抑制流感病毒複製的宿主相關基因及其篩選方法和應用的製作方法
2023-06-01 13:46:11
專利名稱：抑制流感病毒複製的宿主相關基因及其篩選方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及抑制流感病毒複製的宿主相關基因及其篩選方法和應用。
背景技術：
病毒感染宿主後需要利用宿主細胞的代謝過程完成病毒自身的複製，在這一過程病毒必然會調控宿主細胞內基因組的表達，抑制抗病毒基因表達，增強對病毒複製有益的基因表達。因此，病毒感染宿主細胞後，宿主細胞內表達變化的這些基因往往和病毒複製有密切的關係。通過生物學手段篩選宿主細胞內這些基因，具有機體針對病毒免疫和病毒複製機制的研究價值，同時具有潛在預防和治療流感病毒感染的應用價值。病毒入侵宿主過程伴隨著宿主基因表達變化，最終決定感染細胞和病毒各自的命運。DNA微陣列技術結合生物信息學技術的數據分析方法，為研究細胞基因表達譜變化提供了前所未有的高通量的研究工具。微陣列已廣泛的應用於人、小鼠和大鼠基因表達領域的研究，高密度微陣列已越來越多的用來分析病毒感染宿主誘導的宿主細胞基因表達差異，例如，愛滋 病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV) (Solis etal.(2006) Virology.352(1):86-99)登革熱病毒(Dengue virus, DV) (Fink et al.(2007)PLoS Negl Trop Dis.1(2):e86)麻疫病毒(Measles virus, MV) (Sato et al.(2008)Virology.375(2):321-330)、狂犬病病毒(Rabies virus, RV)(UboI et al.(2005)Microbiol Immunol.49 (5):423-431)和猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiencyvirus, SIV) (George et al.(2003)Virology.312(1):84-94)。由於動物基因組信息資料庫的不完善，應用特異性的動物基因組微陣列研究一直滯後於人或小鼠相關領域的進展。早期曾用人基因組的微陣列(AffymetrixHuman GeneChip )研究牛、豬和犬等的基因表達情況(Ji et al.(2004) Int JCancer.112(5):803-814 ;Shah et al.(2004)Clin Transplant.Suppl 12:76-80)，直到Qiagen公司研製的(Qiagen_NRSP8 array)第一代大規模的豬基因表達譜分析晶片出現，微陣列上固定了 13297cDNAs和ESTs資料庫中挑選的豬基因組探針(Zhao et al.(2005)Genomics.86(5):618-625)。現在使用的Affymetrix豬全基因組晶片廣泛用來研究豬全基因組轉錄譜，獲得了眾多研究成果(Tsai et al.(2004) J Virol.78(20):11360-11370 ；Shiet al.2009)J Genvirol.90(Pt 7):1670-1680)。流感病毒為正粘病毒科流感病毒屬分節段單股負鏈RNA病毒。病毒粒子剛分尚時呈多晶形，在體內傳代後變成球形，直徑80-120nm(PaleSe，et al.，2007)。病毒粒子由質量比分別是0.8-1 %的RNA、70-75 %的蛋白質、20 %的脂類和5_8 %的糖類組成。流感病毒分為A、B、C三型，其中A型(甲型)最為重要。甲型流感病毒能引起人類、豬、馬和各種禽類的自然感染和發病。由於其表面抗原HA和NA容易變異，已知HA有16個亞型(H1-H16)，NA有9個亞型(N1-N9)，它們之間的不同組合，使甲型流感病毒有許多亞型(如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1等)，在豬體中主要流行HlNl和H3N2亞型。一般來說，流感病毒具有宿主種的適應性。在同種動物的個體之間容易發生傳播。不同動物有不同的流感病毒，如豬流感、人流感、馬流感，一般情況下這些流感只感染各自的本屬動物。但是流感病毒有個特性是不同動物的流感間可以互相組合，形成感染多種動物的新流感病毒。另一個特點是豬這種動物比較特殊，豬對其它動物的流感病毒也易感，這是其它動物不具有的特性。所以一旦豬同時感染了人流感、豬流感、禽流感等，這多種病毒會在豬體內發生重組，可能就會出來一種既能感染豬、人、禽的流感病毒。所以狹義的豬流感不是人獸共患病。流感在人與人之間傳播範圍很有限，跟流感的傳播途徑有關。比如2009年甲型流感，就是人流感、豬流感、禽流感共同感染豬後產生的新流感病毒，最開始感染的人基本都是接觸過或跟豬關係密切的人感染了。人類發展史上流感病毒的大爆發都給社會經濟發展、人類健康帶來重大危害。為預防和治療流感，各國都投入了大量人力物力，不斷研究治療方法和藥物。近年來，從宿主細胞內尋找具有抗病毒功能的基因或蛋白是一個熱門領域。以細胞內功能分子作為抗病毒治療的靶點具有廣譜抗病毒、不易產生耐藥毒株的優勢，逐漸成為研究開發抗病毒治療藥物的熱點途徑。近年來國際高水平論文多次報導在宿主細胞內信號通路中篩選具有潛在抗病毒功能的分子取得突破性成就。例如，鋅指抗病毒蛋白(Zinc-finger antiviral protein, ZAP)能通過降解特異病毒RNA進而抑制鼠白血病病毒等多種病毒的複製，被證明是一種重要的抗病毒因子(Chen etal.(2008) Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A.105，4352-4357)。利用鋅指蛋白為載體攜帶特異的酶阻斷T細胞中的CCR5表達，可促進T細胞清除HIV病毒(Holt et al.(2010)Nat.Biotechnol.28，839-847)。E3泛素連接酶RNF5定位於線粒體，通過泛素化修飾MITA (也稱為STING)並引起其降解而負 調控病毒感染後I型幹擾素表達(Zhong et al.(2009)Immunity.30,397-407)。Tetherin(宿主細胞蛋白)以二聚體錨定HIV在其複製的細胞膜上，阻斷病毒從胞漿膜出芽釋放(Perez-Caballero et al.(2009)Cell.139，499-511)。AP0BEC3G(Apolipoprotein BmRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G)可誘導 HIV 基因變(Perez-Caballeroet al.(2009) Cell.139，499-511)，使病毒不能複製(Shirakawa et al.(2008) Nat.Struct.Mol.Biol.15，1184-1191)。目前細胞周期素依賴激酶、前列腺素、熱休克蛋白作為藥靶分子廣泛用於如，HCMV、HIV、HSV、腺病毒和乳頭狀瘤等病毒病治療。
發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是，針對現有流感病毒感染後篩選宿主體內表達量發生改變基因的方法和手段的缺陷和不足，提供一種高通量，高效率的篩選抑制流感病毒複製相關基因的方法。本發明的技術方案如下:本發明的技術方案之一是:一種篩選抑制流感病毒複製相關基因的方法，包括從感染流感病毒的組織或者細胞中提取總mRNA，用基因組表達譜晶片篩選出表達量和未感染流感病毒細胞相比較上升或者下降的基因。其中，所述的組織或細胞是離體培養的組織或細胞,或者是從感染流感病毒的動物上取下來的組織或細胞，優選後者。所述的組織或細胞可以是感染流感病毒的動物的任何組織或細胞，組織如肺臟、心肌等，細胞如血細胞、肝細胞、肌肉細胞等，優選肺臟巨噬細胞。所述的動物可以是各種能夠感染流感病毒的動物，優選哺乳動物或者禽類，更優選如人、豬、雞等，最優選豬。其中，所述的流感病毒選自己知的各型流感病毒，包括A、B、C型流感病毒，也包括各種亞型流感病毒，優選HlNl和H3N2亞型，該兩亞型流感病毒是在豬中主要流行的流感病
毒亞型。其中，所述的表達量的比較是比較基因的mRNA濃度，優選表達量升高或者下降2倍以上的基因為抑制病毒複製相關基因。本發明中所述的「以上」包括本數。本發明更優選表達量升高或降低2-5倍以上的基因為抑制病毒複製相關基因。研究發現，並不是倍數變化越高，抑制病毒功能越強。有些非常重要的基因並不需要變化太多倍數就能有顯著抑制作用，抑制病毒作用與這個基因在細胞中發揮的功能有關。其中，所述的基因組表達譜晶片是常規的基因組表達譜晶片，優選豬基因組表達譜晶片，更優選豬全基因組表達譜晶片。本發明的技術方案之二是:選自表I和表2中所述的基因在篩選或製備抗流感藥物中的用途。本發明的技術方案之 三是:一種篩選抗流感藥物的方法，包括:(I)使候選藥物與感染流感病毒的細胞接觸，所述的細胞是表達選自表I和表2中所述的基因的細胞:(2)測試流感病毒滴度；(3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。其中，所述的篩選抗流感藥物的方法中，對於表達選自表I第I組的56個基因的細胞，優選所述基因表達被抑制的細胞。其中，所述的基因表達被抑制的細胞優選通過使該細胞含有所述SiRNA或者是含有編碼有所述SiRNA的重組載體使該基因沉默。其中，所述的篩選抗流感藥物的方法中，對於表達選自表I第2組的99個基因的細胞，優選過表達所述基因的細胞。其中，所述的過表達基因的細胞優選通過增加細胞內該基因的拷貝數或者改良該基因的調控元件，如使用強啟動子，或者使用增強子的方法，使該基因過表達。本發明的技術方案之四是:一種抑制流感病毒複製的方法，包括利用分子生物學方法使宿主細胞內的相關基因過表達，所述的相關基因選自表I第I組的56個基因中的一種或多種；或者使宿主細胞內的相關基因沉默或敲除，所述的相關基因選自表2第2組的99個基因中的一種或多種。其中，所述的基因優選第I組中的轉錄因子A基因和對氧磷酸酶3基因。其中，所述的基因優選第2組中的小窩蛋白2基因和表面活性蛋白D基因。其中，所述的基因過表達方法是常規方法，優選通過增加細胞內該基因的拷貝數或者改良該基因的調控元件，如使用強啟動子，或者使用增強子的方法，使基因過表達。其中，所述的基因沉默或敲除的方法也是常規方法，優選通過使宿主細胞含有所述基因的小幹擾RNA (SiRNA)或者是含有編碼有所述小幹擾RNA的重組載體使該基因沉默，或者利用基因打靶技術將目標基因敲除。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
相比於現有技術，本發明的有益效果如下:本發明中的篩選方法可以大規模，高通量篩選流感病毒感染後宿主體內表達量發生改變的基因，並分別得到表達量上調和下調2倍的兩組基因。通過該方法，一方面我們可以更加深刻了解宿主對流感病毒的免疫機制 』另一方面，我們可以利用這種方法開發更好的抗流感藥物。
以下結合
本發明的特徵和有益效果。圖1是Western-blot檢測沉默犬腎細胞中小窩蛋白2表達的結果，其中1:siRNA-小窩蛋白2 ；2 =SiRNA-小窩蛋白2對照；3:未接毒對照；4:正常細胞。圖2是Western-blot檢測沉默犬腎細胞中表面活性蛋白D表達的結果，其中1:siRNA-表面活性蛋白D ；2 =SiRNA-表面活性蛋白D對照；3:未接毒對照；4:正常細胞。圖3是沉默犬腎細胞中小窩蛋白2表達後流感病毒滴度圖。圖4是沉默犬腎細胞中表面活性蛋白D表達後流感病毒滴度圖。圖5是構建的p⑶NA 3.1-轉錄因子A載體圖譜。圖6是構建的p⑶NA 3.1-對氧磷酸酶3載體圖譜。圖7是細胞中轉錄因子A和對氧 磷酸酶3免疫印跡檢測結果，其中1:pCDNA 3.1-轉錄因子A ；2:pCDNA 3.1空載體對照；3:正常細胞4:pCDNA 3.1-對氧磷酸酶3 ；5:pCDNA 3.1空載體對照；6:正常細胞。圖8是外源提高表達犬腎細胞中轉錄因子A後流感病毒滴度結果。圖9是外源提高表達犬腎細胞中對氧磷酸酶3後流感病毒滴度結果。圖10是小窩蛋白2沉默的犬腎細胞中加入金剛烷胺後流感病毒滴度圖。圖11是表面活性蛋白D沉默的犬腎細胞中加入金剛烷胺後流感病毒滴度圖。圖12是外源提高轉錄因子A表達的犬腎細胞中加入金剛烷胺後流感病毒滴度圖。圖13是外源提高對氧磷酸酶3表達的犬腎細胞中加入金剛烷胺後流感病毒滴度圖。
具體實施例方式本發明人利用基因組表達譜晶片，將病毒感染前後的細胞的基因表達譜進行分析，篩選表達量改變的基因，並對這些基因進行了進一步的抗流感病毒功能驗證，發現這些流感病毒複製相關基因，進而提供了這些基因用於抗流感病毒藥物的篩選和製備的方法，從而完成了本發明。篩選抑制流感病毒複製相關基因的方法本發明提供一種篩選抑制流感病毒複製相關基因的方法，包括從感染流感病毒的組織或者細胞中提取總mRNA，用豬基因組表達譜晶片篩選出表達量和未感染流感病毒細胞相比較上升或者下降的基因。本發明通過將感染流感病毒細胞和未感染流感病毒細胞進行比較，比較這些細胞中的各基因的表達量變化來篩選相關基因。流感病毒感染細胞後，直接或間接地影響細胞內基因的表達及蛋白質的生成。通過對宿主被流感病毒感染前後兩組樣品進行表達譜生物晶片檢測，可以反映出流感病毒作用後相應組織或細胞中基因表達譜及蛋白質等的變化，從而篩選出抑制病毒複製相關基因。其中，所述的組織或細胞可以是離體培養的組織或細胞，也可以是從感染流感病毒的動物身上取出來的組織或細胞，優選後者。所述的組織或細胞可以是感染流感病毒的動物的任何組織或細胞，組織如肺臟、心肌等，細胞如血細胞、肝細胞、肌肉細胞等，優選肺臟巨噬細胞。流感病毒主要引起呼吸系統感染，肺臟是流感病毒聚集的器官，肺泡巨噬細胞是流感很易感的細胞，比較有代表性。其它組織類型也可選擇，氣管、支氣管這些氣管上皮細胞也是流感病毒非常易感細胞。所述的動物可以是各種能夠感染流感病毒的動物，優選哺乳動物或者禽類，更優選如人、豬、雞等，最優選豬。其中，所述的流感病毒選自己知的各型流感病毒，包括A、B、C型流感病毒，也包括各種亞型流感病毒，優選HlNl和H3N2亞型，該兩亞型流感病毒是在豬中主要流行的流感病
毒亞型。其中，所述的表達量的比較是比較基因的mRNA濃度，優選表達量升高或者下降2倍以上的基因為抑制病毒複製相關基因。本發明中所述的「以上」包括本數。本發明更優選表達量升高或降低2-5倍以上的基因為抑制病毒複製相關基因。其中，提取總mRNA的方法是常規技術，一般可以採用商品試劑盒，用Trizol法提取。其中採用的基因組表達譜晶片是常規的基因組表達譜晶片，是指採用光導原位合成或微量點樣等方法，將基因組所有的轉錄子序列以陣列式有序地固化於支持物(玻片、矽片、聚丙烯醯胺凝膠、尼龍膜 等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然後與已標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行檢測分析來判斷樣品中靶分子的種類和數量，從而實現對mRNA的檢測。較佳的如Affymetrix公司生產的豬全基因組表達譜晶片。本發明利用基因組表達譜對感染流感病毒前後的細胞的表達譜進行分析。該方法將樣品製備、生化反應和結果檢測3個部分有機的結合起來，具有快速、高通量、高信息量、平行化、集約化、微型化、自動化、成本低、汙染少等優點。本發明從感染流感病毒的豬中提取總mRNA，用基因組晶片篩選出表達量和未感染流感病毒細胞相比較上升或者下降2倍的基因。這些基因如表I和表2中所示。其中，第I組(表I)中共56個基因是豬感染流感病毒後表達倍數升高2倍以上的基因，第2組(表2)中共99個基因是豬感染流感病毒後表達倍數下降2倍以上的基因。本發明利用分子生物學方法調控宿主細胞內這些基因或包括這些基因的一組基因的表達，發現可以抑制宿主細胞內流感病毒複製，因此這些基因是抑制流感病毒複製相關基因。所述的分子生物學方法是常規方法，包括使宿主細胞過表達基因，可以通過增加細胞內該基因的拷貝數或者改良該基因的調控元件，如使用強啟動子，或者使用增強子的方法，使該基因過表達。還包括使宿主細胞中該基因的表達被抑制，可以通過使宿主細胞含有所述基因的小幹擾RNA(SiRNA)或者是含有編碼有所述小幹擾RNA的重組載體使該基因沉默。表I (第I組)基因信息
權利要求
1.一種篩選抑制流感病毒複製相關基因的方法，其特徵在於，包括從感染流感病毒的組織或者細胞中提取總mRNA，用基因組表達譜晶片篩選出表達量和未感染流感病毒細胞相比較上升或者下降的基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的細胞是從感染流感病毒的動物上取下來的肺臟巨噬細胞。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述的動物是哺乳動物或者禽類。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的動物是豬。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的表達量的比較是比較基因的mRNA濃度，選擇表達量升高或者下降2倍以上的基因。
6.選自表I和表2中所述的基因在篩選或製備抗流感藥物中的用途。
7.一種篩選抗流感藥物的方法，其特徵在於，包括: (1)使候選藥物與感染流感病毒的細胞接觸，所述的細胞是表達選自表I和表2中所述的基因的細胞； (2)測試流感病毒滴度； (3)選擇使流感病毒滴度下降的候選藥物。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述的篩選抗流感藥物的方法中，對於表達選自表I第I組的56個基因的細胞，該細胞是所述基因表達被抑制的細胞；對於表達選自表2第2組的99個基因的細胞，該細胞是過表達所述基因的細胞。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的基因表達被抑制的細胞是通過使該細胞含有siRNA或者是含有編碼siRNA的重組載體使該基因沉默；所述的過表達基因的細胞是通過增加細胞內該基因的拷貝數或者改良該基因的調控元件使該基因過表達。
10.一種抑制流感病毒複製的方法，其特徵在於，包括利用分子生物學方法使宿主細胞內的相關基因過表達，所述的相關基因選自表I第I組的56個基因中的一種或多種；或者使宿主細胞內的相關基因沉默，所述的相關基因選自表2第2組的99個基因中的一種或多種。
全文摘要
本發明公開了抑制流感病毒複製的宿主相關基因及其篩選方法和應用。本篩選抑制流感病毒複製相關基因的方法，包括從感染流感病毒的組織或者細胞中提取總mRNA，用基因組表達譜晶片篩選出表達量和未感染流感病毒細胞相比較上升或者下降的基因。本發明還提供了將所得基因應用於篩選或製備抗流感藥物以及抑制流感病毒複製的方法。
文檔編號A61P31/16GK103215345SQ20121001973
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者馬志永, 史子學, 魏建超, 邵東華, 王少輝, 李蓓蓓, 晏文君, 朱紫祥 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所