重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶的製備方法

2023-06-16 10:29:11 2

重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶的製備方法
【專利摘要】本發明提供一種適合大腸桿菌分泌表達重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶(recombinant cordyceps sinensis superoxide dismutase，rcSOD)的信號肽核苷酸序列和編碼冬蟲夏草SOD的SOD核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的載體、含有前述載體的工程細胞以及從該工程細胞純化rcSOD的方法。優化後的超氧化物歧化酶基因非常適合大腸桿菌表達，具有高表達、高穩定、高分泌的特點。本發明可高效、簡便、低成本地獲得rcSOD純品。本發明還包括通過上述方法製備的重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶在製備治療與人超氧化物歧化酶相關疾病或病理症狀的藥物、食品、保健品及其化妝品中的應用。CGMCC 97442014.09.29
【專利說明】重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶的製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及大腸桿菌分泌表達重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶的編碼信號肽的核 苷酸序列和編碼冬蟲夏草S0D的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的載體、含有前述載體 的工程細胞和從該工程細胞純化rcSOD的方法及其用途，屬於基因工程和蛋白質生物化學 領域。

【背景技術】
[0002] 超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，S0D)是一種能夠催化超氧化物通過歧 化反應轉化為氧氣和過氧化氫的酶。它廣泛存在於各類動物、植物、微生物中，是一種重要 的抗氧化劑，保護暴露於氧氣中的細胞。按其所含金屬輔基不同可分為三種，第一種是含銅 (Cu)鋅（Zn)金屬輔基的稱（Cu.Zn-SOD)，最為常見的一種酶，呈綠色，主要存在於機體細胞 漿中；第二種是是含錳（Mn)金屬輔基的稱（Mn-S0D)，呈紫色，存在於真核細胞的線粒體和 原核細胞內；第三種是含鐵（Fe)金屬輔基的稱（Fe-SOD)，呈黃褐色，存在於原核細胞中。
[0003] 超氧化物歧化酶能夠清除超氧化物，保護細胞免受氧化損傷。超氧化物與非自由 基的反應是自旋禁阻的。在生物學系統中，這就意味著它主要是與自身（歧化）或另一個 生物學自由基（如一氧化氮）反應。超氧化物陰離子自由基（〇 20能夠較快地（在pH= 7 時，反應速度為歧化為02和過氧化氫（H202)。但超氧化物能夠與特定的分子（如 N0自由基）以更快的速度反應，生成過氧亞硝酸根離子（0 =N-0-CT)，因此超氧化物歧化 酶的催化作用就顯得尤為重要。而且，超氧化物的歧化反應與其初始濃度的平方相關，因此 雖然高濃度的超氧化物半衰期很短（比如〇.ImM濃度下為〇. 05秒），但低濃度的超氧化物 的半衰期相當長（〇.InM濃度下可達14小時）。相比較而言，超氧化物歧化酶催化的歧化反 應對於超氧化物初始濃度只是一級反應，並且在所有已知酶中具有最快的轉換數（與底物 反應速率）(LoefflerPetridesHeinrich.Biochemie&Pathobiochemie. 8th Edition. 2007. 123.)，因此反應速率的限制只是在於酶和超氧化物分子間的碰撞頻率，即 反應速率是"擴散限制性"的。
[0004] 超氧化物是細胞中主要的活性氧之一，因此超氧化物歧化酶發揮了關鍵的抗 氧化劑的作用。超氧化物歧化酶具有重要的生理學作用，基因工程改造後的缺乏該 酶的小鼠會患上嚴重的疾病。例如，缺乏S0D2的小鼠在出生後數天死於嚴重的氧化 應急(Li,etal. ,Y.Dilatedcardiomyopathyandneonatallethalityinmutant micelackingmanganesesuperoxidedismutase.Nat.Genet. 1995,11:376 - 381. doi: 10. 1038/ngl295-376.);缺乏S0D1的小鼠具有廣泛的病理特徵，包括肝細胞 癌(hepatocellularcarcinoma) (Elchuri,etal.,S.CuZnSODdeficiencyleadsto persistentandwidespreadoxidativedamageandhepatocarcinogenesislaterin life. ?Oncogene. 2005, 24:367 - 380.doi: 10. 1038/sj.one. 1208207.)、與年紀相關的肌肉 的質量力口速減少（Muller，etal.，F.L.AbsenceofCuZnsuperoxidedismutaseleads toelevatedoxidativestress,mutagenesisandaccelerationofage-dependent skeletalmuscleatrophy.FreeRadic.Biol.Med. 2006, 40:1993 - 2004.doi:10. 1016/j.freeradbiomed.2006.01.036.)、白內障提早發生以及壽命減少；缺乏S0D3的小鼠不 表現出任何明顯的缺陷並具有正常的壽命，然而它們更易於發生高氧損傷。敲除任何 一種超氧化物歧化酶的小鼠更易於死於超氧化物生產的藥劑，如百草枯（paraquat)和 舌夂草快(diquat) (Sentman,etal. ,M.L.Phenotypesofmicelackingextracellular superoxidedismutaseandcopper-andzinc-containingsuperoxidedismutase. J.Biol.Chem. 2006, 281:6904 - 6909.doi:10. 1074/jbc.M510764200.)〇
[0005] 缺少S0D1的果蠅具有顯著縮短的壽命，而缺少S0D2的果蠅則在出生前就死去。在 線蟲線蟲中敲除S0D不導致嚴重的生理學紊亂。S0D1的敲除或缺失突變對於釀酒酵母在 無氧環境生長非常有害，並導致後二峰生長期（P〇st-diauxiclifespan)的顯著縮短；而 S0D2的敲除或缺失突變則會引起生長抑制並同樣減少後二峰生長期。
[0006] 冬蟲夏草（cordycepssinensis)別名蟲草，冬蟲草，中華蟲草，是由肉座菌目蛇形 蟲草科蛇形蟲草屬的冬蟲夏草菌寄生於高山草甸土中的蝠蛾幼蟲，使幼蟲身軀僵化。並在 適宜條件下，夏季由僵蟲頭端抽生出長棒狀的子座而形成，即冬蟲夏草菌的子實體與僵蟲 菌核（幼蟲屍體）構成的複合體。主要活性成分是蟲草素，其有調節免疫系統功能、抗腫 瘤、抗疲勞、補肺益腎，止血化痰，秘精益氣等多種功效。食用方法有打粉、泡酒、泡水等。冬 蟲夏草主要產於中國大陸青海、西藏、四川、雲南、甘肅和貴州等省及自治區的高寒地帶和 雪山草原。冬蟲夏草也含有S0D，但含量極低。為了獲得冬蟲夏草S0D，我們利用現代基因 工程技術，嘗試了表達冬蟲夏草S0D蛋白工程菌及其載體，本發明系統優化、改變了獲得冬 蟲夏草S0D的大腸桿菌工程細胞的方法，利用大腸桿菌基因表達的分泌肽段與S0D融合表 達獲得了更為滿意的結果，並通過發酵工藝的改進，同時簡便純化工藝，獲得高表達、高活 性和高得率、極具產業化價值的一種銅鋅型rcSOD生產方法。


【發明內容】

[0007] 基於現有技術的缺欠，本發明的目的是提供編碼上述信號肽的核苷酸序列、含有 該信號肽核苷酸序列和冬蟲夏草S0D核苷酸序列的載體、含有前述載體的工程細胞以及從 該工程細胞純化rcSOD的方法。
[0008] 本發明的發明人驚奇地發現，在表達如SEQIDN0 :3所示的冬蟲夏草S0D核苷酸 序列前，加入如SEQIDN0 :1所示的信號肽核苷酸序列，可以意外地獲得高融合表達的冬蟲 夏草S0D的載體，且使用該載體表達的S0D易於純化，純度高、收量大，活性高。
[0009] 在本發明的又一個方面，提供了一種在編碼冬蟲夏草超氧化物歧化酶的核苷酸序 列前加入一個能使冬蟲夏草超氧化物歧化酶表達後分泌到細胞壁與原生質膜間隙的分泌 肽段核酸序列，所述的核苷酸序列SEQIDN0 :1能夠編碼SEQIDN0 :2所示的胺基酸序列， 而且所述核苷酸序列SEQIDNO: 1與冬蟲夏草超氧化物歧化酶編碼區序列SEQIDN0 :3融 合形成核苷酸序列SEQIDN0 :5。
[0010] 在本發明的再一個方面，提供了一種表達載體，它含有本發明上述的核苷酸序列。 優選地，所述表達載體為pET22b。
[0011] 在本發明的再一個方面，提供了一種工程細胞，它是通過所述表達載體序列轉化 宿主細胞而獲得的，且表達載體中整合有編碼重組超氧化物歧化酶的核苷酸序列。
[0012] 優選地，所述的工程細胞是大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)。
[0013] 在本發明的進一步方面，提供了一種生產冬蟲夏草超氧化物歧化酶的表達方法， 包括以下步驟：在適合表達條件下，培養本發明上述的宿主細胞，從而分泌表達冬蟲夏草超 氧化物歧化酶；優選地，所述宿主細胞為大腸桿菌菌株為BL21 (DE3)。所述培養包括：培養 分為培養階段和誘導階段，培養階段培養菌液濃度達到0D600,誘導期時間為18-21hr，發 酵及誘導溫度保持在16_25°C，IPTG用量為0. 05-lmM/L，誘導期的pH值為6-8。所述大腸 桿菌宿主細胞包括可以用IPTG誘導合成冬蟲夏草超氧化物歧化酶，並且能夠分泌到細胞 壁與原生質膜間隙的大腸桿菌細胞。
[0014] 在本發明的另一個方面，對表達後重組冬蟲夏草S0D進行了粗提和進一步純化。 其包括如下步驟：（1)對發酵樣品通過離心和/或過濾方式收集菌體，用溶菌酶處理菌體， 再通過離心方法獲得清液，（2)通過鹽析和/或超濾進行初步純化後，或直接通過陰離子交 換、疏水層析方法，獲得純度達到95%以上（如95-99. 9% )的純品，本發明所製備的重組 冬蟲夏草S0D活性在5500U、或6000U以上。
[0015] 在本發明的另一個方面，本發明提供使用上述方法製備的重組冬蟲夏草S0D在制 備治療與人超氧化物歧化酶相關疾病或病理症狀的藥物、食品、保健品及其化妝品中的用 途。
[0016] 本發明的主要優點在於：（1)優化後的連結分泌信號肽基因非常適合大腸桿菌表 達，具有高表達、高穩定、高分泌的特點；（2)含有分泌信號肽的超氧化物歧化酶基因的宿 主菌株具有高密度生長的特性，非常適於基因工程藥物大規模高密度的發酵生產。大腸杆 菌表達的hgSOD以可溶性、具活性形式分泌到細胞壁與原生質膜間隙；產物不須復性，可以 直接進行純化；同時由於表達水平高，純化工藝複雜程度大大簡化，得率得到大幅度提高； (3)與真核系統表達相比，成本大大降低，產業化價值得到大幅度提升。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1顯示用於編碼本發明信號肽的核苷酸序列。
[0018] 圖2本發明信號肽的胺基酸序列。
[0019] 圖3顯示用於編碼本發明天然冬蟲夏草S0D的核苷酸序列。
[0020] 圖4本發明天然冬蟲夏草S0D的胺基酸序列。
[0021] 圖5顯示用於編碼本發明重組冬蟲夏草S0D的核苷酸序列。
[0022] 圖6本發明重組冬蟲夏草S0D的胺基酸序列。
[0023] 圖7用於編碼本發明信號肽的核苷酸序列與由其推定的本發明信號肽的胺基酸 序列的對應圖。
[0024] 圖8用於編碼本發明融和表達的重組冬蟲夏草S0D的核苷酸序列與由其推定的本 發明融和表達的重組冬蟲夏草S0D的胺基酸序列的對應圖。
[0025] 圖9是本發明的一種表達質粒pET-rcSOD的構建示意圖。
[0026] 圖10是搖瓶37°C條件下rcSOD表達電泳圖。各泳道如下：泳道1、誘導前；泳道 2、誘導後，誘導4小時取樣，SDS-PAGE電泳檢測表達情況。
[0027] 圖11是在不同溫度條件下（IPTG濃度為lmM/L)rcS0D表達電泳圖。誘導20小 時後，收集菌體，用溶菌酶在37 °C條件下，處理2小時，15000rpm離心10分鐘，取上清， SDS-PAGE檢測表達情況。
[0028] 圖12是IPTG濃度對rcSOD表達水平的影響。在20°C條件下，分別用0. 6mM、0. 4mM、 0. 2mM、0.ImM濃度的IPTG誘導表達。誘導20小時後，收集菌體，用溶菌酶在37°C條件下， 處理2小時，15000rpm離心10分鐘，取上清，SDS-PAGE檢測表達情況。
[0029] 圖13是誘導時間對rcSOD表達水平的影響。在25°C條件下，分別誘導8、10、16、 18、20、30小時後，收集菌體，用溶菌酶在37°C條件下，處理2小時，15000rpm離心10分鐘， 取上清，SDS-PAGE檢測表達情況。
[0030] 圖14是在25°C條件下，6. 5L發酵罐中rcSOD的表達情況電泳圖。各泳道如下：1、 誘導前取樣；2、誘導20小時取樣。
[0031] 圖15是純化後的rcSOD的電泳圖。在6.5L發酵罐中表達rcSOD，收集菌體，用溶 菌酶在37°C條件下，處理2小時，15000rpm離心10分鐘，取上清，用陰離子交換層析、疏水 層析以後的蛋白SDS-PAGE電泳圖。
[0032] 圖16是純化後冷凍乾燥粉產品用分子篩Superdex75 (Phamarcia)方法檢測產品 純度的層析圖譜。

【具體實施方式】
[0033] 為了提供對本發明的實質性理解，在下文中以不同的詳細程度描述了本發明的某 些方面、模式、實施方式、變型和特徵。
[0034] 在實施本發明的過程中，使用了分子生物學、基因工程學、遺傳學、細胞分子 生物學、生物化學、蛋白質生物化學、蛋白質生物化學工程、製藥工藝學、醫學、生理學、 病理學、動物實驗學，Sambrook等（MolecularCloning:ALaboratoryManual, 2nd edition, 1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)等很多傳統技術和基礎理論。這 些技術是熟知的。
[0035] 在本發明的一個實施方式中，提供了一種重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶，
[0036] 其中，所述冬蟲夏草超氧化物歧化酶包含任一如下胺基酸序列：
[0037] a)SEQIDN0. 2所示胺基酸序列；和/或
[0038] b)SEQIDN0. 4所示胺基酸序列；或
[0039] c)SEQIDN0. 6所示胺基酸序列。
[0040] 在本發明的又一個實施方式中，通過分子克隆提供編碼所述信號肽和冬蟲夏草超 氧化物歧化酶的核苷酸序列。
[0041] 本發明的術語"核苷酸序列"包括基因組DNA、CDNA、合成的DNA和RNA。優選地， 其指DNA，更優選為編碼序列的cDNA。本發明還涵蓋編碼具有如本文所定義的特定性質的 酶或蛋白的核苷酸序列。本文所用的術語"核苷酸序列"是指寡核苷酸序列或多核苷酸序 列和其變體、同源物、片段和衍生物（如其部分）。所述核苷酸序列可以是源自基因組或合 成物或重組物，其可以是雙鏈的或單鏈的（無論其代表正義鏈還是反義鏈）核酸分子。
[0042] 在本發明的一個【具體實施方式】中，提供了一種分離的核酸分子，其中，所述分離的 核酸分子包含任一如下核苷酸序列：
[0043] a)編碼SEQIDN0:2的胺基酸序列的SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0044] b)編碼SEQIDN0:4的胺基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0045]c)編碼SEQIDNO:6的胺基酸序列的SEQIDNO. 5所示的核苷酸序列。
[0046] 編碼具有如本文所定義的酶或蛋白的核苷酸序列可以從產生所述酶或蛋白的任 何細胞或生物中分離得到。用於分離核苷酸序列的各種方法都是本領域熟知的。本文僅 為舉例性質，例如利用強變性劑提取總RNA，利用轉錄和反轉錄方法，產生所述酶或蛋白的 生物的染色體DNA或信使RNA(mRNA)來構建基因組DNA和/或cDNA文庫。
[0047] 還有，也可以通過成熟的標準方法通過合成來製備編碼所述酶或蛋白的核苷酸序 列，再如，利用自動DNA合成儀上合成寡核苷酸，然後將其純化、退火、連接並克隆到適當的 載體中。
[0048] 因此，所述核苷酸序列可以是源自混合的基因組和合成來源、混合的合成和cDNA 來源、或混合的基因組和cDNA來源，其根據標準技術通過連接源自合成的、基因組的或 cDNA的片段根據需要而製得。每個連接的片段對應於整個核苷酸序列的不同部分。所述 DNA序列也可以使用特定引物通過聚合酶鏈式反應（PCR)來製備。
[0049] 本文中術語"PCR"被稱之為聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR) 是指在DNA聚合酶的催化下，通過變性、退夥，聚合擴增等反覆循環達到幾何數量級擴增位 於兩段已知序列之間的DNA區段。
[0050] 可以使用本發明的多核苷酸（核苷酸序列）製備引物，如PCR引物，用於可選擴增 反應的引物；或可以將多核苷酸克隆到載體中。所述引物、和其它片段的長度可以是至少 12個、如至少15個，優選為至少20個、如至少25個、30個、35個或40個核苷酸，且其也涵 蓋在如本文所用的術語多核苷酸之內。
[0051] 通常，使用重組DNA技術（即重組的DNA)製備編碼具有如本文所定義的特定性質 的酶或蛋白的核苷酸序列。因此，在本發明的一個可選實施方式中，可以使用本領域已知的 化學方法來合成全部或部分核苷酸序列。
[0052] 通常，可通過合成方法來製備引物，該方法包括以每次一個核苷酸的方式逐步制 備所需要的核酸序列。本領域中易於獲得使用自動化技術來實現上述方法的技術。引物 設計可以根據提高純度需要考慮在目的蛋白N端或C端的核苷酸序列加入編碼標籤蛋 白（Tagged-proteinexpressionsystem)的核苷酸序列，常見的標籤蛋白包括但不限於 His-tag蛋白，Flag-tag蛋白，GST-tag蛋白等。
[0053] 可以重組、合成或通過本領域技術人員可利用的任何方法來製備根據本發明的多 核苷酸（如DNA多核苷酸）。它們也可以通過標準技術進行克隆。通常使用重組方法，如使 用PCR(聚合酶鏈式反應）克隆技術來製備較長的多核苷酸。這包括製備位於所需要克隆 的脂質靶向序列區域側翼的一對引物（如約12至40個核苷酸），使引物接觸從冬蟲夏草中 獲得的mRNA或cDNA，在可以使所需區域擴增的條件下進行聚合酶鏈式反應，分離擴增的片 段（如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物），並回收擴增的DNA。可以設計引入使其包含 適合的限制性酶識別位點，以便可以將擴增的DNA克隆到適合的克隆載體中。
[0054] 如上所述，可以重組、合成或通過本領域技術人員可利用的任何方法來製備根據 本發明的多核苷酸（如DNA多核苷酸）。它們也可以通過標準技術進行克隆。通常使用重 組方法，如使用PCR(聚合酶鏈式反應）克隆技術來製備較長的多核苷酸。這包括製備位於 所需要克隆的脂質靶向序列區域側翼的一對引物（如約15至30個核苷酸），使引物接觸 從冬蟲夏草中獲得的mRNA或cDNA，在可以使所需區域擴增的條件下進行聚合酶鏈式反應， 分離擴增的片段（如通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物），並回收擴增的DNA。可以設 計引入使其包含適合的限制性酶識別位點，以便可以將擴增的DNA克隆到適合的克隆載體 中。酶切位點的設計可以根據載體克隆位點和編碼具有本文所定義的特定性質的酶或蛋白 的核苷酸序列來設定，往往在前面加入若干個保護鹼基，詳細參考PROMEGA公司提供的保 護鹼基設定參考手冊。
[0055] 在本發明的一個【具體實施方式】中，所述冬蟲夏草超氧化物歧化酶通過表達任一以 下所示的核苷酸序列而獲得：
[0056]a)編碼SEQIDN0:2的胺基酸序列的SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0057]b)編碼SEQIDN0:4的胺基酸序列的SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0058]c)編碼SEQIDN0:6的胺基酸序列的SEQIDN0. 5所示的核苷酸序列。
[0059] 術語"構建體"，即指構建的載體，其包含載體載體本身的核苷酸序列和依照本發 明使用的編碼具有本文所定義的特定性質的酶或蛋白的核苷酸序列，且其直接或間接地與 啟動子連接。在一些【具體實施方式】中，優選構建體至少包含本發明的核苷酸序列，或編碼具 有如本文定義的特定性質的酶或蛋白且可操作地與啟動子連接的核苷酸序列。
[0060] 術語"表達載體"是指能夠在體內或體外表達的構建體。其包含載體本身的核苷 酸序列和依照本發明使用的編碼具有本文所定義的特定性質的酶或蛋白的核苷酸序列，且 其直接或間接地與強啟動子連接。優選地，本發明的表達載體包含載體本身的核苷酸序列 和所述信號肽-冬蟲夏草S0D結合的核苷酸序列，表達載體可以被引入到生物（如大腸杆 菌宿主生物）的基因組中。術語"引入"優選涵蓋穩定的引入到基因組中。
[0061] 在本發明的一個【具體實施方式】中，提供了 一種表達載體，其中所述表達載體含有 任一如下核苷酸序列：
[0062]a)SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；和/或
[0063]b)SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列；或
[0064]c)SEQIDN0. 5所不的核苷酸序列。
[0065] 優選地，所述表達載體為pET22b。
[0066] 如本文所定義的編碼冬蟲夏草SOD的核苷酸序列和信號肽序列可以存在於載體 中，在該載體中所述核苷酸序列可操作地連接到調控序列，使得所述調控序列能夠通過適 合的宿主細胞（如大腸桿菌）表達所述核苷酸序列，即所述載體是表達載體。本發明的載 體可以被轉化到上述的適合宿主細胞中，以表達具有如本文所定義的編碼冬蟲夏草S0D活 性的酶或蛋白。通常根據其將被引入的宿主細胞來選擇載體（如質粒、粘粒、病毒或噬菌體 載體、基因組插入物）。本發明可以涵蓋發揮等同功能且本領域已知或可知的其它形式的表 達載體。一旦轉化到所選擇的宿主細胞中，載體可以不依賴宿主細胞的基因組而複製並發 揮功能，或可以自行整合進入基因組。
[0067] 所述載體可以包含一個或多個選擇性標記基因，如提供抗生素抗性的基因，如提 供氨苄青黴素抗性、卡那黴素抗性、氯黴素抗性或四環素抗性的基因。載體可以在體外使 用，例如，用於製備RNA或用於轉染或轉化宿主細胞。
[0068] 表達載體可以進一步包含能使該載體在所述宿主細胞中複製的核苷酸序列。所述 載體可以是PET1-46系列載體（N0VAGEN公司）、pGEX系列載體、pUC系列載體、pACYC系列 載體、pUB系列載體、pE系列載體、pAMB系列載體和plj系列載體。優選為pET系列載體， 最優選為pET22b。
[0069] 上述核苷酸序列的檢測是通過核苷酸序列測序儀來完成，同時通過各種分子 生物學軟體來分析所得到的基因是否是目的基因。常用分析軟體有GENTYX，Vector NTI，GenDOC，DNAman，也可以藉助於BLAST和FASTA進行離線和/或在線搜索和檢索分析用 以比對核苷酸序列和蛋白質序列。
[0070] 本文所使用的術語"酶"與術語"胺基酸序列"和/或術語"酶或蛋白"和/或術語 "蛋白"同義。在一些實例中，術語"胺基酸序列"與術語"肽"和/或"酶"同義，可以互為 替代使用。
[0071] 本文所使用的術語"重組冬蟲夏草S0D"與術語"融和表達的重組冬蟲夏草S0D"同 義。
[0072] 本文術語"信號肽"是根據所用的序列和/或載體，通過由宿主細胞表達編碼冬蟲 夏草S0D的核苷酸序列所產生的冬蟲夏草S0D可以被分泌出或包含在細胞內。信號序列可 以用於指導編碼序列分泌通過特定的細胞膜。所述信號序列對冬蟲夏草S0D編碼序列來說 可以是天然的或外源的。可以使用能夠指導所表達的冬蟲夏草S0D進入所選宿主細胞（優 選為大腸桿菌BL21宿主細胞）分泌途徑的任何信號肽編碼序列。
[0073] 用於本發明任一方法和/或應用中的編碼冬蟲夏草S0D的核苷酸序列可以編碼天 然的冬蟲夏草S0D或冬蟲夏草S0D變體。例如，用於本發明的編碼冬蟲夏草S0D的核苷酸 序列可以是中所述的一種。NCBI這些文獻通過引用併入本文。
[0074] 本文所用的術語"冬蟲夏草S0D"優選地是指具有催化超氧自由基轉化為過氧化氫 和產生氧氣功能的酶。
[0075] 優選地，用於本發明任一方法和/或應用中的冬蟲夏草S0D是能夠將各種有機體 內的超氧自由基轉化為過氧化氫和產生氧氣功能。所述有機體包括但不限於動物、植物和 微生物。首選為動物，優選為人類。
[0076] 在本發明的一些實施方式中，可以將編碼信號肽的核苷酸序列可操作地連接到編 碼所選冬蟲夏草S0D的核苷酸序列。所選冬蟲夏草S0D可以在本文所定義的宿主細胞中作 為融合蛋白表達。
[0077] 本發明還涵蓋由用於本發明任一方法和/或應用中的編碼冬蟲夏草超氧化物歧 化酶的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
[0078] 本發明提供了一種特別適合在大腸桿菌細胞中表達的冬蟲夏草超氧化物歧化酶 的分泌肽段編碼序列。該序列是根據大腸桿菌密碼子偏愛性等原則而篩選出的。設計出的 專門為rcSOD分泌表達的編碼序列用常規方法進行全基因合成，或通過PCR方法實現的。
[0079] 本文中的術語"細胞"包含本發明的核苷酸序列或編碼具有如本文定義的特定性 質的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其獲得的產物的任何細胞，其與術語"生物"和/或術 語"細菌"和/或術語"微生物"和/或術語"細菌微生物"同義，互為替換使用。如在背景 技術所描述的含有編碼天然冬蟲夏草S0D酶的天然核苷酸序列的天然冬蟲夏草植物細胞 也包含在本文術語"細胞"內。
[0080] 與本發明有關的術語"工程細胞"或"轉化的宿主細胞"包括任何包含編碼具有如 本文定義的特定性質的酶或蛋白的核苷酸序列和/或由其獲得的產物的細胞，和/或其中 啟動子能夠允許編碼具有如本文定義的特定性質的酶或蛋白的核苷酸序列在所述生物內 表達。優選核苷酸序列被引入到生物的基因組中。
[0081] 術語"轉基因生物"不涵蓋在處於自身天然環境中並同時受到其同處於自身天然 環境中的天然啟動子控制的天然核苷酸編碼序列。因此，本發明的轉基因生物包括包含以 下任何一種或組合的生物：編碼具有如本文定義的特定性質的酶或蛋白的核苷酸序列、本 文定義的構建體、本文定義的載體、本文定義的質粒、本文定的細胞或其產物。例如，所述轉 基因生物還可以包含編碼具有如本文定義的特定性質的酶或蛋白且受到啟動子控制的核 苷酸序列，其中所述啟動子原本並不與重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶編碼基因相連。
[0082] 在本發明的再一個實施方式中，提供一種工程細胞，其中所述工程細胞是通過轉 化上述表達載體進入宿主細胞後獲得的細菌細胞。
[0083] 所述宿主微生物可以是原核或真核生物。本發明的冬蟲夏草S0D或者編碼 冬蟲夏草S0D的核苷酸序列可獲自於，包括但不限於以下屬的細菌微生物：埃希氏菌 屬（Escherichia)、分枝桿菌屬（Mycobacterium)、鏈球菌屬（Streptococcus)、乳桿菌 屬（Lactobacillus)、脫亞硫酸菌屬（Desulfitobacterium)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、 彎曲桿菌屬（Campylobacter)、弧菌屬（Vibrionaceae)、木桿菌屬（Xylella)、硫化 葉菌屬（Sulfolobus)、氣單胞菌屬（Aeromonas)、鏈黴菌屬（Streptomyces)、酵母菌 屬（Saccharomyces)、乳球菌屬（Lactococcus)、、麴黴屬（Aspergillus)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)、李斯特菌屬（Listeria)、奈瑟氏球菌屬（Neisseria)、中慢生根 瘤菌屬（Mesorhizobium)、雷爾氏菌屬（Ralstonia)、黃單胞菌屬（Xanthomonas)和假絲酵 母屬（Candida);優選為埃希氏菌屬（Escherichia).優選為埃希氏菌屬（Escherichia)。
[0084] 適宜地，本發明的冬蟲夏草SOD或者編碼冬蟲夏草SOD的核苷酸序列可以獲自於， 優選獲自於以下細菌微生物：大腸桿菌（E.coli)、芽孢桿菌（Bacillussp)、空腸彎曲杆 菌（Campylobacterjejuni)、弧菌（Vibrionaceae)、苛養木桿菌（Xylellafastidiosa)、 硫橫礦硫葉菌（Sulfolobussolfataricus)、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、 嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila)、殺鮭氣單胞菌（Aeromonassalmonicida)、天藍 色鏈黴菌（Streptomycescoelicolor)、龜裂鏈黴菌（Streptomycesrimosus)、分枝桿菌 (Mycobacterium)、化胺性鏈球菌（Streptococcuspyogenes)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)、青枯雷爾氏菌（Ralstoniasolanacearum)、野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris)、地毯草黃單胞菌（Xanthomonasaxonopodis)、近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis)、嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus)、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)、脫齒脫亞硫酸菌（Desulfitobacteriumdehalogenans)、土麴黴（Aspergillus terreus)、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe)、無害李斯特菌（Listeria innocua)、單核細胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes)、腦膜炎奈瑟氏球菌 (Neisseriameningitidis)、百脈根中慢生根瘤菌（Mesorhizobiumloti)。優選為大腸杆 菌細胞，更優選為BL21(ED3)大腸桿菌細胞。
[0085] 在本發明的一些實施例中，製備了一些感受態細胞以利於體外載體轉入到宿主細 胞中。常用製備感受態細胞包括低溫處理，例如16°C。
[0086] 再者，適合用於本發明的宿主生物也可以為植物。因此，本發明還涉及產生具有 增強S0D表達水平的轉基因植物的方法，其包括以下步驟：利用本文定義的冬蟲夏草過氧 化物歧化酶（尤其是利用包含本文定義的冬蟲夏草過氧化物歧化酶的表達載體或構建體） 轉化植物細胞，和由轉化的植物細胞培養出植物。在一個實施方式中，根據本發明的冬蟲 夏草SOD可以是可獲自於，優選獲自於大腸桿菌BL21JZY001的冬蟲夏草SOD(分類命名： 大腸埃希氏菌，EscherichiaColi)，所述大腸桿菌菌株JZY001由吉林省金梓源生物技術 有限公司根據國際承認用於專利程序的微生物保藏布達佩斯條約保藏在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollection Center(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼： 100101)保藏日為2014年09月29日，保藏號為CGMCC9744。
[0087] 在本發明的一些實施方式中，對適合本發明的細菌微生物的菌種、培養條件、誘導 條件和表達發酵條件等進行了實驗性研究，所述條件還包括溶氧、轉速和溫度等外部各種 條件。
[0088] 在獲得工程細胞後，便可在適合的條件下培養工程細胞。凡適合於大腸桿菌生長、 表達的培養基都可用於本發明。例如，合適的培養基包括（但並不限於）以下培養基：LB培 養基、馬鈴薯糖瓊脂培養基、豆芽汁培養基、豌豆瓊脂培養基、馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養基、 馬鈴薯_蔗糖-瓊脂培養基等，優選為LB培養基。
[0089] 溶氧條件都可以控制，適合的溶氧控制在20-90%。溶氧的維持可以用氧氣、空氣 混合氣體的通入來解決。
[0090] 在另一優選例中，本發明還通過發酵工藝優化，進一步優化了rcSOD的表達條件。 由於表達水平高，達到l〇〇mg/L以上，且為可溶性表達，給純化工藝帶來極大便利，通過二 步層析工藝，大幅度提商廣品得率，得到了表達量商、比活性商、提純方便、得率商和性狀穩 定的rcSOD產品，大大降低生產成本，非常適合大規模生產。
[0091] 在優化基因的5'端與3'端分別引進特異性酶切位點，用分子克隆的常規方法， 將優化基因克隆入表達載體（如pET28、pET22等）。然後，轉化入BL21 (DE3)宿主細胞，用 IPTG誘導，搖瓶表達選出高表達工程細胞。
[0092] 在獲得工程細胞後，便可在適合的條件下培養工程細胞。凡適合於大腸桿菌生長、 表達的培養基都可用於本發明。例如，合適的培養基包括但並不限於以下培養基：
[0093] -種優選的搖瓶培養條件是：挑取LB平板上的單克隆，以LB為搖瓶培養液，培養 至0D600,用IPTG誘導表達，誘導18-21小時，rcSOD產量可達50-200mg/L。
[0094] 為了大規模生產rcSOD，需要在發酵罐上培養工程細胞，表達rcSOD，因此對大腸 桿菌BL21 (DE3)工程細胞的中試表達條件進行優化，發酵規模從1L到300L，發酵能力呈線 性放大。優化後表達量大於400mg/L發酵物。
[0095] 經過本發明的反覆實驗，表達條件進行優化如下：
[0096] 1.對於培養基的選擇而言，發酵罐發酵時可選擇無機鹽培養基，也可在無機鹽培 養基基礎上進行一定更改，但所含離子成份宜與無機鹽培養基相似。
[0097] 2.就溫度的控制而言，rcSOD的發酵及誘導溫度保持在16-25°C。
[0098] 3.就誘導期的pH值而言，誘導期pH控制在6-8 ;
[0099] 4.就溶氧（D0)的控制而言，D0控制在20-90%。溶氧的維持可以用氧氣/空氣 混合氣體的通入來解決。
[0100] 5.就補料的流加而言，補料種類宜包括澱粉、葡萄糖等碳源，可單獨補料或混合補 料。
[0101] 6.就誘導期IPTG濃度而言，常規誘導濃度都可用於本發明，通常IPTG濃度控制在 0.l-lmM/L〇
[0102] 7.就氨苄西林使用量而言，要求100mg-400mg，能夠有效地抑制雜菌生長。
[0103] 8.就誘導時間而言，沒有特別限制，通常為18-21小時，較佳地為20小時。
[0104] 在本發明的一些實施方式中，從發酵的細菌中抽提冬蟲夏草S0D蛋白。該抽提過 程就是所述的粗提，具體包括收集菌體，離心獲得生物量，破壁溶出蛋白，鹽析、過濾等步 驟。
[0105] 表達的rcSOD存在於細胞壁與原生質膜之間，表達水平大於200mg/L發酵物， 使純化複雜度大大下降。通常，發酵樣品先以離心或過濾等方式收集細胞，然後用溶菌 酶（4-10mg/g菌體）溶解細胞壁多糖，使目標蛋白進入上清液體中，上清液含目的蛋白質 rcSOD。上清液可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化後再進行層析純化，也可直接進行層 析純化，所述鹽析為用0-60%中性硫酸銨分級粗提蛋白，超濾用超濾膜進行過濾，例如用截 留分子量為10KD的超濾膜進行過濾。
[0106] 在本發明的一些實施方式中，對粗提後的蛋白進行進一步純化。層析技術包括陽 離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和層析等技術。經不同層析技 術、層析過程比較，優化的層析方法包括：1.陰離子交換層析：陰離子交換層析介質包括但 不限於Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果發酵樣品的鹽濃度較高，影響與離子交換介質 的結合，則在進行離子交換層析前需降低鹽濃度。樣品可以用稀釋、超濾、透析、凝膠過濾層 析等手段進行平衡緩衝液的更換，直至與對應的離子交換柱平衡液系統相似，然後上樣，進 行鹽濃度或pH的梯度洗脫；2.疏水層析：疏水層析介質包括但不限於Phenyl-Sepharose、 Butyl-Sepharose、Octyle_Sepharose。樣品通過添加NaCl、（NH4)2S04 等方式提高鹽濃度， 然後上樣，通過降低鹽濃度方法洗脫。通過疏水層析除去疏水性有較大差異的雜蛋白。3.凝 膠過濾層析疏水層析介質包括但不限於Sephacryl、Superdex、Sephadex類。通過凝膠過濾 層析更換緩衝體系，或進一步精純。
[0107] 經過上述純化可得到rcSOD純品，純化得率通常為40%以上，純度95%以上，純品 得率約200mg/L培養物。純化後的rcSOD可用常規方法製成各種劑型，如凍乾粉針劑。選 擇一定的穩定劑，同時還可添加表面活性劑、抗氧化劑等保護劑，及適當緩衝液進行冷凍幹 燥。得到的製品具有活性損失小、水分含量低、穩定性好、易於長期保存等特點。rcSOD還可 做成水針劑、噴霧劑、微球緩釋劑，以及經PEG修飾製成長效製劑等。
[0108] 在本發明的一個實例中，構建了rcSOD的BL21(ED3)表達工程細胞，IPTG誘導，高 水平分泌表達rcSOD，不需復性。
[0109] 在本發明的另一個實例中，經過發酵參數優化，提高rcSOD的表達水平。
[0110] 因表達蛋白屬於胞外分泌型，不需破菌處理。在本發明的另一個實例中，經過純 化，得到rcSOD純品，純化得率50%以上，純度95%以上，純品得率約200mg/L培養物。
[0111] 在本發明又一個實施方式中，純化後原液加入適當輔料，製成rcSOD的注射用粉 針劑。穩定性試驗表明，該粉針劑穩定。
[0112] 優選地，所述孵育溫度和孵育時間的組合可以有效保證至少5%的S0D活性，優選 至少 10% 的S0D活性，優選至少 15%、20%、25%、26%、28%、30%、40%、50%、60% 或 75% 的酶活性。
[0113] 在再一個實施方式中，樣品經10KD膜包超濾濃縮置換緩衝液、QSepharose F.F.以及phenylsepharoseF.F.層析以後得到純度大於95%、得率在50%以上的純品。
[0114] 綜上所述，在一個完整的【具體實施方式】中，本發明提供了一種製備重組冬蟲夏草 超氧化物歧化酶的方法，其中，所述方法包括如下步驟：
[0115]a)將如下的任一核苷酸序列克隆入表達載體pET22b的步驟，所述的核苷酸序列 為：SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，和/或SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列，或SEQID NO. 5所示的核苷酸序列；
[0116]b)將所述表達載體pET22b轉入到宿主細胞大腸桿菌BL21 (ED3)細胞的步驟；
[0117]c)將宿主細胞大腸桿菌BL21 (ED3)細胞進行培養步驟，培養條件包括：培養分為 培養階段和誘導階段，培養階段培養菌液濃度達到0D600,誘導時間為18-21hr，發酵及誘 導溫度保持在16_25°C，誘導期IPTG濃度在0. 1-0. 2mM/L;
[0118]d)分離純化出融核表達的重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶的步驟，對發酵樣品通 過離心和/或過濾方式收集菌體，用溶菌酶lmg/g菌體，在37°C條件下，處理2小時，再通過 離心獲得清液；
[0119]e)通過鹽析和/或超濾進行初步純化步驟，所述鹽析為用0-60%中性硫酸銨分級 粗提蛋白，超濾用超濾膜進行過濾，所述超濾膜為截留分子量為10KD的超濾膜；
[0120] f)通過陰離子交換、疏水層析方法，從而獲得純度達到95-99. 9%的重組冬蟲夏 草超氧化物歧化酶的步驟。
[0121] 在本發明的另一個實施方式中，提供使用上述方法製備的冬蟲夏草S0D在製備治 療與人超氧化物歧化酶相關疾病或病理症狀的藥物、食品、保健品及其化妝品中的用途，所 述重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶含有任一如下胺基酸序列：
[0122] a)SEQIDN0. 2所示胺基酸序列；和/或
[0123]b)SEQIDN0. 4所示胺基酸序列；或
[0124]c)SEQIDN0. 6所示胺基酸序列。
[0125] 上述相關疾病或病理症狀包括但不限於：白內障、退化性眼底病變，新生兒視網膜 病變、異位性皮膚炎、色素沉著黑斑、老人斑、皮膚過敏、高血壓、動脈硬化、心肌梗塞、心肌 無力、心律不整、鼻子過敏、氣喘、肺氣腫、肺纖維化、成人呼吸窘迫症、老年痴呆、帕金森氏 症、腦循環障礙、鐮刀型貧血、蠶豆症、鉛中毒、腎臟病、蛋白尿、膀胱炎、攝護腺肥大、腎絲球 發炎、便秘、口臭、糖尿病及共併發症、風溼性關節炎、癌症、化療副作用手術、器官移植、肝 炎、更年期、衰老病（aging,老化）等。
[0126] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發 明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，例如Sambrook等，分子克隆實驗指南（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989);ProteinPurification(Jan-ChristerJanson等，JohnWiley&Sons，1998)中 所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0127] 實施例
[0128] 實施例1.rcSOD大腸桿菌表達載體的構建：
[0129] 分泌肽段基因參考大腸桿菌K12菌株分泌蛋白和SEQIDN0:2(圖2)所示膜蛋白 信號肽設計，並全基因合成的，其序列如SEQIDN0:1所示的DNA片段（圖1)。其中用於 編碼本發明信號肽的核苷酸序列與其演繹的本發明信號肽的胺基酸序列見圖7。同時在其 5'端引入Ndel酶切位點。如SEQIDNO:4所示天然冬蟲夏草超氧化物歧化酶的胺基酸序 列（圖4)和SEQIDNO:3所示核苷酸序列（圖3)是已知的，如NCBI的Genbank登陸號分 別為AY195841. 1和AA040743. 1，目的基因的獲得是根據天然冬蟲夏草超氧化物歧化酶的 胺基酸序列，用常規基因合成法，在冬蟲夏草超氧化物歧化酶的胺基酸序列的5'端引入分 泌肽段基因，並在冬蟲夏草超氧化物歧化酶的胺基酸序列的3'端引入Xhol酶切位點，該 基因SEQIDNO:5編碼分泌肽-冬蟲夏草超氧化物歧化酶胺基酸序列如SEQIDNO:6所示 (圖5和圖6)。用於編碼本發明融和表達的重組冬蟲夏草SOD的核苷酸序列及其演繹的本 發明融和表達的重組冬蟲夏草SOD的氣基酸序列對應關係見圖8。
[0130] 表達質粒pET-rcSOD的構建及高表達工程細胞的獲得構建過程如圖9所示。 合成的分泌肽-超氧化物歧化酶全基因用Ndel+Xhol內切酶（來源於NEBBiolab)酶 切，同時將載體pET22b用相同的Ndel+Xhol進行酶切，然後用NEBTAKARADNA連接酶 (solutionl,TAKARA，中國大連）連接入pET22b載體中，得到pET-rcSOD,測序證實DNA序 列正確無誤。然後，將pET-rcSOD質粒，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在37°C條件下，用 IPTG誘導4小時後確定表達冬蟲夏草超氧化物歧化酶（圖10)。
[0131] 實施例2溫度對rcSOD表達水平的影響
[0132] 取單克隆，接種到LB-級種子液中，培養17-20hr;取3隻50mL培養管，按1 : 50 的比例分別接種於三隻5mL培養基的50mL培養管中，培養4hr左右，ImM/LIPTG誘導，誘導 溫度分別為16 °C、25 °C、37 °C，收集菌體，用溶菌酶在37 °C條件下，處理2小時，15000rpm離 心10分鐘，取上清，SDS-PAGE檢測表達情況。實驗結果表明，在搖瓶中表達rcSOD在16°C、 25°C都幾乎差不多，然而37°C表達分泌蛋白相對較少（圖11)。
[0133] 實施例3IPTG濃度對rcSOD表達水平的影響
[0134] 取單克隆，接種到LB-級種子液中，培養17_20hr;按1 : 50的比例分別接種於 5隻裝有5mL培養基的50mL培養管中，37°C培養4hr左右，冷卻到20°C，分別加入IPTG， 使培養基中濃度為〇. 6mM、0. 4mM、0. 2mM、0.ImM誘導，收集菌體，用溶菌酶在37°C條件下，處 理2小時，15000rpm離心10分鐘，取上清，SDS-PAGE檢測表達情況。實驗結果表明，幾個梯 度濃度IPTG誘導rcSOD表達量差不多，用0.ImM的IPTG濃度誘導比較經濟，節約成本（圖 12)。
[0135] 實施例4誘導時間對rcSOD表達水平的影響。取單克隆，接種到LB-級種子液 中，培養5hr;按1 : 50的比例分別接種於5隻裝有5mL培養基的50mL培養管中，37°C培 養4hr左右，冷卻到25°C，分別加入0.ImM濃度的IPTG，分別誘導8、10、16、18、20、30小時， 收集菌體，用溶菌酶在37°C條件下，處理2小時，15000rpm離心10分鐘，取上清，SDS-PAGE 檢測表達情況。實驗結果表明，誘導20小時產量最高（圖13)。
[0136] 實施例5中試發酵條件選擇及優化NBSBioFlo3000發酵罐（6. 5L)經過上述優 化後，rcSOD表達量約為300mg/L發酵液，表達量明顯增加（圖14)。
[0137] 實施例6中rcSOD純化實施例4的發酵物4°C下5000rpm離心10分鐘，收集菌體， 用溶菌酶溶解菌體，溶解酶使用量為lmg/g菌體，37°C溫浴2小時。離15000rpm離心去除 菌體，收集澄清液。使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為10KD，超濾時留取回流液。 上清超濾至體積剩下500ml左右，加入以10mM磷酸鹽緩衝液（PB，pH7. 4)，繼續超濾；反覆 此程序，直至樣品的電導水平和lOmMPB(pH7. 4)緩衝液的電導水平接近。
[0138] 陰離子交換層析：層析介質：QSepharoseF.F. (Phamarcia)緩衝液：溶液A:10mM PBS(pH7. 4)，溶液B:10mMPB+1MNaCl(pH7. 4)上樣：將超濾濃縮的rcSOD溶液（1L左右， 電導為4000uS/cm左右）上樣清洗：上樣後用6CV(柱體積，下同）的溶液A清洗層析柱梯 度：清洗後直接用30%溶液B洗脫目標蛋白收集：收集30%B洗脫下的蛋白層析。
[0139]疏水層析：phenyl-sepharose(Phamarcia)緩衝液：溶液A: 10mMPBS(pH7. 4)，溶 液C:10mMPB+3MNaCl(pH7. 4)上樣：將層析1得到的樣品加入固體NaCl至3. 0M，上樣梯 度：1〇〇%A直接清洗收集：收集100%A洗下的目的蛋白樣品經過此2步層析，即陰離子交 換層析、疏水層析以後，純度提高至95% (圖15和圖16)、得率在50%以上的rcSOD純品， 純品得率200mg/L培養物。
[0140] S0D的活力測定方法
[0141] 改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行，較為實用。化學發光法和光化學擴增法不適 用於測定Mn-S0D，但對於Cu/Zn-S0D反應極靈敏。Cyte還原法用於Mn-S0D活力測定結果 穩定，重複性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊儀器，實際應用受到限制。亞 硝酸鹽形成法與CN-抑制劑或SDS處理相結合，應用於Mn-S0D測定，靈敏度比Cyte還原法 提高數倍，而且專一性強，重複性好，操作方便，不需要特殊儀器和設備，易於實際應用和推 廣，是目前較好的測定方法之一。通常情況下，S0D酶活性測定只能應用間接活性測定法。 根據S0D國家標準，本公司採用改良Marklund法，即鄰苯三酚自氧化方法。
[0142] 1定義：25°C時抑制鄰苯三酚自氧話速率50%時所需要的S0D量為一個活力單位。
[0143] 2原理：在鹼性條件下，鄰苯三酚會發生自氧化，可根據S0D抑制鄰苯三酚自氧化 能力測定S0D活力。
[0144] 3試劑：A液：pH8.200.lmol/L三槍甲基氨基甲烷（Tris)-鹽酸緩衝液（內含 lmmol/LEDTA. 2Na)。稱取 1. 214gTris和 37. 2mgEDTA. 2Na溶於62. 4mL0.lmol/L鹽酸溶液 中，用蒸饋水定容至l〇〇m；LB液：4. 5mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液。稱取鄰苯三酚（A.R)56. 7mg 溶於少量10mm〇l/L鹽酸溶於，並定容至100mL。
[0145] 4儀器：紫外-可見分光光度計，機密酸度計，精確度0.OlpH，離心機，10mL比色 皿，10mL離心管，玻璃乳缽。
[0146] 5樣品的製備：
[0147] 6分析步驟：鄰苯三酚自氧化速率測定，在25°C左右，於10mL比色皿中一次加入A 液2. 35mL，蒸餾水2mL，B液0. 15mL。加入B液立即混合併傾入比色皿，分別測定在325波 長條件下初始和lmin後吸光值，二者之差即鄰苯三酚自氧化速率AA^OnirT1).本試驗確 定AAmOnirT1)為0. 060。S0D活性測定加樣程序表如下：
[0148]

【權利要求】
1. 一種重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶，其特徵在於，所述冬蟲夏草超氧化物歧化酶包 含任一如下胺基酸序列： a) SEQ ID NO. 2所示胺基酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 4所示胺基酸序列；或 c) SEQ ID NO. 6所示胺基酸序列。
2. 分離的核酸分子，其特徵在於，所述分離的核酸分子包含任一如下核苷酸序列： a) 編碼SEQ ID NO:2的胺基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 編碼SEQ ID N0:4的胺基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 編碼SEQ ID N0:6的胺基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
3. -種重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶，其特徵在於，所述冬蟲夏草超氧化物歧化酶通 過表達任一以下所示的核苷酸序列而獲得： a) 編碼SEQ ID NO:2的胺基酸序列的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) 編碼SEQ ID N0:4的胺基酸序列的SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) 編碼SEQ ID N0:6的胺基酸序列的SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
4. 一種表達載體，其特徵在於，所述表達載體含有任一如下核苷酸序列： a) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；或 c) SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
5. 如權利要求4所述的表達載體，其特徵在於，所述表達載體為pET22b。
6. -種工程細胞，其特徵在於，所述工程細胞是通過轉化權利要求4所述的表達載體 進入宿主細胞後獲得的細菌細胞。
7. 如權利要求5所述的工程細胞，其特徵在於，所述工程細胞為大腸桿菌BL21(ED3)細 胞。
8. -種製備重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶的方法，其特徵在於，所述方法包括： a) 將權利要求3所述的任一核苷酸序列克隆入表達載體pET22b的步驟； b) 將所述表達載體pET22b轉入到宿主細胞大腸桿菌BL21 (ED3)細胞的步驟； c) 將宿主細胞大腸桿菌BL21(ED3)細胞進行培養步驟，培養條件包括：培養分為培養 階段和誘導階段，培養階段培養菌液濃度達到0D600,誘導時間為18-21hr，發酵及誘導溫 度保持在16-25°C，誘導期IPTG濃度在0. 1-0. 2mM/L ; d) 分離純化出融核表達的重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶的步驟，對發酵樣品通過離心 和/或過濾方式收集菌體，用溶菌酶lmg/g菌體，在37°C條件下，處理2小時，再通過離心獲 得清液； e) 通過鹽析和/或超濾進行初步純化步驟，所述鹽析為用0-60 %中性硫酸銨分級粗提 蛋白，超濾用超濾膜進行過濾，所述超濾膜為截留分子量為10KD的超濾膜； f) 通過陰離子交換、疏水層析方法，從而獲得純度達到95-99. 9%的重組冬蟲夏草超 氧化物歧化酶的步驟。
9. 重組冬蟲夏草超氧化物歧化酶在製備治療與人超氧化物歧化酶相關疾病或病理症 狀的藥物、食品、保健品及其化妝品中的用途。
10. 如權利要求8所述的方法或權利要求10所述的用途，其特徵在於，所述重組冬蟲夏 草超氧化物歧化酶含有任一如下胺基酸序列： a) SEQ ID NO. 2所示胺基酸序列；和/或 b) SEQ ID NO. 4所示胺基酸序列；或 c) SEQ ID NO. 6所示胺基酸序列。
【文檔編號】C12N15/70GK104342408SQ201410535820
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月12日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】劉爽, 鄧小霞, 孫曉悅, 龐玉, 王子華 申請人:吉林省金梓源生物科技有限公司