用於轉基因植物的蛋白質轉運增強劑的製作方法
2023-06-09 15:40:11 1
專利名稱：用於轉基因植物的蛋白質轉運增強劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及處理轉基因植物，尤其是被設計表達殺蟲有效的蛋白的農作物的方法。
背景技術：
轉基因植物對商業化農業有重要影響，其利益很有前景但也產生了新的害蟲控制問題。值得注意的是，基於用表達殺蟲有效的晶體蛋白的基因改造的植物的農作物能通過使目標害蟲的食物(植物組織)變得有毒而選擇性消滅害蟲，由此減少或消除化學殺蟲劑的用量。
屬於芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性菌的某些成員生產殺蟲蛋白。了解最多的是蘇雲金芽孢桿菌(BT)，其中殺蟲蛋白是晶體狀小體和形成孢子的菌體。該殺蟲晶體蛋白的特徵是其對特定昆蟲害蟲(其中很多害蟲對農業有重要影響)的效力和特異性，以及其對非目標昆蟲種類和脊椎動物(特別是人)相對安全。這些殺蟲晶體蛋白長期用於園藝業，其中像化學殺蟲劑一樣噴霧晶體和孢子的混合物，但對於範圍較廣闊的大田作物沒有獲得很大成功。
該殺蟲蛋白由基本無活性的大蛋白構成。當毛蟲攝入了一些殺蟲晶體時，該昆蟲中腸的丙氨酸減少狀態使該晶體分離和釋放晶體蛋白。在此階段該蛋白使無活性的，但是昆蟲胃腸液中的特定酶將該蛋白剪切至其蛋白酶抗性的核，該核是完全活性的。活化的殺蟲蛋白然後結合中腸內壁細胞的刷狀緣膜，並插入細胞膜。當大約8個這樣的插入集合在一起的時候，它們就形成穿膜的孔或通道，並允許細胞內容物洩漏，導致營養吸收所必須的細胞的死亡。昆蟲迅速失去營養並最終餓死，或由於24小時內的次級細菌感染而死亡。晶體溶解，蛋白水解成活性殺蟲蛋白和對特定受體結合的過程全都使該BT蛋白高度特異性並且對環境十分有利。
已經收集了幾千種不同的蘇雲金芽孢桿菌分離物並確定了其殺蟲蛋白成分和活性譜。大量BT殺蟲蛋白現已克隆並測序。為避免混淆，研究人員建議對晶體蛋白基因(Cry基因)使用同一的命名系統，根據其蛋白序列和其毒性所針對的昆蟲類型。
表1
由CryI基因編碼的蛋白序列相似並僅對毛蟲(也即蛾和蝶的幼蟲，鱗翅目)有毒；CryII基因編碼對鱗翅目和/或雙翅目(蒼蠅和蚊子)有毒而CryIV蛋白僅對雙翅目有毒。CryIII基因生產對甲蟲(鞘翅類)幼蟲有毒的蛋白。考慮了不同蛋白之間序列的相似性和差異，在上述主要類型中進行了細分。CryI組，例如最初分成CryIA，IB和IC(儘管現在已經達到CryIG)，其中不同亞類可能在蛋白序列上只有50％同一。還進行了更細緻的分類而CryIA現在包括CryIA(a)，IA(b)和IA(c)。
開發了多種方法用於將目的基因導入農作物細胞並由此培育可育的植物。參見，美國專利6329574和http//www.cotton.pi.csiro.au/publicat/pest/transgen.htm，其內容在此全部作為參考而引用。所選方法部分依賴目標種類，而棉花改造經常依賴其植物遺傳改造的自身發展的天然基因轉移物。稱為Crown Gall的疾病是一種有土壤細菌病源物，農桿菌引起的植物腫瘤。在1970年代早期，人們認識到該細菌通過轉移部分其自身遺傳物質到植物細胞DNA中而引起疾病。這些寄生的基因破壞被感染細胞的正常生化機器並使其製造僅細菌利用的新化合物。進一步研究之後，科學家能夠鑑定那些基因導致疾病，並且由於細菌是很容易遺傳操作的簡單生物，他們用自己構建的潛在有用的基因取代了致病基因。然後這些細菌可以用於將基因從試管荷載至植物細胞中。然而不是所有的植物接觸該細菌後最終都能得到該新基因。用抗生素純化去除未改造的植物細胞。
植物細胞對多種用於控制人和動物的細菌感染的抗生素敏感。如果能分離出使植物細胞對某種毒性抗生素具有抗性的基因，然後與某些目的基因物理連接並插入農桿菌，將可以提供殺滅未在感染中接受基因的那些細胞的選擇系統。多年以來人們了解了那些使細菌對抗生素有抗性的基因，其通過生產分解或化學修飾而使抗生素無毒的酶而具有抗性。用上述的基因剪接技術，研究人員能改造編碼解毒抗生素卡那黴素的酶的基因並生產了引起該酶在植物細胞中生產該酶的新的雜合基因而防止其在致死劑量的卡那黴素存在時死亡。結合這一抗生素篩選系統和植物組織培養步驟，有可能用農桿菌將基因引入多種植物，包括從矮牽牛到棉花。
棉花是特別重要的作物。商品形式的轉基因棉花使用CryIAc(Monsanto的BOLLGARDTM)和使用CryIAc和Cry2Ab基因(Monsanto的BOLLGARDTMII)的聯合來表達蘇雲金芽孢桿菌的內毒素。大田效率表道表明50-70％控制害蟲棉鈴蟲(helicover paarmigera)和澳洲棉鈴蟲(H.punctigera)。也很有價值的是用名為CryET33和CryET34的蘇雲金晶體毒性基因改造的農作物植物，所述基因編碼對鞘翅目毒性的晶體蛋白CryET33(29-kDa)和CryET34(14-kDa)。CryET33和CryET34晶體蛋白對擬谷盜(red flour beetle)幼蟲和日本金龜子(Japanesebeetle)幼蟲有毒。(參見，美國專利6399330)
轉基因農作物的應用導致了對整體害蟲控制的鬥爭中的新問題。一些問題涉及隨植物成熟減少表達的內毒素，其導致在生長季節後期(棉花生長季的後1/3效率減少)和害蟲可能產生對內毒素的免疫的可能性增加。這些缺點導致發展針對種植「窗口」，相對於本地害蟲發育循環的害蟲控制策略並且指定了殺蟲劑應用的害蟲群體最小域值。
轉基因植物的生理壓力和物理損壞也導致內毒素蛋白質表達下降，相應的害蟲控制效率降低。因此，長期乾旱和/或高溫能降低轉基因作物中內毒素表達速率並是對害蟲的防護顯著下降，導致需要使用殺蟲劑噴霧。
內毒素蛋白表達下降的原因並不十分清楚。在BT棉花中，理論認為由於CMV3 5S啟動子濃度減少，基因「沉默」或其它轉錄後事件，所以CryIAc基因表達下降。也有人認為CryIAc蛋白減少是因為植物內轉化和扣押的增加，或者因為生長和衰老引起的稀釋。人們理解在不成熟和成熟的BT棉花植物中CryIAc轉錄水平都不穩定。
如果存在用於處理表達殺蟲有效蛋白的轉基因植物，而在植物成熟、生理壓力和物理損壞時仍然促進這些蛋白表達的系統將是非常有利的。
發明簡述本發明的目的是提供處理表達殺蟲蛋白的轉基因植物，尤其是轉基因作物的方法，且特別用於表達殺昆蟲蛋白的轉基因作物。
本發明的另一個目的是提供延長表達的蛋白以足夠量存在的時間的方法，所述量足以控制以被處理植物為食的有害昆蟲。
根據這些和其它目的，可以從本文看出，根據本發明的處理轉基因農作物的方法包括對轉基因植物的葉應用蛋白轉運增強劑，所述葉表達殺蟲有效的蛋白，所述增強劑促進被處理植物中殺蟲有效蛋白的表達和/或穩定性。
儘管不希望受理由限制，發明者認為該蛋白轉運增強劑以下述一或多種方式作用(a)在有缺水壓力時作物細胞膜的保護性水替代品的形式；(b)作為目的殺蟲蛋白的蛋白質穩定劑；和/或(c)作為結合促進經過植物內轉運機器的運動的蛋白的結合物。結果，儘管有缺水的生理壓力和植物損傷，根據本發明處理的轉基因作物表達殺蟲蛋白並將其運至果實組織。發明者認為根據本發明的處理也將在植物生長和成熟中持續表達有效水平的殺蟲蛋白。
發明詳述根據本發明用蛋白轉運增強劑處理轉基因植物，所述增強劑充分刺激和/或保護細胞表達和植物內轉運機器使得儘管存在缺水、植物組織的物理損傷、生長和植物成熟，植物組織、果實和種子中維持所需水平的殺蟲蛋白。在轉基因植物組織中維持目的蛋白表達水平和濃度有助於維持較好的害蟲控制的效率水平，進一步減少目前對抗效率下降所需要的殺蟲劑的用量，並且將有助於防止接觸的害蟲存活和防止抗性害蟲種群產生。
須知本文所用的百分比均為相對於總重量的重量比，除非另有說明。
適合用於本發明的蛋白轉運增強劑包括根據式1結構的一或多種化合物和農業化學可接受的鹽 式1其中X是NO2；Y是H，C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，C2-C6烯基，且Z是C或N。
具體來說，Y部分可以是甲基、乙基、丙基、丁基、異-丁基，戊基、己基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、異-丁氧基、戊氧基和己氧基。
本發明所用的優選的蛋白轉運增強劑包括根據上式結構的一或多種化合物和化合物的鹽，其中X是相對於羥基鄰位或對位的硝基，Y是氫或C1-C3烷氧基，且Z是碳原子。適合的鹽包括水溶性鹼金屬鹽(尤其是鈉鹽和鉀鹽)、銨鹽和其它非植物毒性或對環境有利的水溶性鹽。
最優選的蛋白轉運增強劑包括下列的聯合對硝基苯酚(A)、鄰硝基苯酚(B)和2-甲氧基-5-硝基苯酚(C)的鈉鹽。尤其優選，蛋白轉運增強劑包括這些鹽在A∶B∶C為(0.1-10)∶(0.1-10)∶1比例範圍的混合物。這些鹽可自ATONIKAsahi Chemical Mfg.Co.，Ltd，以A∶B∶C為2∶3∶1購得。
根據本發明的蛋白轉運增強劑以一般每英畝被處理田野小於20克每種活性成分的比率(gAI/ac)使用。優選，這些增強劑以1-20gAI/ac範圍的比率使用且更優選以3-18gAI/ac範圍的比率使用。尤其優選，以總重量為基礎，以0.01-5重量％的範圍使用蛋白轉運增強劑鹽，且以每英畝0.5-20液體盎司(oz/ac)範圍的比率應用。
根據本發明的蛋白轉運增強劑可與一或多種活性成分、噴霧輔助劑、塗抹劑或適合目標植物的農業用途的其它物質聯合應用。可以跟根據本發明的蛋白轉運增強劑聯合使用的活性成分例子包括除草劑、植物生長增強劑、植物生長阻滯劑、葉化肥、殺真菌劑(外用和系統性的)、和殺昆蟲劑(外用和系統性的)。
可用的除草劑包括三嗪(例如，莠去津)、脲、草甘膦、草硫膦(sulfosate)、glyfosinate、和稀禾定(sethoxydim)。
適合用於本發明的植物生長增強劑包括植物生長激素，如84中鑑定的赤黴素(gibberillin)中的至少一種，且優選GA3，GA4，GA5，GA7，和GA9，細胞因子(例如，玉米素、激動素、苄腺嘌呤、二氫玉米素和異戊烯基腺嘌呤)；生長素(例如，吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA))；和2，4，5和6碳結構的多羥基羧酸；乙烯磷和化巴。
適合用於本發明的植物生長阻滯劑包括氯矮壯素、甲哌鎓(mepiquat chloride)以及馬來酸醯肼及其鹽。這種植物生長調節物影響和改變植物代謝過程而增強或妨礙植物生長。所有這些物質都可以根據其生產商在產品說明中提供的應用比率和時間而使用。
將得益於本發明的系統性殺真菌劑包括二甲十三烷嗎啉、甲霜林、異菌脲、三乙膦酸鋁、託布津、苯菌靈、三唑酮、萎鏽靈、氧化萎鏽靈、苯咪氨甲酯、噻苯咪唑、乙菌定、乙嘧酚磺酸酯、和甲菌定。
適合的系統性殺昆蟲劑包括丁醛肟威、高滅磷、蟲蟎威、樂果、甲拌磷和特丁磷。
使表達和轉運機制受到影響的特定機理並不清楚。例如，用放射性標記的硝基苯酚鹽測試未改造的小麥示蹤該處理物至被轉運到小麥植物種子核中的蛋白中。另外的研究表明酚物質作為細胞膜的水合劑作用。
在棉花中，人們認識到棉花種子需要大量蛋白，並且種子在植物系統中從碳水化合物產生棉絨。用ATONIK測試正常植物(即未遺傳改造或改變以表達殺蟲蛋白，作物植物代謝功能的正常部分)顯示種子和棉絨產率的增加。這種作用與植物生長調節物的作用一致，但不一定暗示有關處理植物的作用的任何事情，所述植物已經被遺傳改造而生產指定的蛋白作物正常功能的一部分。
能夠根據本發明處理的轉基因植物一般是由野生型改造而含有表達所需的殺蟲有效的蛋白的基因的那些植物。優選，轉基因植物包括表達殺蟲有效的蛋白的基因，所述蛋白對昆蟲、細菌、真菌、黴菌、蟎蟲等的襲擊和感染提供抗性。
兩種特別有效的基因是CryIAc基因(由CMV35S啟動子驅動)和Cry2Ab基因。這些基因能單獨或聯合插入棉花、玉米、小麥、高粱、大豆和類似日用農作物以提供對多種有害昆蟲的防護。特別有價值的是改造而表達殺蟲有效的蛋白的棉花幹(例如BT棉花)。可以根據本發明處理的BT棉花的留籽可以商標BOLLGARD或BOLLGARDII(MonsantoCo.)購得。
根據本發明的蛋白轉運增強劑在植物生長周期或季節中以一定的比率和時間應用於轉基因植物，使得在植物組織中維持殺蟲蛋白表達和穩定化。下表鑑定了優選的要處理的轉基因植物及在一般有用、優選和很優選的應用比率的蛋白轉運增強劑的量。
表2
實施例在2升的盆裡轉基因Bt棉花(Deltapine Nucotn B)和未改造的棉花植物在受控的條件下用ATONIK噴霧，這是一種含一般認為是生長調節劑的產品，但該生長調節劑對遺傳改造的日常農作物作為蛋白轉運增強劑作用良好。ATONIK含有對硝基苯酚(0.3％)、鄰硝基苯酚(0.2％)和5-硝基苯酚(0.1％)的鈉鹽。在第7真葉(TL)對棉花進行處理，並在10天後取樣上部伸出的主幹葉。保持溫度在76-86華氏度及充足的水分。取樣後(第7TL+10天)，在用ATONIK噴霧，並接受壓力條件升高溫度(86-102華氏度)和不足的水分供應(乾燥條件)直到5天後取樣(第7TL+15天)上部伸出的主幹葉。此後5天(第7TL+20天)處於相同條件，對植物取樣葉和squares。
每次取樣後，將組織樣品放在密封袋中並立即拿到進行螟蛉飼餵測試的設備上。在對第一次噴霧應用樣品開始飼餵的第24，48，72和96小時，和對第二次噴霧應用樣品的第72和96小時測量螟蛉死亡率。
完成死亡率研究後，將來自代表性棉花植物的葉剖面拿去進行蛋白分析。在從頂端其第2，6，8和10個節的地方收集葉片並在-80華氏度儲存。
在第一批收集的樣品中收集的葉片的螟蛉死亡率示於表3
表3
在第二次噴霧後第5天和第10天收集的葉片的螟蛉死亡率示於表4。
表4
在第7TL+20天(第2次處理)收集的方塊(square)的螟蛉死亡率示於表5。
表5
表6出示了用ATONIK處理對Bt棉花的高度和節數量的影響。
表6
結果表明用根據本發明的蛋白轉運增強劑處理導致最佳生長狀態(表3)和溫度和缺水的壓力條件下(表4和5)都有更高的螟蛉死亡率。然而用ATONIK處理不導致營養生長的增加。(見表6)
權利要求
1.維持轉基因植物的殺蟲效率的方法，該轉基因植物包含表達殺蟲有效的蛋白的基因，所述方法包括用蛋白轉運增強劑處理所述的轉基因植物，該增強劑穩定所述植物中殺蟲有效的蛋白的轉運。
2.根據權利要求1的方法，其中所述轉基因植物是棉花或玉米。
3.根據權利要求1的方法，其中所述轉基因植物是已經改造而表達蘇雲金芽孢桿菌蛋白的棉花。
4.根據權利要求1的方法，其中所述蛋白轉運增強劑包含苯酚鹽和愈創木酚鹽的混合物。
5.根據權利要求4的方法，其中所述蛋白轉運增強劑以1-100oz/英畝範圍的比率應用於所述植物。
6.根據權利要求5的方法，其中所述蛋白轉運增強劑以1-50oz/英畝範圍的比率應用於所述植物。
7.根據權利要求6的方法，其中所述蛋白轉運增強劑以5-30oz/英畝範圍的比率應用於所述植物。
8.根據權利要求1的方法，其中所述蛋白轉運增強劑包含由還原碳水化合物的醛和酮基得到的多元醇。
全文摘要
用蛋白質轉運增強劑處理可以促進和維持轉基因植物中目的蛋白的表達和穩定性。優選，該轉基因植物是已經改造而表達殺蟲有效的蛋白的普通農作物。
文檔編號A01N33/00GK1681385SQ03821975
公開日2005年10月12日 申請日期2003年7月31日 優先權日2002年8月1日
發明者J·拉凱 申請人:Lta資源管理公司