一種從光合細菌細胞中提取番茄紅素的方法

2023-06-01 14:01:11

專利名稱：一種從光合細菌細胞中提取番茄紅素的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是提供了一種從光合細菌細胞中提取番茄紅素的方法。
背景技術：
番茄紅素屬於一種開鏈式不飽和脂肪烴，是一種非常重要的類胡蘿蔔素。目前研究 發現番茄紅素主要有以下三個方面的醫藥價值1)具有抗氧化作用，可以減緩低密度 脂蛋白的氧化，從而防止動脈硬化及冠心病；2)具有抗癌、防癌作用；對預防消化道 癌，宮頸癌，皮膚癌，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，肺癌，卵巢癌有明顯效果3)增強 機體免疫功能和抗衰老的重要作用。另外，番茄紅素作為高價值的純天然色素，可以廣 泛應用於食品著色、化妝品和醫藥等行業中。目前番茄紅素的價格昂貴，其國內市場年 需求達20 30噸，但生產能力不足5噸，遠遠滿足不了國內外市場的需要，因此具有 廣闊的市場潛力。
目前，雖然番茄紅素的化學合成技術已取得成功，但研究發現以煤焦油係為主要成 分的合成色素具有致癌性，因此天然色素的開發勢在必然。天然番茄紅素主要從番茄中 提取，生產工藝是首先將番茄壓榨、乾燥，然後採用乙酸乙酯提取和蒸餾後獲得。此外， 國內外學者在從番茄中提取番茄紅素的有機試劑種類方面進行了比較深入的研究，在單 一有機溶劑提取番茄紅素方面發現石油醚、氯仿、四氫呋喃、二氯甲垸、乙酸乙酯、丙 酮和乙醇提取效果較好。在混合有機溶劑提取番茄紅素方面，發現正己垸一丙酮 一 乙醇、 石油醚一丙酮和正己垸一丙酮提取效率較高。
因為番茄生長周期長，受季節和環境影響較大，因此研究生長速度快和番茄紅素含 量高的其它生物物種來取代番茄作為生產番茄紅素的生物資源已經成為一個非常重要 的研究課題。我們研究發現光合細菌細胞中番茄紅素含量是番茄幹渣中番茄紅素含量的
7倍。特別是在發酵培養超高細胞濃度光合細菌的技術已經成熟，可以快速培養出大量
的光合細菌後，採用光合細菌作為一種生產番茄紅素的生物資源以替代番茄是完全可能 的。
因為能夠產生番茄紅素不同生物類型的細胞大小和結構存在差異，因此從中提取番3茄紅素的溶劑類型也應該有所不同。雖然國內外學者在從番茄中提取番茄紅素的優化控 制方法方面進行了大量的研究，但在從光合細菌中如何高效提取出番茄紅素方面比較系 統的研究卻沒有文獻報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種從光合細菌細胞中提取番茄紅素的方法，採用一種小分 子量的極性有機溶劑甲醇和一種非極性試劑正己垸進行混合作為提取劑，可以高效地從 光合細菌細胞中提取出番茄紅素，為實現採用光合細菌生產番茄紅素的產業化生產奠定 重要基礎。
本發明的具體實施步驟是用50 500ml離心管離心收穫沉降於底部的光合細菌 細胞，倒淨上清液後分別加入5.0 50ml由甲醇和正己垸組成的體積比為1: 2 2: 1 的混合溶劑，在室溫下浸提0.5 1.0小時，然後採用離心機在8000 15000轉/分轉 速下離心20 30分鐘，提取溶劑正己垸相中含有從光合細菌細胞中提取出的番茄紅素。
菌種是購自中國科學院微生物研究所的典型光合細菌菌種沼澤紅假單胞菌，經過6 天的光照厭氧培養後，通過離心(10000轉/分鐘，20分鐘)收穫菌細胞於50ml離心 管底部，倒去上清液後，將沉降於離心管底部的菌細胞用50 mmol磷酸鹽緩衝溶液(pH 7.0)重新懸浮，再次離心倒去上清液，重複2次清洗菌細胞後，再次離心收穫菌細胞， 使保留在每個離心管底部的菌細胞乾重為33 —37mg，得到培養好的光合細菌細胞。
提取甲醇和正己烷混合溶劑上清液直接在高壓液相色譜上測定番茄紅素濃度，得到 番茄紅素濃度在10.0mg/L以上，而用二氯甲垸作為提取試劑時，提取液中番茄紅素濃 度是3.1mg/L，無論是正己垸相中的番茄紅素濃度，還是提取番茄紅素總量都高於採用 二氯甲烷作為番茄紅素提取溶劑的水平。
本發明採用甲醇與正己垸混合溶劑從光合細菌中提取番茄紅素，具有如下特點
1、 番茄紅素的分子結構既包括含有11個共軛雙鍵的非極性碳鏈，也包括了在2 個非共軛雙鍵，因此使番茄紅素可以溶解於非極性或極性有機溶劑。但總體上來說，番 茄紅素整個分子傾向於非極性結構，因此導致在甲醇和正己烷作為互不相溶的混合提取 溶劑時，番茄紅素幾乎全部分配到正己垸相，而在甲醇相中幾乎檢測不到番茄紅素的存 在。
2、 在甲醇和正己烷作為混合溶劑從光合細菌細胞中提取番茄紅素時，兩種互不相 溶的溶劑各自發揮不同的作用。甲醇分子量小，容易進入菌體細胞，從而可以將菌細胞中的番茄紅素溶解並提取出來。但與甲醇相比，番茄紅素更容易溶解於正己垸中，使從 菌細胞提取出來的番茄紅素立即分配到甲醇與正己烷混合溶劑中的正己烷相中。因此甲 醇主要負責將菌細胞中的番茄紅素提取出來，而正己垸主要負責番茄紅素的溶解，保證 了甲醇與正己垸混合溶劑能夠從光合細菌細胞中高效提取出番茄紅素，在採用光合細菌 生產番茄紅素的產業化生產方面具有重要的價值。


圖1為本發明採用甲醇與正己烷混合溶劑從光合細菌中提取番茄紅素的效果。橫坐 標為甲醇、正己垸、甲醇與正己垸按不同體積比例混合、單一試劑提取番茄紅素效果最
好的二氯甲垸，縱坐標為溶劑中的番茄紅素濃度mg/L或溶劑中提取番茄紅素總量Mg。
具體實施例方式
1、 光合細菌細胞實驗材料本發明實驗所用光合細菌是購自中國科學院微生物研 究所的典型光合細菌菌種沼澤紅假單胞菌，經過6天的光照厭氧培養後，通過離心 (10000轉/分鐘，20分鐘)收穫菌細胞於50ml離心管中，倒去上清液後，將沉降於離 心管底部的菌細胞用50 mmol磷酸鹽緩衝溶液(pH 7.0)重新懸浮，再次離心倒去上 清液，重複2次清洗菌細胞後，再次離心收穫菌細胞，使保留在每個離心管底部的菌細 胞乾重都為35 mg左右。
2、 從光合細菌細胞中提取番茄紅素在離心管中分別加入5.0 ml由甲醇與正己
垸組成的混合溶劑，混合溶劑的體積比例分別為1: 2、 1: 1、 2: 1，在室溫下浸提0.5
小時後通過離心(10000轉/分鐘，20分鐘)分別測定混合試劑上清液中甲醇與正己垸 中的番茄紅素，發現只在正己垸相中含有番茄紅素。
3、 提取劑中的番茄紅素測定實驗前用正己烷配製番茄紅素濃度分別為10、 20、 30、 40和50 mg/L的標準溶液，依次在高壓液相色譜上進行測定，得到番茄紅素峰高
(y)與番茄紅素濃度(x)的一元線性回歸方程(y:0.1859x誦0.0772， R2=0.9992)。 實驗通過離心提取劑後取上清液，在HPLC上直接測定番茄紅素濃度。測定條件是 高效液相色譜儀(島津LC-10ATvp泵，SPD-M10Avp 二極體陣列檢測器)，Zorbax SB-C18 (4.6mmx25cm)分離柱，流動相是乙腈-甲醇-氯仿(體積比45:45:10)，流速為 1毫升/分鐘，進樣量20ijL，檢測波長為473nm。
圖1所示，甲醇與正己垸按照體積比從1: 2到2: 1作為混合溶劑，同時採用文 獻報導的從光合細菌細胞中提取番茄紅素效果最好的單一溶劑二氯甲烷進行比較。由圖1可知，無論是正己烷相中的番茄紅素濃度，還是提取番茄紅素總量都明顯高於採用二 氯甲烷作為番茄紅素提取溶劑的水平，其中採用甲醇與正己烷按照體積比1: 1作為混
合溶劑提取率最高，與二氯甲垸比較提取率提高了62.8%。因此採用極性溶劑甲醇與
非極性溶劑正己烷按照體積比從1: 2到2: 1範圍混合作為提取溶劑，可以從光合細 菌細胞中高效提取出番茄紅素，為採用光合細菌生產番茄紅素的產業化生產奠定了非常 重要的基礎，具有重要的應用價值。
權利要求
1、一種從光合細菌細胞中提取番茄紅素的方法，其特徵在於，用50～500ml離心管離心收穫培養好的光合細菌細胞，倒淨上清液後分別加入5.0～50ml由甲醇和正己烷組成的體積比為1∶2～2∶1的混合溶劑，在室溫下浸提0.5～1.0小時，然後採用離心機在8000～15000轉/分轉速下離心20～30分鐘，提取溶劑正己烷相中從光合細菌細胞中提取出的番茄紅素量。
2、 如權利要求1所述的從光合細菌細胞中提取番茄紅素的方法，其特徵在於，所 述培養好的光合細菌細胞是將沼澤紅假單胞菌，經過6天的光照厭氧培養後，通過10000 轉/分鐘離心20分鐘，收穫菌細胞於50 ml離心管中，倒去上清液後，將沉降於離心 管底部的菌細胞用50 mmol磷酸鹽緩衝溶液重新懸浮，保持pH 7.0，再次離心倒去上 清液，重複2次清洗菌細胞後，再次離心收穫菌細胞，使保留在每個離心管底部的菌細 胞乾重都為33 — 37 mg。
全文摘要
一種從光合細菌細胞中提取番茄紅素的方法，屬於生物技術領域，採取極性溶劑甲醇與非極性溶劑正己烷的混合溶劑從光合細菌細胞中提取番茄紅素，具體實施步驟是用50～500ml離心管離心收穫培養好的光合細菌細胞，倒淨上清液後分別加入5.0～50ml由甲醇和正己烷組成的體積比為1∶2～2∶1的混合溶劑，在室溫下浸提0.5～1.0小時，然後採用離心機在8000～15000轉/分轉速下離心20～30分鐘，提取溶劑上清液正己烷相中從光合細菌細胞中提取出的番茄紅素量。本發明採用一種小分子量的極性有機溶劑甲醇和一種非極性試劑正己烷進行混合作為提取劑，可以高效地從光合細菌細胞中提取出番茄紅素，為實現採用光合細菌生產番茄紅素的產業化生產奠定重要基礎。
文檔編號C07C7/10GK101314555SQ20081011566
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月26日 優先權日2008年6月26日
發明者包有霞, 孫旭東, 許倩倩, 海 閆 申請人:北京科技大學