一種海洋真菌傘枝黴菌株及其菌絲體提取物和應用的製作方法
2023-06-10 02:46:56 2
一種海洋真菌傘枝黴菌株及其菌絲體提取物和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種海洋真菌傘枝黴菌株及其菌絲體提取物和應用。該海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis?sp.)QZ042於2013年8月19日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCC?No.8101。 申請人:通過實驗發現，本發明所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis?sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物對大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、菸草節桿菌、克雷伯氏桿菌和副溶血弧菌藥物等細菌具有較好的抗細菌活性，對散囊菌、鏈格孢黴、毛雙孢黴和莖潰瘍病菌等真菌具有明顯的抑菌作用，為研究與開發新的抗細菌、抗真菌藥物提供了篩選藥物。
【專利說明】一種海洋真菌傘枝黴菌株及其菌絲體提取物和應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及海洋微生物菌種，具體涉及一種海洋真菌傘枝黴菌株及其菌絲體提取物和應用。
【背景技術】
[0002]病原細菌和真菌可引起動植物的多種病害，其不僅影響農作物產量和經濟動物生長生產，造成極大的經濟損失；而且影響人體健康，威脅人類生命安全。為了抑制和消滅病原細菌和真菌，人們一直致力於從不同環境中尋找新的有效的抗菌藥物，以緩解越來越嚴重的耐藥性菌株的出現。
[0003]在抗真菌藥物的研究上，1939年來自青黴菌(Penillicilium griseofulvum)菌體的灰黃黴素(Griseofulvin)成為發現的第一個抗真菌抗生素，1955年第一個抗真菌藥物兩性黴素問世，以後又陸續開發了氟胞嘧啶和唑類等抗真菌藥物。但是目前抗真菌藥物仍然存在種類缺乏、選擇性小、毒副作用大和耐藥性強的缺點，因此研究和開發新型、高效、低毒、廣譜的抗真菌藥物十分必要。
[0004]在抗細菌藥物的研究上，從第一個抗菌藥物青黴素的出現，到後來的四環素、氯黴素、卡那黴素、利福平等抗生素，都在人類對抗病原細菌上發揮了較重要作用，但隨著抗生素的爛用。越來越多的多耐藥性病原菌開始出現，這是人類面臨的又一挑戰，挖掘新的抗菌藥物和新的抗菌機制，是人類解決這一問題的有效方法之一。
[0005]在當今陸地生物資源越來越枯竭的背景下，從海洋微生物中尋找新型的藥物是一條非常有前景的途徑。其中2010年I月到2013年2月，就從海洋細菌、真菌、放線菌中發現895個新的具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤和抗汙損的天然活性物質(趙成英，朱統漢，朱偉明，2010-2013之海洋微生物新天然產物，有機化學，2012，32，1-41)。海洋微生物產品開發上最為成功的例子是1945年從海洋汙泥中分離到頂頭孢黴菌，從中發現了頭孢菌素，以後發展成系列的頭孢類抗菌素。而且有證據表明，原來被認為是來源於海綿等海洋生物的重要活性物質，如海豚毒素、海葵毒素、麻殼魚毒素等，實際上也是由微生物產生，這些都使利用海洋微生物開發新型藥物成為了焦點。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種海洋真菌傘枝黴菌株及其菌絲體提取物和應用。
[0007]本發明所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042,該菌株已於2013年8月19日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國北京中科院微生物研究所)，其保藏編號為CGMCC No:8101o [0008]本發明所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042是從海洋腐木中分離、純化得到。其分離純化方法為:取海洋腐木樣品，用無菌玻棒搗碎後加入一定量的無菌生理鹽水，再加入玻璃珠在搖床上震蕩20~30min(通常在20~30°C條件下進行)，靜置分層後取上層液做10倍梯度稀釋，取原倍液、10倍和100倍稀釋液圖布PDA固體平板，26~30°C恆溫培養，等菌落長出後，挑取菌落劃線純化得到。
[0009]本發明所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042的特徵為產孢子,在海水PDA培養基上生長良好，菌落初期為棕色，後期顏色逐漸變淺，呈輪紋狀向外生長，菌落邊緣輪廓清晰，菌落生長較慢，薄而平坦，緊貼培養基，不易挑取，有較多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊；分生孢子為球型，表面帶有明顯的小突起，球體直徑大小約為18~22um ;孢子囊為球型，球體直徑大小約為54~60um。
[0010]根據常規方法提取該菌株的DNA，利用真菌的ITS區的通用引物ITSl:5』 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3』 和 ITS4:5』 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3』 擴增其 ITS 區，所得ITS測序序列如下所示:[0011 ] CAGTGGGAAGTAAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCAAAAGATAATCTTTCAACTCGAAAGATTTTTTCCTTTGTGCTGGCTTTGACCGTATGTAATTTTGGGACTTAAACATGGCAGCCTTTATGGTTTGCCGGTCCCAAAAACAATATATCATCCTTATGAAAAACTTACTGAACAACTAAACAATGATTTTAATAATCTGTTTAAAACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTCAGTATCATGAGCACTCTCACTCCTAACCTTTGTGGTTATGATGTGGAATTGGGATGCGCCGATTTTTACTAGTCGGCACTCCTAAAATGTAGCTCTTGGCTGTTTCCTACTACAGCAGTTTGGCCTAATAGTTTTGACTTTTGTCAAATCTTTGGCTCCATTTGCTTCTGGAAGTCAGTCTTGATAATACAGAAAACTCATTCAAACTTGATCTAAATCAGGAGTTCo
[0012]根據常規方法提取該菌株的DNA，利用通用引物5』 -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3』和NS4:5』-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3』擴增真菌 18s rRNA 基因，所得 18s rRNA 測序序列如下所示:
[0013]ACTTCTCGTCGGAACCGACTGTTGCCAATCAGTTTCCAACAATCCAAAGGACTCACTAAGCCGTTCAATCGGTAGTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCGAGCTGATGACTCACGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGATGAAGTTTCAAAAGATTACCCAGACCTTCCGGCCAAGGTTATAAACTCGTTGACTTCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCAATTAAACATTGATAGTCTCTCTAAGAAGCCAAAAAGACACGACCAAAGTCATGCTGGCTATTTAGCAGAGTAAGGTCTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACGAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAAACTTGGCTTTCGCTGAAATGCCGAATGGGTCAATATAAAATATAACACCATCCGATCCTTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGACAAATGCTTTCGCAGAAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACTAATGTCCCCAACTATCCCTATTCATCATTACTTTGGCTTTAGAAACCAACGAAATAAGGCCAAAGTCCTATTTCATTATTCCATGCTAATATGTTCAGGCTTGAAAGCCTGCTTTAAACACTCCAATTTTTTCAAAGTAAAAGTTCTGGTTCACCAGCCGCCACCGAAATGACGACTGGCTAACCCAGAAGGTGGAGCCCCGCCCGTTGAGGTACCGATCAATGAAGACCGAACCCCACAGGCGAAGGCCAAAATTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAAATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGTAAAGGCCCTGTATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCG
TTACCCGTTAAAAGCATGGTAGGCCACTAACCTACCATCGAAACTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGCATCATCGCC
GGCACAAGGCCATGCGATTCGATTAATTATTATGAATCACCATACAAGCGGTTGCCCGCGTTGGCTTTTTATCTAAT
AAGTGCACCTCTTCCAGAAGTCGAGGTTATGTACGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACGGTTATCCAAGTAGTAA
GTGAATATCAAATAAATTATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATTTGTTo
[0014]綜合上述形態學鑑定和分子生物學鑑定結果，可以確定該菌株為Umbelopsis屬真菌，分子生物學鑑定結果表明其親緣關係與Umbelopsis isabellina最近,但是通過形態鑑定可以發現其分生孢子和產孢器形態結構和大小都與Umbelopsis isabellina有差異，可能為Umbelopsis isabellina的一個新的變種，我們將該菌株暫定為Umbelopsissp.QZ042。
[0015]本發明的第二個目的在於提供上述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物，該提取物是以上述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042作為發酵菌株，液體發酵獲得發酵培養物，分離菌絲體和發酵液，取菌絲體用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸組成的混合溶劑進行浸提，浸提液濃縮，即得。其中，所述組成混合溶劑的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的體積比優選為70~80:15~20:4~8，進一步優選為75~80:15~18:5~8 ;所述的液體發酵是將海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042菌株接種到H)液體培養基中，於25~32°C條件下搖床培養5~7天或靜置培養15~30天，以獲得發酵培養物；在搖床培養時，轉速優選為130~150r/min。
[0016]本發明的第三個目的在於提供上述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物的製備方法，包括以下步驟:
[0017]I)種子培養:挑取海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042菌絲接種於PDA固體培養基上斜面培養5~7天，溫度控制在26~30°C ;
[0018]2)發酵培養:將斜面培養好的真菌接種於H)液體培養基上，於25~32°C條件下搖床培養5~7天或靜置培養15~30天，得到發酵培養物；
[0019]3)過濾:將發酵培養物過濾，分離出菌絲體和發酵液；
[0020]4)提取:取菌絲體用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸組成的混合溶劑進行浸提，浸提液濃縮，即得到海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物。
[0021]上述方法的步驟2)中，搖床培養時，轉速優選為130~150r/min ;步驟4)中，所述組成混合溶劑的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的體積比優選為70~80:15~20:4~8，浸提的溫度優選為O~8°C，浸提的時間優選為3~4天。
[0022] 申請人:通過實驗發現，本發明所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物在50 μ g/ml時，對大腸桿菌(E.Coli)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、菸草節桿菌(Arthrobacter nicotianae)、克雷伯氏桿菌(Klebsiella peneumoniae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemoIyticus)等細菌的抑制圈直徑 d 分別為 12.3mm、14.7mm、17.2mm、
13.4mm和22.5mm，表明海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物對細菌具有抗細菌活性，可以用來製備抗細菌藥物。
[0023]因此，本發明的第四個目的在於提供上述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物在製備抗大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、菸草節桿菌、克雷伯氏桿菌或副溶血弧菌藥物中的應用。[0024]本發明的第五個目的則在於提供一種抗大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、菸草節桿菌、克雷伯氏桿菌或副溶血弧菌的藥物，該藥物包含上述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物作為活性成分。
[0025] 申請人:通過實驗發現，本發明所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物在100 μ g/ml時，對散囊菌(Eurotium rubrum)、鏈格孢黴(Alternaria sp.)、毛雙抱黴(Lasiodiplodia pseudotheobromae)、莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum)等真菌具有明顯的抑菌作用，表明海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.)QZ042培養物的菌絲體提取物對真菌具有抗真菌活性，可以用來製備抗真菌藥物。
[0026]因此，本發明的第六個目的在於提供上述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物在製備抗散囊菌、鏈格孢黴、毛雙孢黴或莖潰瘍病菌藥物中的應用。
[0027]本發明的第七個目的則在於提供一種抗散囊菌、鏈格孢黴、毛雙孢黴或莖潰瘍病菌的藥物，該藥物包含上述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042培養物的菌絲體提取物作為活性成分。
[0028]本申請中，所述的H)液體培養基的組成為:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、50%人工海水1000mL ;所述的PDA固體培 養基的組成為:馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、50%人工海水 1000mL。
[0029]與現有技術相比，本發明提供了一種新的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042菌株， 申請人:發現該菌株培養物的菌絲體提取物具有廣譜的抗細菌、抗真菌活性，其活性物質和抑菌機制可能不同於已有的抗菌藥物，存在新藥研發的潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]本發明所涉及的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042,已於2013年8月19日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國北京中科院微生物研究所)，其保藏編號為CGMCC No:8101。
[0031]圖1為本發明所述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042菌株在培養基上的形態，其中，A表不PDA培養基上的菌落照片，B表不在光學顯微鏡下的孢子照片(放大倍數10X10)，C表示電鏡下的厚垣孢子，D表示電鏡下的孢子囊，E表示電鏡下的分生孢子梗和菌絲；
[0032]圖2為本發明所述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042的ITS序列進化樹；
[0033]圖3為本發明所述海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042的18s rRNA序列進化樹。
【具體實施方式】
[0034]下面通過實施例對本發明作進一步說明，但本發明並不局限於這些實施例。
[0035]實施例1:海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042的分離和鑑定
[0036]1.真菌的分離
[0037]用無菌三角瓶取海洋腐木樣品，稱取5g，採用無菌玻棒搗碎後加入50ml無菌生理鹽水，加入玻璃珠在搖床上震蕩20min，靜置分層後取上層液做10倍梯度稀釋，取原倍液、10倍和100倍稀釋液圖布PDA固體培養基，26~30°C恆溫培養，等菌落長出後，挑取菌落劃線純化得到。
[0038]2.真菌的培養和形態學觀察
[0039]培養特徵觀察:將菌種接種於PDA培養基上，26°C恆溫培養獲得菌落。記錄初生菌絲顏色、菌落顏色變化、表面特徵、有無色素產生。
[0040]製片及鏡檢:挑取各菌株產孢器及菌絲製成水封片，棉藍溶液染色，進行鏡下觀察，記錄菌絲特徵及分枝情況、孢子和產孢器結構，並拍照記錄。
[0041]結果:真菌在PDA培養基上生長良好，菌落初期為棕色，後期顏色逐漸變淺，呈輪紋狀向外生長，菌落邊緣輪廓清晰，菌落生長較慢，薄而平坦，緊貼培養基，不易挑取，有較多厚垣孢子，有孢囊孢子和孢子囊，真菌的菌落及孢子如圖1所示(a表示PDA培養基上的菌落照片，b表示在光學顯微鏡下的孢子照片(放大倍數IOX 10)，c表示電鏡下的厚垣孢子，d表示電鏡下的孢子囊，e表示電鏡下的分生孢子梗和菌絲)。孢囊孢子、孢子囊、菌絲的電鏡圖像見圖1，從圖1可以看出QZ042的分生孢子為球型，表面帶有明顯的小突起，球體直徑大小約為18~22um ;孢子囊為球型,球體直徑大小約為54~60um。
[0042]3.真菌總DNA的提取
[0043]將分離得到的內生真菌接種到H)液體培養基中，於26°C搖瓶培養4d。過濾收集菌絲體。菌絲體採用液氮凍融2次，滅菌玻璃棒研磨後用USA Omega Bio-Tek公司的「真菌基因組DNA小量提取試劑盒」提取真菌的基因組。
[0044]4.真菌的ITS分子鑑定
[0045]用通用引物ITSl:5』-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3』 (SEQ ID NO:1)和 ITS4:5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3』 (SEQ ID NO:2)擴增真菌 rDNA 的間隔序列(含 ITSl 區、5.8S 區、ITS2 區)序列。PCR 反應條件為:94°C 變性 5min，然後 94°C，30 s—55°C，40 s—72°C, 1.0min進行35個循環擴增，最後72°C延伸lOmin。將PCR產物純化後直接送上海生工生物工程技術服務有限公司，用引物ITSl測序，所得ITS測序序列如下所示:
【權利要求】
1.一種海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042，其保藏編號為CGMCC No:8101。
2.—種海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物，其特徵在於:以權利要求1所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042作為發酵菌株，液體發酵獲得發酵培養物，分離菌絲體和發酵液，取菌絲體用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸組成的混合溶劑進行浸提，浸提液濃縮，即得。
3.根據權利要求2所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.)QZ042培養物的菌絲體提取物，其特徵在於:所述的液體發酵是將權利要求1所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.)QZ042菌株接種到H)液體培養基中，於25~32°C條件下搖床培養5~7天或靜置培養15~30天，以獲得發酵培養物。
4.根據權利要求2所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.)QZ042培養物的菌絲體提取物，其特徵在於:所述組成混合溶劑的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的體積比為70~80:15~20:4 ~8。
5.權利要求2所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.) QZ042培養物的菌絲體提取物的製備方法，包括以下步驟: 1)種子培養:挑取海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.)QZ042菌絲接種於PDA固體培養基上斜面培養5~7天，溫度控制在26~30°C ; 2)發酵培養:將斜面培養好的真菌接種於H)液體培養基上，於25~32°C條件下搖床培養5~7天或靜置培養15~30天，得到發酵培養物； 3)過濾:將發酵培養物過濾,分離出菌絲體和發酵液； 4)提取:取菌絲體用由乙酸乙酯、甲醇和乙酸組成的混合溶劑進行浸提，浸提液濃縮，即得到海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.)QZ042培養物的菌絲體提取物。
6.根據權利要求5所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.) QZ042培養物的菌絲體提取物的製備方法，其特徵在於:步驟4)中，所述組成混合溶劑的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的體積比為70~80:15~20:4~8。
7.權利要求2所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.) QZ042培養物的菌絲體提取物在製備抗大腸杆囷、臘狀牙抱杆囷、煙早節杆囷、克雷伯氏杆囷或副溶血弧囷藥物中的應用。
8.一種抗大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌、菸草節桿菌、克雷伯氏桿菌或副溶血弧菌的藥物，其特徵在於:該藥物包含權利要求2所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042培養物的菌絲體提取物作為活性成分。
9.權利要求2所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsissp.) QZ042培養物的菌絲體提取物在製備抗散囊菌、鏈格孢黴、毛雙孢黴或莖潰瘍病菌藥物中的應用。
10.一種抗散囊菌、鏈格孢黴、毛雙孢黴或莖潰瘍病菌的藥物，其特徵在於:該藥物包含權利要求2所述的海洋真菌傘枝黴(Umbelopsis sp.) QZ042培養物的菌絲體提取物作為活性成分。
【文檔編號】A01P1/00GK103952322SQ201410203253
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月15日 優先權日:2014年5月15日
【發明者】龔斌, 義翠花, 張豔秋, 方懷義, 龐庭才, 張虹, 董慶亮, 黃鵠 申請人:欽州學院