述的生產DOI的大腸桿菌，所述生產DOI的大腸桿菌具有糖攝入能力增強系統。[4]如[3]所述的生產DOI的大腸桿菌，所述生產DOI的大腸桿菌中，選自由該大腸桿菌本身具有的磷酸葡糖異構酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)、葡糖磷酸變位酶(Pgm)及負責穩定期中蛋白質合成修飾的核糖體修飾因子(Rmf)組成的組中的至少1種活性失活或活性降低。[5]如[1] [4]中任一項所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述生產DOI的系統來自DOI合成酶(BtrC)活性。[6]如[3] [5]中任一項所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述糖攝入能力增強系統為葡萄糖轉運促進蛋白質(glucose facilitator, Glf)活性的增強。[7]如[1] W]中任一項所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因來自大腸桿菌細菌。[8]如[7]所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述大腸桿菌細菌是大腸桿菌 0-157細菌。[9]如[6] [8]中任一項所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf)來自發酵單胞菌屬細菌。[10]如[9]所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述發酵單胞菌屬細菌為運動發酵單胞菌細菌。[11]如[1] [10]中任一項所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述生產DOI的大腸桿菌是本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌。[12]如[11]所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，上述生產DOI的大腸桿菌是B株或其衍生株。[13] 一種生產DOI的方法，包括使用[1] [12]中任一項所述的生產DOI的大腸桿菌由含有蔗糖的來自植物的原料生產D0I。根據本發明，能夠提供一種以蔗糖作為唯一碳源有效地生產DOI的生產DOI的大腸桿菌及使用其生產DOI的方法。


[圖1]為表示本發明的實施例11中所得的細菌株的DOI生產率的圖。[圖2]為表示本發明的實施例12中所得的細菌株的DOI生產率的圖。
具體實施例方式本發明的生產DOI的大腸桿菌是在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶 (CscA)的基因、並且被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇 (DOI)生產系統的生產DOI的大腸桿菌。本發明發現利用下述生產DOI的大腸桿菌，能夠同化來自蔗糖的果糖，以蔗糖為唯一的碳源且以極高的生產效率生產DOI，所述生產DOI的大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因、同時被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統。其結果，能夠由來自植物、廉價且工業上經常使用的蔗糖有效地獲得DOI。即，本發明的生產DOI的大腸桿菌能夠將來自蔗糖的果糖磷酸化並攝入菌體內， 同時能夠使用糖酵解系統將該果糖轉化為用於菌體增殖/生長的能量。如上所述，還沒有將來自蔗糖的果糖用作菌體增殖的營養源、同時利用大腸桿菌生產DOI的報告例。如果進一步對其進行說明，蔗糖水解酶(CscA)被認為是在大腸桿菌的細胞膜上幾乎不存在的酶(參見 Can. J. Microbiol.，Vol. 45，pp. 418-422 (1999))，另一方面，生產 DOI的大腸桿菌作為不能將非磷酸化果糖攝取進入糖酵解系統、僅能利用磷酸化果糖用於其生長的生產DOI的大腸桿菌而被構建(參見W02006/109479號說明書)。在上述生產 DOI的大腸桿菌中，在蔗糖非PTS基因組中至少導入編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，賦予了 CscA活性，結果與預想大大相反，能夠得到可將果糖用作營養源的生產DOI的大腸桿菌。 結果所得到的本發明的生產DOI的大腸桿菌，儘管在作為對大腸桿菌而言是最易利用的糖的葡萄糖的存在下，也能有效地同化蔗糖或作為其分解產物的果糖來生產D0I，因此可以不需要使葡萄糖減少或枯竭而生產DOI，是更有效的。已知蔗糖被分解時生成等量的葡萄糖和果糖，但一般來說大腸桿菌通常與果糖相比優先攝入葡萄糖，在葡萄糖的存在下果糖不能被充分代謝。因此，令人驚訝的是，例如通過調節菌體培養時的PH，可以不受由葡萄糖引起的代謝抑制(分解代謝物阻抑)的影響，在大腸桿菌的生長中有效地利用果糖。以下詳細說明本發明。本說明書中用「 」表示的數值範圍，表示包括分別以「 」前後記載的數值作為最小值及最大值的範圍。
本發明中所謂「蔗糖的同化」，是指將蔗糖直接、低分子化或高分子化後、優選低分子化後引入生物體內的能力，或者代謝性地轉化為其他物質的能力。另外，本發明中，所謂同化包括將蔗糖進一步低分子化的分解。具體而言，包括將蔗糖分解為D-葡萄糖和D-果糖。本發明中所謂「蔗糖非PTS基因組」，是指微生物的蔗糖同化途徑中與非PTS系統有關的基因組。具體而言，是由編碼阻抑蛋白(CscR)的基因(cscR)、編碼蔗糖水解酶 (CscA)的基因(cscA)、編碼果糖激酶(CscK)的基因(cscK)、編碼蔗糖透過酶(CscB)的基因(cscB)組成的基因組。本發明中，只要至少含有其中的cscA即可，例如可以舉出僅有 cscA、cscA 與 cscK 的組合、cscA 與 cscB 的組合、cscA 與 cscR 的組合、cscA 與 cscB 與 cscR 的組合、cscA與cscK與cscR的組合、cscA與cscK與cscB的組合、cscA與cscK與cscB 與cscR的組合。其中，從更有效地生產DOI的觀點考慮，優選只含有cscA，不含其它的基因。本發明中所謂「蔗糖水解酶(CscA) 」，是指基於國際生物化學聯合(I.U.B.)酶委員會報告被歸屬於酶編號3. 2. 1.沈、催化由蔗糖生成D-葡萄糖和D-果糖的反應的酶的總稱。需要說明的是，K-12株及B株等大腸桿菌本身不具有該酶。本發明中，通過在大腸桿菌中至少導入蔗糖非PTS基因組中的cscA而賦予CscA 活性，特別是通過在大腸桿菌中僅導入蔗糖非PTS基因組中的cscA而僅賦予CscA活性，由此將存在於菌體外的蔗糖在細胞膜上分解為葡萄糖和果糖並向細胞外釋放，通過大腸桿菌本身具有的葡萄糖PTS及果糖PTS將其一邊進行磷酸化一邊攝入細胞質內。其結果，存在於細胞外的果糖以果糖-1-磷酸的形式出現在菌體內，然後，利用菌體內存在的果糖-1-磷酸激酶(FruK)轉化為果糖-1，6-磷酸，進入糖酵解系統。作為本發明的導入宿主細菌的蔗糖水解酶(CscA)的基因(cscA)，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因的鹼基序列的DNA， 或者利用基於其公知的鹼基序列合成的合成DNA序列。作為優選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(ftOteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。特別優選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。另外優選在cscA中添加用於使CscA向菌體的外周胞質轉移的信號序列。作為本發明的能夠被導入宿主細菌的阻抑蛋白(CscR)的基因，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼阻抑蛋白(CscR)的基因的鹼基序列的DNA，或者利用基於其公知的鹼基序列合成的合成DNA序列。作為優選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。特別優選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。作為本發明的能夠被導入宿主細菌的果糖激酶(CscK)的基因，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼果糖激酶(CscK)的基因的鹼基序列的DNA，或者利用基於其公知的鹼基序列合成的合成DNA序列。作為優選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、 變形桿菌屬菌(Proteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌(Agrobacterium)、根瘤菌屬菌 (Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。特別優選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。作為本發明的能夠被導入宿主細菌的蔗糖透過酶(CscB)的基因，可以利用從具有該酶的生物中得到的、具有編碼蔗糖透過酶(CscB)的基因的鹼基序列的DNA， 或者利用基於其公知的鹼基序列合成的合成DNA序列。作為優選例，可以舉出來自歐文菌屬菌(Erwinia)、變形桿菌屬菌(ftOteus)、弧菌屬菌(Vibrio)、農桿菌屬菌 (Agrobacterium)、根瘤菌屬菌(Rhizobium)、葡萄球菌屬菌(Staphylococcus)、雙歧桿菌屬菌(Bifidobacterium)、埃希氏菌屬菌(Escherichia)的基因，例如可以舉出具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。特別優選為具有來自大腸桿菌0-157株的基因的鹼基序列的DNA。需要說明的是，本發明中所謂「宿主細菌」，是指接收從菌體外導入的一個以上的基因，結果成為本發明的生產DOI的大腸桿菌的該大腸桿菌。本發明中所謂「D0I生產系統」，是指用於賦予DOI生產能力的結構，所述結構是通過基因重組被導入或改變而得到的。上述的DOI生產系統可以為使用作對象的大腸桿菌中 DOI生產量增加的系統中的任意系統。可以優選舉出與DOI生產有關的酶活性的賦予或增強或它們的組合。如上所述， 與上述的CscA活性組合，即使為本身不具有蔗糖同化能力的大腸桿菌，也能有效地由蔗糖生產DOI。本發明中所謂「賦予」或「增強」，是指除了將編碼酶的基因從宿主細菌的菌體外導入菌體內之外，還包括通過將宿主細菌基因組上具有的酶基因的啟動子活性增強或者將其取代為其他啟動子而增強酶基因的表達。本發明中「利用基因重組」的用語，包括全部通過在原有基因的鹼基序列中插入其他DNA、或基因的某部分的取代、缺失或它們的組合而產生的鹼基序列上的改變，該改變例如可以是通過突變產生的。本發明中的DOI生產系統，從DOI的生產效率的觀點考慮，優選為來自DOI合成酶 (BtrC)活性的系統，可以通過導入DOI合成酶基因(btrC)而賦予大腸桿菌上述DOI合成酶。已知DOI合成酶(BtrC)為催化由葡糖_6_磷酸生成2_脫氧蟹肌醇(DOI)的反應的酶，是42kDa和23kDa的二聚體肽，在鈷離子的存在下酶活性被促進，在鋅、銅離子的存在下酶活性被抑制，以NAD+為輔酶進行反應(例如參見日本特開2000-236881號、 W02006/109479號)。btrC基因可以使用來自具有該基因的生物的基因中的任意基因，例如可以舉出來自桿菌屬細菌的btrC基因。作為btrC基因，其中，從DOI的生產效率的觀點考慮，可以優選使用來自環狀芽胞桿菌(環狀芽胞桿菌)的編碼42kDa亞單位的基因 (GenBank 檢索號 AB066276)。本發明中的生產DOI的大腸桿菌，優選為具有糖攝入能力增強系統的大腸桿菌。本發明中所謂糖攝入能力，是指通過生物體膜的糖輸送能力，該能力也包括對從生物體膜的外側向內側的糖輸送或從生物體膜的內側向外側的糖輸送的作用。作為糖輸送中的糖，包括五碳糖或六碳糖。具體而言，可以舉出葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖等，可以優選舉出葡萄糖。本發明中所謂「具有糖攝入能力增強系統」，是指上述糖從菌體外到菌體內的攝入增加的狀態。本發明中所謂「糖攝入能力增強系統」，優選指用於使葡萄糖的攝入能力提高的結構。更優選為，該糖攝入能力增強系統與PTS系統或非PTS系統不同，例如為將菌體外的葡萄糖以其原形攝入菌體內的系統。被攝入的葡萄糖之後被菌體具有的葡糖激酶(Glk) 等磷酸化酶磷酸化，成為可用作物質生產的基質。如上所述，大腸桿菌除了具有本身具有的 PTS系統或非PTS系統的糖攝入系統之外，還變得具有新的糖攝入系統。本發明中的糖攝入能力增強系統，從DOI的生產率的觀點考慮，優選為葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf)活性增強的系統。本發明中所謂葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf)，是指具有將D-葡萄糖或D-果糖等從生物體膜的外側輸送到內側的作用的蛋白質的總稱。已知導入了 glf基因的大腸桿菌中甘露糖醇的生產率提高的技術(例如參見日本特表2006-503559號)、或L-苯基丙氨酸或莽草酸的生產率提高(日本特表2002-512802號公報、Applied Microbiology and Biotechnology (2004)，64，333-339)，但是完全不知道葡萄糖轉運促進蛋白質基因(glf) 的導入在生產DOI的大腸桿菌中是否也顯示出生產率提高的效果。需要說明的是，如下所述，導入glf基因對提高乳酸的生產率沒有效果。因此，導入glf基因在以糖為原料的物質生產中並不是有效的通用技術，本發明中能夠通過導入glf基因有效地生產DOI是出乎意料之外的。作為本發明的導入至宿主細菌中的葡萄糖轉運促進蛋白質的基因(glf)，可以利用來自具有該蛋白質的生物的具有編碼葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf)的基因的鹼基序列的DNA或基於其公知的鹼基序列合成的合成DNA序列。可以優選舉出來自酵母或發酵單胞菌屬細菌的基因，較優選為來自發酵單胞菌屬細菌的基因，例如可以舉出具有來自運動發酵單胞菌的基因的鹼基序列的DNA。特別優選為具有來自運動發酵單胞菌的基因的鹼基序列的DNA。作為本發明的較優選方案的生產DOI的大腸桿菌，從蔗糖的分解能力的觀點考慮，蔗糖水解酶(CscA)活性可以通過導入對來自埃希氏菌屬細菌的各蛋白質進行編碼的基因而得到，從提高DOI的生產率的觀點考慮，葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf)活性可以通過導入對來自發酵單胞菌屬細菌的各蛋白質進行編碼的基因而得到。較優選為，上述蔗糖水解酶(CscA)可以通過導入對來自大腸桿菌0-157細菌的各蛋白質進行編碼的基因而得到， 葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf)可以通過導入對來自運動發酵單胞菌細菌的各蛋白質進行編碼的基因而得到。通過使用來自上述細菌的基因，可以確實地表達上述基因的功能。作為本發明中用於使各種基因表達的啟動子，只要為可以控制上述任意基因表達的啟動子即可，但通常為在微生物內發揮作用的強啟動子，並且優選為即使在葡萄糖存在下表達也不易受到抑制的啟動子，具體而言可以舉出甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下有時稱作GAPDH)的啟動子或絲氨酸羥甲基轉移酶的啟動子。本發明中所謂賦予各活性的大腸桿菌，是指利用從菌體外到菌體內的任何方法基於酶或蛋白質賦予了活性的大腸桿菌。上述大腸桿菌可以使用下述方法製備例如使用基因重組技術將編碼該酶及蛋白質的基因從菌體外導入菌體內等方法。從菌體外向菌體內導入基因時所需要的基因組DNA的製備、DNA的切斷及連接、轉化、PCR(Polymerase Chain Reaction)、用作引物的寡核苷酸的設計、合成等方法，可以利用本領域技術人員所熟知的一般方法進行。上述方法記載在 Sambrook, J. , et. al. ,"Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等中。為了以儘可能高的收率生產DOI，本發明的優選方案中，選自由宿主細菌具有的與葡糖-6-磷酸的代謝有關的以下的酶和與控制穩定期中蛋白合成有關的核糖體修飾因子 (Rmf)組成的組中的至少1種的活性失活或降低，所述與葡糖-6-磷酸的代謝有關的酶為磷酸葡糖異構酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)及葡糖磷酸變位酶(Pgm)。上述方案中，或者分別單獨對分別編碼上述各酶的基因(分別為Pgi基因、zwf基因及Pgm基因)進行基因破壞、或者同時對2種基因(pgi基因和zwf基因、pgi基因和pgm基因)進行基因破壞、或者同時對3種基因進行基因破壞，並且，或者單獨對編碼與穩定期中的蛋白合成的控制有關的RMF蛋白質的基因(rmf基因)進行基因破壞，或者對上述與葡糖-6-磷酸的代謝有關的酶進行編碼的基因被破壞了的各種基因破壞株進行rmf基因的破壞。如上所述，能夠抑制因菌而引起的作為用於生產DOI的直接基質的葡糖-6-磷酸的分解代謝，另外通過穩定期中的蛋白質合成能夠提高生產DOI的能力。上述生產DOI的細菌，例如記載於國際公開2006/109479號說明書中。作為本發明中生產DOI的大腸桿菌，更優選為磷酸葡糖異構酶(Pgi)及葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)的活性同時失活或降低的大腸桿菌。最優選為磷酸葡糖異構酶O^gi)及葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)及葡糖磷酸變位酶(Pgm)的活性同時失活或降低的大腸桿菌。作為用於使各種酶失活的方法，只要為出於上述目的通常使用的方法即可，可以沒有特殊限制地使用，例如可以舉出通過編碼酶的基因的同源重組等引起的基因破壞。上述基因的破壞可以為染色體上的基因的破壞，也可以為質粒基因的破壞。另外，本發明中的大腸桿菌，考慮到DOI的合成，可以使用破壞各種染色體/質粒基因所得到的破壞株。本發明中所謂「失活」，是指利用現有的測定系統測定的該酶的活性在檢測限以下的狀態。本發明中所謂「降低」，是指通過編碼該酶的基因的基因重組，與進行上述處理前的狀態相比，該酶的活性顯著下降的狀態。本發明中的酶的活性，可以為利用現有的測定系統中的任一種測定得到的活性。本發明中所謂「基因破壞」，是指為了使某基因的功能不能發揮而在該基因的鹼基序列中引入突變、插入其他的DNA或者使基因的某部分缺失。基因破壞的結果為該基因不能轉錄為mRNA，而使結構基因不被翻譯；或者被轉錄的mRNA不完全，而使被翻譯的結構蛋白質的胺基酸序列中產生突變或缺失，不能發揮原有的功能。基因破壞株的製備可以使用任意方法，只要能得到該酶或蛋白質不表達的破壞株即可。已經報導了多種基因破壞的方法(自然育種、突變劑添加、紫外線照射、放射線照射、隨機突變、轉座子、部位特異性基因破壞)，但從能夠僅破壞某種特定基因的方面考慮，優選利用同源重組進行基因破壞。利用同源重組的方法記載於J. Bacteriol.，161，1219-1221 (1985)或 J. Bacteriol.，177，1511-1519 (1995)或 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 97,6640-6645(2000)中，本領域技術人員可以利用上述方法及其應用容易地實施。本發明中使用的大腸桿菌，可以為能導入及改變上述各基因的任意大腸桿菌。較優選為本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌，作為上述大腸桿菌，可以舉出埃希氏菌屬Escherichia)細菌等，特別優選使用便利性高、工業上使用的實際成果豐富的大腸桿菌(Escherichia coli 大腸桿菌)。例如可以舉出K-12株、B株、C株及其衍生株等。如上所述，可以擴大本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌的用途。本發明的生產DOI的大腸桿菌，優選使用本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌中的B株及其衍生株。通過使用B株及其衍生株構築本發明的生產DOI的大腸桿菌， 可以使用作為常用工業培養基的玉米漿而得到高DOI生產率。大腸桿菌通常被分類為Κ-12 株、B株、C株。廣泛使用Κ-12衍生株和B衍生株作為工業上物質生產的宿主，兩者均能通過基因重組表達異源蛋白質，但是，到目前為止，有關B株在DOI的生產中為優選的宿主方面的知識完全屬於未知。因此，在DOI的生產中B衍生株與Κ-12衍生株相比顯示出明顯高的生產率是無法預料的特異現象。本發明的生產DOI的方法包括使用上述生產DOI的大腸桿菌、由含有蔗糖的來自植物的原料生產2-脫氧蟹肌醇，即，包括使上述生產DOI的大腸桿菌與含有蔗糖的來自植物的原料接觸的工序、和對通過接觸所得到的DOI進行回收的回收工序。需要說明的是，本說明書中所說的用語「工序」，不僅指獨立的工序，即使在不能與其他工序明確區分的情況下，只要能實現該工序所期望的作用，也在該用語的範圍內。上述DOI生產方法中使用的來自植物的原料，只要為從植物得到的碳源並且經大腸桿菌代謝能夠轉化為DOI的原料即可，沒有特殊限制。本發明中，指根、莖、幹、枝、葉、花、 種子等器官、含有它們的植物體、上述植物器官的分解產物，進而在由植物體、植物器官、或它們的分解產物得到的碳源中，能在微生物的培養中用作碳源的物質也包含在來自植物的原料中。作為上述包含在來自植物的原料中的碳源，除蔗糖之外，作為一般物質可以舉出澱粉、葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖等糖類，或大量含有上述成分的草木質分解產物或纖維素水解物等。進而來自植物油的甘油或脂肪酸也屬於本發明中的碳源。本發明中作為來自植物的原料，可以優選舉出糧食等農作物，例如玉米、米、小麥、 大豆、甘蔗、甜菜、棉花等、或它們的組合，作為該原料的使用形式，可以為未加工品、榨汁、 粉碎物等，沒有特別限定。另外，也可以為只為上述碳源的形式。接觸工序中生產DOI的大腸桿菌和來自植物的原料的接觸通常通過在含有來自植物的原料的培養基中培養生產DOI的大腸桿菌而進行。來自植物的原料和生產DOI的大腸桿菌的接觸密度根據生產DOI的大腸桿菌的活性的不同而不同，通常情況下，作為培養基中的來自植物的原料的濃度，相對於混合物的總質量，以換算為葡萄糖的量計，可以使初始的糖濃度為20質量％以下，從大腸桿菌的耐糖性的觀點考慮，優選使初始的糖濃度為15質量％以下。其他的各成分只要以微生物的培養基中通常添加的量添加即可，沒有特殊限制。另外作為培養基中的生產DOI的大腸桿菌的含量，根據大腸桿菌的種類及活性的不同而不同，但通常情況下可以使初始菌濃度相對於培養液為0. 1質量％ 30質量％，從控制培養條件的觀點考慮，優選為1質量％ 10質量％。本發明中的生產DOI的方法包括下述方法通過在含有生產DOI的大腸桿菌和來自植物的原料的混合物中培養生產DOI的大腸桿菌來同化來自植物的原料，一定時間後使用蒸餾、膜分離、提取等公知技術對培養液中分泌的DOI進行精製。生產DOI的方法中的混合物只要以細菌類的培養中通常使用的基本培養基為主體即可，可以使用根據生產DOI的大腸桿菌的種類而通常使用的培養基中的任一種。上述基本培養基只要是含有碳源、氮源、 無機離子及根據需要使用的其他微量成分的培養基即可，沒有特殊限制。作為碳源，只為上述蔗糖就已足夠，但從DOI的生產效率的觀點考慮，進而可以適當追加使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類；富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸；甲醇、乙醇、甘油等醇類及其它。作為氮源，可以適當使用有機銨鹽、無機銨鹽、氨氣、氨水等無機態氮源、及蛋白質水解物等有機態氮源及其它。作為無機離子，根據需要可以適當使用鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子及其它。作為有機微量成分，可以適當使用維生素、胺基酸等及含有它們的酵母提取物、 腖、玉米漿、酪蛋白分解物及其它。需要說明的是，作為本發明中使用的培養基，如果考慮供應於工業生產，則優選液體培養基。作為培養條件，根據製成的菌體、培養裝置而改變，但通常情況下培養溫度為 20°C 40°C，從DOI的生產效率的觀點考慮，較優選在25°C 35°C下進行培養。另外，可以使PH為pH4 pH9，優選為pH5. 0 ρΗ7· 5，較優選為pH6. 0 ρΗ7· 0，可以用NaOH、NH3等進行調節。培養時間為菌體充分增殖、且DOI生成所需要的時間，沒有特殊限制。培養時通常使用能控制溫度、ρΗ、通氣條件、攪拌速度的培養槽，但本發明培養時不限於使用培養槽。使用培養槽進行培養時，根據需要也可以預先進行作為預培養的種培養，將其必要量接種到預先配製的培養槽內的培養基中。培養本發明中得到的微生物生產DOI時，可以完全不進行通氣，但為了得到較理想結果，優選進行通氣。此處所謂的通氣條件下，未必是必須將空氣通過培養液中，也包括根據培養槽的形狀一邊適度地攪拌培養液一邊將培養液上的空氣層進行換氣之類的上部通氣，是指使含有氧的氣體流入培養槽的內部。通氣到液體中時，由於根據內壓、攪拌槳位置、攪拌槳形狀、攪拌速度的組合使得溶存的氧濃度發生變化，所以可以以DOI的生產率及除DOI之外的有機酸量等為指標如下求出最適條件。例如，使用500g的培養液利用ABLE公司制培養裝置BMJ-Ol等較小型的培養槽進行培養時，通過能夠達到使空氣在常壓下0. 005L/分鐘 2L/分鐘、攪拌速度50rpm 2000rpm，較優選能夠達到使空氣在常壓下0. 05L/分鐘 IL/分鐘、攪拌速度 IOOrpm IOOOrpm的通氣條件，可以得到理想結果。上述的通氣條件不需要從培養初期到結束一直進行，即使在培養工序的一部分中進行也能得到理想結果。回收工序是回收通過該接觸而獲得的DOI的工序，通常情況下從利用上述培養所得的培養物中回收DOI。本發明中所謂的培養物，是指利用上述方法生產的菌體、培養液及它們的處理物。作為從培養物中回收DOI的方法，例如從培養液中回收時，可以利用通常已知的方法。例如，利用離心分離等除去菌體後，將培養上清液添加到離子交換樹脂中，用蒸餾水進行洗脫。可以一邊測定折射率、PH、傳導率一邊分離得到不含雜質的部分，除去其水溶液回收D0I。另外，由於利用本發明的方法生產的菌體生產了適合DOI生產的酶組，所以利用菌體進一步生產、回收DOI也被認為是從培養物回收DOI的方法的一部分。利用本發明，能夠以廉價的來自植物的糖為原料以極高的水平生產D0I。本發明對碳中和(carbon neutral)的DOI的普及極為有用。[實施例]以下記載本發明的實施例，但本發明並不受這些實施例的限制。另外，只要沒有特殊說明，實施例中的「 ％，，為質量基準。[實施例1]大腸桿菌的基因組DNA的全部鹼基序列是公知的(GenBank檢索號U00096)，編碼大腸桿菌的磷酸葡糖異構酶(以下有時稱作pgi)的基因的鹼基序列也已被報導了。為了克隆編碼Pgi的基因(l，650bp)的鹼基序列的附近區域，合成了四種具有下述鹼基序列的寡核苷酸引物CAGGAATTCG CTATATCTGG CTCTGCACG (序列號 1)、CAGTCTAGAG CAATACTCTT CTGATTTTGAG(序列號 2)、CAGTCTAGAT CATCGTCGAT ATGTAGGCC(序列號；3)及 GACCTGCAGA TCATCCGTCA GCTGTACGC(序列號4)。序列號1的引物在5，末端側具有EcoRI識別位點，序列號2及3的引物在5』末端側具有^CbaI識別位點，序列號4的引物在5』末端側具有I^stI 識別位點。利用 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)記載的方法製備大腸桿菌MG1655株的基因組DNA，使用所得的基因組DNA Iyg和下述引物的DNA 各lOOpmol，在通常的條件下進行PCR，由此分別擴增約1. 01Λ (以下有時稱作pgi_L片段及 Pgi-R片段)的DNA片段，所述引物為具有序列號1的鹼基序列的引物和具有序列號2的鹼基序列的引物的組合、具有序列號3的鹼基序列的引物和具有序列號4的鹼基序列的引物的組合。利用瓊脂糖電泳分離上述DNA片段並回收，分別用EcoRI及^CbaI消化pgi-L片段， 用^CbaI及I^stI消化pgi-R片段。將上述2種消化片段與溫度感受性質粒pTH18csl (GenBank 檢索號AB019610)的EcoRI及I^stI消化物混合，利用T4DNA連接酶反應後，轉化到大腸桿菌DH5ci感受態細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到含有編碼pgi的基因的5』上遊附近片段和3』上遊附近片段這2個片段的質粒，將其命名為pTHApgi。[實施例2]將實施例1中得到的質粒ρΤΗ Δ pgi轉化到大腸桿菌MG1655株中，將其於使細胞能夠保持溫度感受性質粒的30°C下、在含有10 μ g/ml氯黴素的LB瓊脂平板上培養一夜，得到轉化體。將所得的轉化體於30°C下在LB培養基中培養3小時至一夜後，用LB液體培養基或生理鹽水稀釋，塗布到含有10 μ g/ml氯黴素的LB瓊脂平板上。在不能保持溫度感受性質粒的42°C下對該LB瓊脂平板進行培養，得到作為通過基因組外-基因組間的同源重組將質粒整體參入到大腸桿菌基因組中的菌株的生長的轉化體。從該菌株獲得基因組DNA，實施以其作為模板的PCR，確認了該菌株具有下述性質pTH18Csl具有的氯黴素耐性基因存在於基因組上，與編碼pgi的基因的5』端附近區域及3』端附近區域分別相同的區域存在於基因組上，從而確認了質粒整體被參入到大腸桿菌基因組中。將質粒整體被參入到大腸桿菌基因組中的菌株接種到IOOml裝有20ml不含氯黴素的LB液體培養基的帶擋板的燒瓶中，將其於30°C下振蕩培養4小時。用不含氯黴素的 LB液體培養基稀釋該培養液，塗布到不含氯黴素的LB瓊脂培養基上。於42°C下對其培養， 任意挑選96個生長的菌落，使它們分別在不含氯黴素的LB瓊脂培養基上和含有氯黴素的 LB瓊脂培養基上生長，挑選氯黴素感受性的菌株。進而從挑選的菌株中獲得基因組DNA，實施以其為模板的PCR，挑選編碼pgi的基因缺失的菌株，將其命名為MG1655 Δ pgi株。[實施例3]編碼大腸桿菌的葡糖-6-磷酸脫氫酶(以下有時稱作zwf)的基因的鹼基序列也被報導。為了克隆編碼ZWf的基因(l，476bp)的鹼基序列附近區域，合成了 4種具有下述鹼基序列的寡核苷酸引物CAGGAATTCA TGCGTTGCAG CACGATATC(序列號 5)、CAGTCTAGAT AACCCGGTAC TTAAGCCAG (序列號 6)、CAGTCTAGAC TGCGCTTATC CTTTATGGT (序列號 7)及 GACCTGCAGT TACCGGTCAT GCGTGTAAC (序列號8)。序列號5的引物在5，末端側具有EcoRI 識別位點，序列號6及7的引物在5』末端側具有^CbaI識別位點，序列號8的引物在5』末端側具有PstI識別位點。使用大腸桿菌MG1655株的基因組DNA 1 μ g和下述引物的DNA各IOOpmol，在通常條件下進行PCR，由此分別擴增約0. 85kb (以下有時稱作zwf-L片段)的DNA片段和約 1. Okb (以下有時稱作zwf-R片段)的DNA片段，所述引物為具有序列號5的鹼基序列的引物和具有序列號6的鹼基序列的引物的組合、具有序列號7的鹼基序列的引物和具有序列號8的鹼基序列的引物的組合。利用瓊脂糖電泳分離上述DNA片段並回收，分別用EcoRI 及^CbaI消化zwf-L片段，用^CbaI及I^stI消化zwf-R片段。將上述2種消化片段與溫度感受性質粒pTH18csl的EcoRI及I^stI消化物混合，利用T4DNA連接酶反應後，轉化到大腸桿菌DH5ci感受態細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到含有編碼zwf的基因的5』上遊附近片段和3』下遊附近片段這2個片段的質粒，命名為ρΤΗΔ zwf。[實施例4]將實施例3中得到的質粒pTHAzwf轉化到實施例2中得到的大腸桿菌 MG1655Apgi株中，將其於使細胞能夠保持溫度感受性質粒的30°C下、在含有10 μ g/ml氯黴素的LB瓊脂平板上培養一夜，得到轉化體。將所得的轉化體於30°C下在LB培養基中培養3小時至一夜後，用LB液體培養基或生理鹽水稀釋，塗布到含有10 μ g/ml氯黴素的LB 瓊脂平板上。在不能保持溫度感受性質粒的42°C下對該LB瓊脂平板進行培養，得到作為通過基因組外-基因組間的同源重組將質粒整體參入到大腸桿菌基因組中的菌株的生長的轉化體。從該菌株獲得基因組DNA，實施以其作為模板的PCR，確認了該菌株具有下述性質具有pTH18csl的氯黴素耐性基因存在於基因組上，與編碼zwf的基因的5』端附近區域及3』端附近區域分別相同的區域存在於基因組上，從而確認了質粒整體被參入到大腸桿菌基因組中。將質粒整體被參入到大腸桿菌基因組中的菌株接種到IOOml裝有20ml不含氯黴素的LB液體培養基的帶擋板的燒瓶中，將其於30°C下振蕩培養4小時。用不含氯黴素的 LB液體培養基稀釋該培養液，塗布到不含氯黴素的LB瓊脂培養基上。將其在42°C下培養， 任意挑選96個生長的菌落，使它們分別在不含氯黴素的LB瓊脂培養基上和含有氯黴素的 LB瓊脂培養基上生長，挑選氯黴素感受性菌株。進而從挑選的菌株中獲得基因組DNA，實施以其為模板的PCR，挑選編碼zwf的基因缺失的菌株，將其命名為MG1655 Δ pgi Δ zwf株。[實施例5]大腸桿菌的GAPDH基因的鹼基序列已經被報導。為了獲得甘油醛_3_磷酸脫氫酶 (GAPDH)啟動子，分別合成了具有下述鹼基序列的寡核苷酸引物CGAGCTACAT ATGCAATGAT TGACACGATT CCG (序列號鍆、及 CCAAGCTTCT GCAGGTCGAC GGATCCGAGC TCAGCTATTT GTTAGTGAAT AAAAGG(序列號10)。序列號9的引物在其5』末端側具有NdeI識別位點，序列號10的引物從其5』末端側依次分別具有HindIII、PstI、MlI、BamHUacI識別位點。使用上述2種引物和大腸桿菌MG1655株的基因組DNA作為模板，在通常條件下進行PCR法，擴增DNA片段。用限制酶NdeI和HindIII消化所得的DNA片段，由此得到約 IOObp的編碼GAPDH啟動子的片段。然後將上述DNA片段與用Ndel、HindIII消化的大腸桿菌用克隆載體PBR322 (GenBank檢索號J01749)混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5a感受態細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB瓊脂平板上生長的轉化體。將所得的菌落於30°C下在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB液體培養基中培養一夜，從所得的菌體中回收質粒。將該質粒命名為PGAP。環狀芽胞桿菌((Bacilluscirculans)ATCC 4513)具有的DOI 合成酶基因(btrC) 的鹼基序列已經被報導(GenBank檢索號AB066276)。為了獲得btrC基因，分別合成了具有下述鹼基序列的寡核苷酸引物CACTGGAGCT CGCTGGTGGA ATATATGACG ACTAAACAAA TTTG(序列號 11)、及 CAGGATCCTT ACAGCCCTTC CCGGATC(序歹Ij號 12)。序列號 11 的引物從其5』末端側開始依次具有McI識別位點和13個鹼基的GAPDH基因的核糖體結合序列。序列號12的引物在其5』末端側具有BamHI識別位點。以上述2種引物和環狀芽胞桿菌的基因組DNA為模板，在通常條件下進行PCR法， 用限制酶MeI及BamHI消化所得的DNA片段，由此得到約1. Ikbp的DOI合成酶基因(btrC) 片段。將該DNA片段與利用限制酶Mcl及BamHI消化質粒pGAP所得的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有 50 μ g/mL氨苄西林的LB瓊脂平板上生長的轉化體。將所得菌落於30°C下在含有50 μ g/mL 氨苄西林的LB液體培養基中培養一夜，從所得的菌體中回收質粒pGAP-btrC，構建DOI合成酶基因(btrC)表達載體。[實施例6]大腸桿菌0-157株具有的蔗糖水解酶基因(cscA)的鹼基序列已經被報導。即，記載於GenBank檢索號AE005174中記載的大腸桿菌0-157株基因組序列的3274383-3275816 中。為了獲得cscA基因，分別合成了具有下述鹼基序列的寡核苷酸引物GCGGATCCGC TGGTGGAATA TATGACGCAA TCTCGATTGC (序列號 13)、及 GACGCGTCGA CTTAACCCAG TTGCCAGAGT GC(序列號14)。序列號13的引物從其5』末端側開始依次具有BamHI識別位點和13個鹼基的GAPDH基因的核糖體結合序列。序列號14的引物在其5』末端側具有MlI識別位點。以上述2種引物和大腸桿菌0-157株的基因組DNA(SIGMA-ALDRICH:IRMM449)為模板，在通常條件下進行PCR法，利用限制酶BamHI及MlI消化所得的DNA片段，由此得到約1. 4kbp的蔗糖水解酶基因(cscA)片段。將該DNA片段與利用限制酶BamHI及McI消化質粒pGAP-btrC所得的片段進行混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5 α感受態細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB瓊脂平板上生長的轉化體。將所得的菌落於30°C下在含有氨苄西林50 μ g/mL的LB液體培養基中培養一夜，從所得的菌體中回收質粒pGAP-btrC-cscA，構建DOI合成酶基因(btrC)及蔗糖水解酶基因 (cscA)表達載體。[實施例7]〈在GAPDH啟動子控制下的DOI合成酶基因(btrC)、蔗糖水解酶基因(cscA)及葡萄糖轉運促進蛋白質基因(glf)表達載體的構建〉運動發酵單胞菌((Zymomonas mobilis)ATCC 29191)具有的葡萄糖轉運促進蛋白質基因(glf)的鹼基序列已經被報導(GenBank檢索號M60615)。為了獲得glf基因，分別合成了具有下述鹼基序列的寡核苷酸引物CCTGTCGACG CTGGTGGMT ATATGAGTTC TGMAGTAGT CAGG(序列號 15)、及 CTACTGCAGC TACTTCTGGG AGCGCCACA(序列號 16)。序列號 15 的引物從其5』末端側開始依次具有MlI識別位點和13個鹼基的GAPDH基因的核糖體結合序列。 序列號16的引物在其5』末端側具有I^stI識別位點。以上述2種引物和運動發酵單胞菌的基因組DNA為模板，在通常條件下進行PCR 法，利用限制酶MlI及I3StI消化所得的DNA片段，由此得到約1. 4kbp的葡萄糖轉運促進蛋白質基因(glf)片段。將該DNA片段與利用限制酶MlI及I^stI消化質粒pGAP-btrC-cscA 所得的片段混合，使用連接酶連接後，轉化到大腸桿菌DH5ci感受態細胞(TAKARA BIO公司制)中，得到在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB瓊脂平板上生長的轉化體。將所得的菌落於 30°C下在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB液體培養基中培養一夜，從所得的菌體中回收質粒 pGAP-btrC-cscA-glf，構建DOI合成酶基因(btrC)、蔗糖水解酶基因(cscA)及葡萄糖轉運促進蛋白質基因(glf)表達載體。[實施例8]將上述質粒pGAP-btrC-cscA 及 pGAP-btrC-cscA-glf 分別轉化到 MG1655 Δ pgi Δ zwf株中，於37°C下在含有50 μ g/mL氨苄西林的LB瓊脂平板上培養一夜，由此得到 MG1655 Δ pgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA 株及 MG1655 Δ pgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA-glf 株。[實施例9]
作為預培養，將大腸桿菌MG1655 Apgi Δ zwf/pGAP-btrC-cscA株接種到25ml裝入錐形瓶的LB Broth, Miller培養液(DifcoM4620)中，以120rpm進行攪拌培養一夜後，全部接種到裝有475g下述組成的培養基的IL容量的培養槽(ABLE公司制培養裝置BMJ-01) 中。培養在大氣壓下、通氣量1. Ovvm、攪拌速度SOOrpm、培養溫度30°C下進行。共使用4臺培養槽，使用12. 5%氨水和2N鹽酸將pH調至ρΗ7· 0、ρΗ6· 5、ρΗ6· 0。另外，通過測定660nm 處的吸光度測定菌體濃度。培養開始時的菌體濃度全部為0. 29。培養62小時後，利用HPLC 按照常規方法測定所得的培養液中的D0I、蔗糖、葡萄糖、果糖的量。另外，通過測定660nm 處的吸光度測定菌體濃度。培養中使用的培養基的組成記載於下述表1。結果示於表2。
權利要求
1.一種生產DOI的大腸桿菌，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，同時被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統。
2.如權利要求1所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中只具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因。
3.如權利要求1所述的生產DOI的大腸桿菌，所述生產DOI的大腸桿菌具有糖攝入能力增強系統。
4.如權利要求3所述的生產DOI的大腸桿菌，所述生產DOI的大腸桿菌中，選自由所述大腸桿菌本身具有的磷酸葡糖異構酶(Pgi)、葡糖-6-磷酸-1-脫氫酶(Zwf)、葡糖磷酸變位酶(Pgm)及負責穩定期中蛋白質合成的修飾的核糖體修飾因子(Rmf)組成的組中的至少 1種的活性失活或活性降低。
5.如權利要求1所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述生產DOI的系統來自DOI合成酶(BtrC)活性。
6.如權利要求3所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述糖攝入能力增強系統為葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf)活性的增強。
7.如權利要求1所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因來自大腸桿菌細菌。
8.如權利要求7所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述大腸桿菌細菌是大腸桿菌 0-157細菌。
9.如權利要求6所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述葡萄糖轉運促進蛋白質(Glf) 來自發酵單胞菌屬細菌。
10.如權利要求9所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述發酵單胞菌屬細菌為運動發酵單胞菌細菌。
11.如權利要求1所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述生產DOI的大腸桿菌是本身不具有蔗糖同化能力的種類的大腸桿菌。
12.如權利要求11所述的生產DOI的大腸桿菌，其中，所述生產DOI的大腸桿菌是B株或其衍生株。
13.—種生產DOI的方法，包括使用權利要求1所述的生產DOI的大腸桿菌由含有蔗糖的來自植物的原料生產DOI。
全文摘要
本發明涉及一種生產DOI的大腸桿菌及使用所述大腸桿菌由含有蔗糖的來自植物的原料生產DOI的DOI生產方法，所述生產DOI的大腸桿菌在蔗糖非PTS基因組中至少具有編碼蔗糖水解酶(CscA)的基因，同時所述大腸桿菌被賦予2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統或具有被增強的2-脫氧蟹肌醇(DOI)生產系統，優選為進一步具有糖攝入能力增強系統的生產DOI的大腸桿菌。
文檔編號C12R1/19GK102197135SQ20098014311
公開日2011年9月21日 申請日期2009年10月30日 優先權日2008年11月5日
發明者和田光史, 夏地智之, 安樂城正, 德田淳子, 森重敬, 高橋克幸, 高橋均 申請人:三井化學株式會社