一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙的製作方法

2023-06-05 01:03:01 2

專利名稱：一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及動物源食品和果蔬類農產品中農藥殘留檢測試紙條，具體說是涉及到一種一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙。
背景技術：
阿維菌素(Avermectin, AVM)是由日本科學家大村智和美國Merck公司於1976年 從鏈黴菌MA-4680的發酵產物中得到的一種大環內酯抗生素類殺蟲、殺蟎劑。AVM屬於昆蟲神經毒劑，主要幹擾害蟲神經生理活動，刺激釋放C2氨基丁酸，抑制神經傳導，使害蟲麻痺中毒而死，具觸殺和胃毒作用，無內吸性，是目前應用最廣泛的抗寄生蟲藥物，被廣泛的應用於農作物疾病防治和畜禽的健康養殖。AVM雖然屬於微生物源農藥，但其具有極強的脂溶性，不論以何種途徑給藥均能很好地被吸收，可廣泛分布於全身組織，體內持續時間長，因而消除緩慢。世界衛生組織將AVM認定為高毒化合物。研究表明，AVM對大鼠的LD5tl為10 mg/kg，屬高毒農藥。研究還發現，AVM對哺乳動物的繁殖能力具有潛在的毒性，當實驗鼠攝入量為I. 19-2. 13 mg/(只
d)後，雄性老鼠的生育生殖能力顯著下降，且配偶發生死胎的機率明顯提高。因此，國際上對AVM的最高殘留限量MRL (Maximum Residue Limits)要求非常嚴格,對其殘留指標的檢測十分重視，制定了相當嚴格的MRL值。中國農業部規定其在柑桔中MRL為20 μ g/kg,葉菜中為50 μ g/kg ;歐盟規定其在果蔬產品、穀物等農產品中MRL為10 μ g/kg;韓國規定其在蘋果中MRL為20 yg/kg，芹菜為50 μ g/kg ;以色列規定其在黃瓜、茄子、桃子、草莓等果蔬農產品中MRL為10 μ g/kg;澳大利亞規定在蘋果、梨、番茄等產品中的MRL為10 μ g/
kg ο目前，AVM殘留檢測的方法主要有薄層色譜法(TLC)，氣相色譜法(GC)，高效液相色譜一紫外檢測法(HPLC-UV)，高效液相色譜-螢光檢測法(HPLC-FLD)，氣-質聯用法(HPLC-MS )，液-質聯用法(LC-MS )，毛細管電泳法(CE )，酶聯免疫法(ELISA)等。這些方法存在著儀器設備複雜，操作步驟多，過程繁瑣，檢測費用高，需要在實驗室進行，並且要求專門的技術人員等問題。
發明內容本實用新型的目的在於提供一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙，其具有特異性強、靈敏度高、準確、方便、便宜、大眾化的檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙。本實用新型的一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙，是由塑料基板、加樣區、金標區、反應顯色區及吸水區，上述各區帶邊緣依次重疊搭接，粘貼固定在塑料基板上；在反應顯色區上設有三條檢測帶和一條質控帶。作為本實用新型的進一步改進，所述的金標區由金標AVM包被抗原AVM-OVA構成。作為本實用新型的進一步改進，所述的AVM包被抗原AVM-OVA是由AVM和蛋白載體雞卵清蛋白OVA偶聯而成。[0009]作為本實用新型的進一步改進,所述的金標AVM包被抗原AVM-OVA由膠體納米金顆粒標記AVM包被抗原AVM-OVA而成，其濃度為5 μ g/L^15 μ g/L。作為本實用新型的進一步改進，所述的三條檢測帶包被有不同濃度梯度的AVM單克隆抗體。作為本實用新型的 進一步改進，所述的三條檢測帶分別是包被濃度為1.0 μ g/L的第一檢測帶，包被濃度為2. O μ g/L的第二檢測帶，包被濃度為5. O μ g/L的第三檢測帶。作為本實用新型的進一步改進，所述的一條質控帶包被有一定濃度的鼠抗雞卵清蛋白抗體。作為本實用新型的進一步改進，所述的吸水區由濾紙構成。當該試紙條用來檢測樣品時，把預處理過的樣品滴於該試紙條的加樣區，樣品由於毛細作用進行側向層析，首先經過金標區，樣品會將金標AVM包被抗原復溶，然後一起進行側向層析。當經過硝酸纖維素濾膜上的顯色檢測區時，金標AVM包被抗原會和檢測帶上的AVM單克隆抗體及質控帶上的鼠抗雞卵清蛋白抗體進行抗原抗體特異反應顯色。若樣品中含有AVM或其含量超過一定濃度(I. O μ g/L, 2. O μ g/L, 5. O μ g/L)時，其就會同金標AVM包被抗原競爭而與檢測帶上包被的AVM單克隆抗體結合，由於樣品中AVM與金標AVM包被抗原相比分子量小很多，層析時空間位阻也很小，從而使得樣品中AVM比金標AVM完全抗原更快更容易與AVM單克隆抗體結合，因而使得AVM包被抗原不能夠和檢測帶AVM單克隆抗體結合顯色，這樣金標AVM包被抗原會繼續層析與其餘AVM單克隆抗體和抗雞卵清蛋白抗體結合顯色。本實用新型的有益效果提高了檢測的特異性、靈敏性。利用膠體納米金顆粒標記AVM完全抗原(包被抗原AVM-0VA)，提高了其檢測結果可視性，進一步提高了靈敏性，擺脫了特定儀器的束縛，降低了成本，使得該試紙條的使用對象更加準確、方便、便宜、大眾化。

圖I為一種檢測阿維菌素殘留含量的膠體金試紙條的結構示意圖；圖2為圖I的分解圖。圖3為檢測結果說明圖。
具體實施方式
本實用新型的一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙，其特徵在於塑料基板I、加樣區2、金標區3、反應顯色區4及吸水區9，上述各區帶邊緣依次重疊搭接，粘貼固定在塑料基板I上；反應顯色區4設有三條檢測帶和一條質控帶8。所述的金標區3由金標AVM包被抗原AVM-OVA構成；三條檢測帶包被有不同濃度梯度的AVM單克隆抗體其濃度分別為其中檢測帶5的包被濃度為1.0 μ g/L，檢測帶6的包被濃度為2. O μ g/L，檢測帶7的包被濃度為5. O μ g/L ;質控帶8包被有一定濃度的鼠抗雞卵清蛋白抗體；吸水區9由濾紙構成。所述的AVM包被抗原AVM-OVA是由AVM和蛋白載體雞卵清蛋白OVA偶聯而成。[0021 ] 所述的AVM包被抗原AVM-OVA由膠體納米金顆粒標記AVM包被抗原AVM-OVA而成，其濃度為5 μ g/L 15 μ g/L。[0022]本實用新型的一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙的製備1、AVM單克隆抗體的製備(I)將AVM用琥珀酸羧化成羧基AVM，再用碳二亞胺法使其分別與血藍蛋白KLHjI卵清蛋白OVA藕聯，用透析法純化AVM藕聯蛋白，用紫外掃描法鑑定其藕聯效果。最終製成AVM完全抗原(免疫抗原AVM-KLH，包被抗原AVM-OVA )；(2 )用AVM免疫抗原AVM-KLH免疫BALB/C小鼠，三次免疫後，測小鼠血清抗體效價，最後進行加強免疫，取效價高的小鼠為脾細胞提供者；(3)用8-雜氮鳥嘌呤馴化SP2/0細胞，待其馴化好後，按照經典動物細胞融合法將SP2/0細胞與體內產生高的抗體水平的小鼠脾細胞進行融合；(4 )用AVM包被抗原AVM-OVA包被酶標板，間接ELISA法檢測能夠分泌AVM抗體的融合細胞，並按照有限稀釋法進行亞克隆，直到篩選出能夠成功分泌AVM單克隆抗體的穩 定的融合細胞株；(5)將篩選出的穩定的能夠分泌AVM單克隆抗體的陽性細胞株進行擴大培養，並將其注射進預先經過石蠟馴化的純系BALB/C小鼠腹腔內，使其產生大量含有分泌AVM單克隆抗體的腹水；(6)將收集到的腹水進行濃縮、提純，進而得到AVM單克隆抗體。2、鼠抗雞卵清蛋白(OVA)抗體的製備(I)將雞卵清蛋白按照常規免疫程序免疫BALB/C小鼠，三次免疫後ELISA法測定小鼠抗體效價，以確定小鼠抗體水平；(2)將效價最高的小鼠進行眼球摘除法採血，分離得其血清，按照辛酸-硫酸銨法純化得到鼠抗雞卵清蛋白OVA抗體。3、膠體納米金顆粒的製備(I)在潔淨的燒杯中加入一定量(100 mL)的O. 01%的氯金酸水溶液，然後加熱至沸騰；(2)在攪拌狀態下加入一定濃度(I. 0%)的檸檬酸三鈉水溶液I mL，繼續煮沸10min，反應體系顏色從金黃色逐漸變為紫紅色；(3)靜置冷卻後，用去離子水恢復至原有體積，最終製成符合條件的(粒徑約為40nm)膠體納米金顆粒。4、膠體金標記AVM包被抗原AVM-OVA (I)通過預實驗確定膠體金標記AVM包被抗原AVM-OVA的最佳pH值和濃度；(2)將製得的膠體金溶液通過用O. I M碳酸鉀調整至最佳pH值(pH 8. 5)；(3)將AVM包被抗原AVM-OVA經過進一步透析、過濾等處理，儘可能去除一些影響金標過程的離子和粒子等雜質； (4)電磁攪拌條件下，將經過處理的AVM包被抗原AVM-OVA按照優化出的條件濃度(3.0 mL)逐滴加入100 mL的膠體金溶液中；(5) 10 min後，加入10% BSA至其濃度為1%，以穩定其反應體系，繼續攪拌均勻；(6)將製得的金標AVM包被抗原AVM-OVA溶液經過離心(15000 g，4 0C, 30 min)後，小心吸取上清,用含1% BSA的PBS恢復原體積重懸後，再離心，即重複洗滌3次；(7)將沉澱最終用含穩定劑(1% BSA或O. 3 mg/mL PEG)的PBS重懸至合適濃度。加入一定量的O. 5 mg/mL疊氮鈉可長期4 °C保存。5、AVM殘留半定量檢測試紙條的裝配(I)將玻璃纖維經過含1% BSA和1%吐溫-20的PBS (pH 7.4,0.01 Μ)活化處理後，浸在金標AVM包被抗原AVM-OVA溶液中30 min,自然風乾，即可將金標AVM包被抗原AVM-OVA包被在玻璃纖維膜上；(2)在硝酸纖維素濾膜上間隔O. 2 cm依次噴塗上三條梯度濃度的AVM單克隆抗體 溶液帶作為檢測帶，其濃度依次為1.0 μ g/L,2. O μ g/L,5. O μ g/L。鼠抗雞卵清蛋白OVA抗體為質控帶。然後將硝酸纖維素膜用含1% BSA的PBS (pH 7. 4,0. 01 Μ)封閉2 h，自然風乾；(3)最後，將加樣膜(主要成分為濾紙或玻璃纖維，作為採樣區)、噴塗有金標AVM包被抗原的玻璃纖維膜(金標區)、包被檢測帶和質控帶的硝酸纖維素濾膜(顯色區)、吸水濾紙(吸水區)依次貼在塑料底板上製成AVM殘留檢測試紙。本實用新型的一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙的使用( I)將待測樣品進行預處理液態樣品，包括動物體液(血清、尿液、乳汁等)和液態飲品(牛奶，果汁等)，不用進行預處理，或者用蒸餾水進行等倍稀釋即可。肉類樣品，取I. O g樣本置搗碎杯中與10. O mL丙酮溶劑混合,高速搗碎2 min,超聲波振蕩30 min,以10 000 rpm離心10 min。取上清液ImL,備用。果蔬樣品，取粉碎後的果蔬樣品10. O g，加入50 mL乙腈，在14 OOOrpm高速勻質器中勻質2 min後，用濾紙過濾，濾液收集到裝有5-7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液，蓋上塞子，劇烈震蕩2 min，在室溫下靜止30 min，使乙腈相和水相分層。從乙腈相中吸取10 mL溶液，備用。(2)將微量樣本滴入加樣區，或將試紙條伸入樣品中即可開始檢測。5-10 min後即可觀察結果。(3)結果判定(結合說明書附圖3)如果三條檢測帶和質控帶均顯色，則說明樣品呈陰性，樣品中不含AVM或AVM含量低於I. O μ g/L，如圖3中I所示；如果檢測帶5不顯色，而其他兩條檢測帶和質控帶顯色，則說明樣品呈陽性，樣品中AVM含量在I. O μ g/L -2.0 μ g/L之間，如圖3中2所示；如果檢測帶5和檢測帶6均不顯色，檢測帶7和質控帶顯色，則說明樣品呈陽性，樣品中AVM含量在2.0 μ g/L -5. O μ g/L之間，如圖3中3所示；如果檢測帶5、6、7都不顯色，只有質控帶顯色，則說明樣品呈陽性，樣品中AVM含量達到或超過5. O yg/L，如圖3中4所示；如果檢測帶均不顯色，質控帶也不顯色，則說明該試紙條已經失效，不能使用，須更換新的試紙條後重新檢測，如圖3中5所示。
權利要求1.一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙，其特徵在於塑料基板(I)、加樣區(2)、金標區(3)、反應顯色區(4)及吸水區(9)，上述各區帶邊緣依次重疊搭接，粘貼固定在塑料基板(I)上；在反應顯色區(4)上設有三條檢測帶和一條質控帶(8)。
2.如權利要求I中所述的一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙，其特徵在於吸水區(9)由濾紙構成。
專利摘要本實用新型的一種檢測阿維菌素殘留的膠體金試紙，由塑料底板、加樣區、金標區、顯色區及吸水區組成。採用競爭法原理，使樣品中的AVM與金標AVM包被抗原AVM-OVA競爭，從而與檢測帶上的AVM單克隆抗體結合顯色，建立樣品中AVM含量與檢測帶顯色條數對應的關係，進而根據顯色區中條帶顯色數量來判斷樣品中AVM含量。本實用新型具有操作簡單、敏感特異、攜帶方便等特點。可應用於動物源食品和果蔬類農產品的AVM殘留檢測。
文檔編號G01N33/531GK202383142SQ20112045077
公開日2012年8月15日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者初海坤, 張爽, 徐亞軍, 晏磊 申請人:黑龍江八一農墾大學