一種評估廢水中抗生素的殘留生物效能的方法
2023-06-02 01:53:51
一種評估廢水中抗生素的殘留生物效能的方法
【專利摘要】本發明公開了一種評估廢水中抗生素的綜合生物效能（效價當量）的方法，包括對廢水採用比濁法測定吸光度，計算廢水中抗生素的殘留生物效能。本發明方法能夠對廢水中的不同抗生素及其具有抗菌活性基團的代謝產物進行準確測定，操作簡便，從而能夠對不同類型抗生素廢水進行比較或是對含有多種抗生素的混合廢水進行綜合評價，而且對不同類抗生素廢水的殘留生物效能的評價具有普適性。
【專利說明】一種評估廢水中抗生素的殘留生物效能的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於抗生素的檢測領域，特別涉及抗生素生產廢水中殘留抗生素及其相關物質的生物效能的評估方法。
【背景技術】
[0002]抗生素的汙染問題受到越來越多的重視,抗生素已經成為環境中普遍存在的汙染物，不僅在土壤和地表水中被頻繁檢出，在地下水甚至飲用水源中也有發現。其中，抗生素生產廢水是抗生素進入環境的重要來源之一。1995年Holm等人分析了一個廢棄製藥廠廢物填埋場的地下水，結果磺胺類藥物濃度達到5mg/L ；2008年我國一個調查發現土黴素生產廢水經過處理後出水土黴素濃度達到50mg/L。抗生素生產廢水中殘留抗生素及相關物質(主要是某些具有抑菌效應的異構體或水解與降解中間產物等)含量高，對廢水生物處理系統的影響也相當顯著。因此抗生素生產廢水的研究受到廣泛的關注。
[0003]目前國內外對廢水中抗生素的檢測主要採用的是色譜法及其聯用技術、毛細管電泳法等理化檢測方法。理化檢測方法是利用抗生素分子中的官能團所具有的特殊反應或由其性質來測定含量，使用最廣泛的是相對成熟的液相色譜法及其聯用技術。但是此方法適用於已知結構的抗生素及其代謝產物，需要有相應的抗生素標準品才能進行定量，而抗生素生產廢水在處理過程中會發生一系列的變化，產生不同的異構體或水解與降解中間產物，這些產物中仍有部分會保留一定的抗菌活性甚至可能具有更高的抗菌活性，例如，土黴素在弱酸條件下(pH值3-6.5)，土黴素能夠降解成為去水土黴素(Anhydrooxytetracycline)和差向異構土黴素(Epimeric-Oxytetracycline),去水土黴素能夠迅速不可逆地降解成為a-Apo-OTC和β-Αρο-OTC，強酸條件下，a-Apo-OTC和β -Apo-OTC能夠進一步不可逆降解成為Ter-OTC ;同時在較溫和的中性和弱鹼條件下，土黴素可能產生更為複雜的降解過程，形成iso-OTC，N-DM-OTC，以及N-DDM-OTC等降解產物；在鹼性溶液中，土黴素的主要降解產物是Terranoic acid。差向異構土黴素、a-Apo-OTC和β-Apo-OTC往往是土黴素的主要降解產物，而差向異構土黴素與土黴素的比例在0.4到
0.6之間。這三種主要的降解產物仍然具有部分抗菌作用，最低抑菌濃度(MIC)分別為1.0、32和>32mg/L，同時也有實驗表明這三種降解產物的生物毒性超過土黴素的生物毒性。
[0004]例如申請號為200810110955.7的發明專利申請公開了一種乳及乳製品中四環素類抗生素殘留量的檢測方法。該方法利用超高效液相色譜-電噴霧串聯三重四極杆質譜儀測定四環素類抗生素殘留量。試樣經Na2EDTA-McIIvaine緩衝液(pH4.0)提取，三氯乙酸除蛋白，經HLB固相提取小柱淨化和富集，採用色譜柱分離，以標準品土黴素、四環素和金黴素配製含量為 100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、lng/ml、0.lng/ml、Ong/ml 的標準溶液，在柱溫30°C，以含有0.1%甲酸的水溶液(v/v)和乙腈為流動相進行梯度洗脫，採用多反應監測方式進行定量。此法雖然快速、準確、靈敏度高，但是其適用範圍僅用於測定土黴素、四環素和金黴素三種四環素類抗生素的含量，對於其中可能出現的其他類抗生素以及相關的代謝中間產物則不能進行檢測。[0005]本發明主要針對此問題，以抗生素中具有抑菌活性的有效成分即「效價」作為對象，檢測廢水中抗生素的殘留生物效能(抗生素及其相關物質的生物效能)。根據藥典，抗生素效價常採用微生物檢定法，是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理，如管碟法、比濁法、稀釋法等，其中，管碟法是目前抗生素效價測定的國際通用方法，我國藥典也採用此法。管碟法是根據抗生素在瓊脂平板培養基中的擴散滲透作用，比較標準品和待檢品兩者對試驗菌的抑菌圈的大小來測定供試品的效價。2005年版《中國藥典》正式收錄比濁法，與管碟法並列成為抗生素效價測定的標準方法之一。比濁法是利用抗生素在液體培養基中對實驗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌生長的抑制作用，通過測定培養後細菌濁度值的大小，比較標準品與供試品對實驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法。國內已有基於比濁法的抗生素效價測定儀，但是主要用於藥品、製劑的純度檢驗，還沒有針對廢水進行應用。
[0006]我國現行的藥典中採用比濁法對部分藥品或製劑進行效價純度檢測，但是其測定對象仍然是比較單純的某一抗生素藥品或製劑，即藥典中的效價方法的對象是單一抗生素藥品製劑的檢驗，不涉及混合抗生素。具體是針對某一種抗生素供試品與其標準品的對照來計算供試品的效價(供試品與標準品種類一致)，而混合抗生素的效價由於沒有比較的標準，因此還未見採用比濁法測定廢水等環境樣品的效價。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是針對現有抗生素殘留生物效價測定存在的技術的問題，提供一種具有普適性的廢水中抗生素的生物效能的評估方法，本發明方法能夠對含有不同種類抗生素及具有抗菌活性基團的抗生素代謝產物的廢水的殘留生物效能進行準確測定，操作簡便，對不同類抗生素廢水的殘留生物效能的評價具有普適性和通用性。
[0008]為實現本發明的目的，本發明一方面提供一種評估廢水中抗生素的殘留生物效能的方法，包括如下順序進行的步驟:
[0009]I)採用比濁法篩選針對革蘭氏陽性菌(G+)的標準參照抗生素，並獲得革蘭氏陽性菌-標準參照抗生素標準曲線；
[0010]2)富集和純化廢水中的抗生素類物質，獲得抗生素類富集物；
[0011]3)用無菌水溶解抗生素類富集物後加入革蘭氏陽性菌菌液，混合均勻，採用比濁法測定吸光度；
[0012]4)將測定得到的吸光度值代入革蘭氏陽性菌-標準參照抗生素的標準曲線中，獲得廢水中抗生素類物質的綜合生物效能。
[0013]其中，所述革蘭氏陽性菌選擇金黃色葡萄球菌。
[0014]特別是，以抗生素濃度的對數值為橫坐標，以革蘭氏陽性菌與抗生素的混合溶液在波長為530nm處的吸光度值為縱坐標繪製獲得所述革蘭氏陽性菌-標準參照抗生素標準曲線。
[0015]其中，步驟I)中所述標準參照抗生素的篩選包括如下順序進行的步驟:
[0016]1A)將革蘭氏陽性菌(G+)接種於抗生素III號培養基中，搖勻，培養，製得革蘭氏陽性菌標準菌液，備用；
[0017]1B)精確稱取抗生素標準品，溶解，配製成不同濃度的抗生素溶液，接著加入革蘭氏陽性菌菌液(G+)，混合均勻後在530nm波長下進行比濁測定，測定革蘭氏陽性菌與不同濃度的抗生素溶液的混合液的濁度吸光度值；
[0018]1C)以抗生素濃度的對數值為橫坐標，以革蘭氏陽性菌與抗生素的混合液的吸光度值為縱坐標繪製所述革蘭氏陽性菌-抗生素的標準曲線；
[0019]1D)根據得到的革蘭氏陽性菌-抗生素的標準曲線，以標準曲線的斜率以及綜合因子作為篩選依據，篩選得到針對革蘭氏陽性菌的標準參照抗生素為紅黴素，其中所述綜合因子為革蘭氏陽性菌-抗生素的標準曲線的線性濃度範圍內的高濃度與低濃度比值與標準曲線的斜率之積。
[0020]其中，步驟1A)中所述培養的溫度為35_37°C。
[0021]特別是，所述革蘭氏陽性菌標準菌液在波長530nm處的吸光度達到0.3-0.7。
[0022]特別是，還包括將冷凍保藏的革蘭氏陽性菌(G+)進行復活培養之後再接種到抗生素III號培養基中，培養製成所述的革蘭氏陽性菌標準菌液。
[0023]尤其是，所述復活培養溫度為35_37°C ;培養時間為4_5h。
[0024]其中，步驟1B)中所述抗生素溶液的配製方法如下:首先將抗生素標準品按照表I所述方法配製成抗生素標準儲備液，然後再加入磷酸鹽緩衝液，配製成相應的不同濃度的抗生素溶液。
[0025]表1抗生素儲備液的配製方法
【權利要求】
1.一種評估廢水中抗生素的殘留生物效能的方法，包括如下順序進行的步驟: 1)採用比濁法篩選針對革蘭氏陽性菌的標準參照抗生素，並獲得革蘭氏陽性菌-標準參照抗生素標準曲線； 2)富集和純化廢水中的抗生素類物質，獲得抗生素類富集物； 3)無菌水溶解抗生素類富集物後加入革蘭氏陽性菌菌液，混勻，採用比濁法測定吸光度； 4)將測定得到的吸光度值代入革蘭氏陽性菌-標準參照抗生素的標準曲線中，獲得廢水中抗生素類物質的綜合生物效能。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟I)中所述標準參照抗生素的篩選包括如下順序進行的步驟: IA)將革蘭氏陽性菌接種於抗生素III號培養基中，搖勻，培養，製得革蘭氏陽性菌標準菌液，備用； IB)精確稱取抗生素標準品，溶解，配製成不同濃度的抗生素溶液，接著加入革蘭氏陽性菌菌液，混勻後在530nm波長下進行比濁測定，測定革蘭氏陽性菌與不同濃度的抗生素溶液的混合液的吸光度值； IC)以抗生素濃度的對數值為橫坐標，以革蘭氏陽性菌與抗生素的混合液的吸光度值為縱坐標繪製所述革蘭 氏陽性菌-抗生素的標準曲線； ID)根據得到的革蘭氏陽性菌-抗生素的標準曲線，以標準曲線的斜率以及綜合因子作為篩選依據，篩選得到針對革蘭氏陽性菌的標準參照抗生素為紅黴素，其中所述綜合因子為革蘭氏陽性菌-抗生素的標準曲線的線性濃度範圍內的高濃度與低濃度比值與標準曲線的斜率之積。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵是步驟1A)中所述培養的溫度為35-37°C。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵是步驟1A)中所述革蘭氏陽性菌標準菌液在波長530nm處的吸光度達到0.3-0.7。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特徵是所述革蘭氏陽性菌選擇金黃色葡萄球菌。
6.一種評估廢水中抗生素的殘留生物效能的方法，包括如下順序進行的步驟: (1)採用比濁法篩選針對革蘭氏陰性菌的標準參照抗生素，並獲得革蘭氏陰性菌-標準參照抗生素標準曲線； (2)富集和純化廢水中的抗生素類物質，獲得抗生素類富集物； (3)無菌水溶解抗生素類富集物後加入革蘭氏陰性菌菌液，混勻，採用比濁法測定吸光度； (4)將測定得到的吸光度值代入革蘭氏陰性菌-標準參照抗生素的標準曲線中，獲得廢水中抗生素類物質的綜合生物效能。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵是步驟(1)中所述標準參照抗生素的篩選包括如下順序進行的步驟: (IA)將革蘭氏陰性菌接種於抗生素III號培養基中，搖勻，培養，製得革蘭氏陰性菌標準菌液，備用； (IB)精確稱取抗生素標準品，溶解，配製成不同濃度的抗生素溶液，接著加入革蘭氏陰性菌菌液，混勻後在530nm波長下進行比濁測定，測定革蘭氏陰性菌與不同濃度的抗生素溶液的混合液的吸光度值； (IC)以抗生素濃度的對數值為橫坐標，以革蘭氏陰性菌與抗生素的混合液的吸光度值為縱坐標繪製所述革蘭氏陰性菌-抗生素的標準曲線； (ID)根據得到的革蘭氏陰性菌-抗生素的標準曲線，以標準曲線的斜率以及綜合因子作為篩選依據，篩選得到針對革蘭氏陰性菌的標準參照抗生素為四環素，其中，所述綜合因子為革蘭氏陰性菌-抗生素的標準曲線的線性濃度範圍內的高濃度與低濃度比值與標準曲線的斜率之積。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵是步驟(IA)中所述革蘭氏陰性菌標準菌液在波長530nm處的吸光度達到0.3-0.7。
9.如權利要求6或7所述的方法，其特徵是所述革蘭氏陰性菌選擇大腸桿菌。
10.如權利要求1或6所述的方法，其特徵是步驟2)中採用固相萃取法對廢水進行富集和純化，得到 所述抗生素類富集物。
【文檔編號】G01N21/82GK103913426SQ201310006497
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月8日 優先權日:2013年1月8日
【發明者】張昱, 張紅, 楊敏, 劉苗苗, 田哲, 高迎新 申請人:中國科學院生態環境研究中心