高通量檢測脊椎動物病原體基因晶片的探針設計方法

2023-06-16 03:17:11 1

專利名稱：高通量檢測脊椎動物病原體基因晶片的探針設計方法
技術領域：
本發明涉及生物晶片探針的一種設計方法。尤其是基於此方法設計得到的探針用來對以脊椎動物為宿主的病毒、細菌、真菌、原生動物進行高通量檢測，本發明對不同類型的病原體分別採用了有針對性的設計流程。
背景技術：
傳染病是由各種病原體引起的能在人與人、動物與動物或人與動物之間相互傳播的一類疾病。每種傳染病都有其特異的病原體，包括病毒、細菌、真菌、原蟲、螺旋體、立克茨體等。傳染病與其他種類疾病相比，具有發病強度高、傳播速度快、波及範圍廣、地域性和季節性強等特點，傳染病產生的危害性極大，不但患者死亡率高，而且容易導致社會恐慌心理，產生的次級危害往往更大，直接影響社會的經濟活動和人的正常生活秩序。雖然傳染病理論上分為人與人、動物與動物或人與動物專有傳染病，但是許多傳染性疾病，甚至包括流行病，都起於人畜共通的特性，要區分哪些疾病從感染動物逐步演化成可以感染人類並不簡單，但有證據顯示麻疹、天花、流行性感冒、白喉等皆是如此。而愛滋病、感冒和結核也都來自人類以外的物種。人畜通病在國際間引起密切關注，因為它們通常是過去未被發現的疾病，或是毒力在演化過程中增強，或偶然傳入不具對抗該疾病之免疫力的族群或物種。因此，對以脊椎動物為宿主的病原體進行系統地監測，是有效進行傳染病防控的一個必要環節。在傳染病爆發過程中，人類由以前被動承受，到治療控制，再到提前預防控制，積累了大量和傳染病做鬥爭的技術經驗。特別是隨著現代醫學和分子生物學技術發展，人類已經建立起了多種具體傳染病檢測方法，I)微生物培養法；2)血清學標記物檢測法；3)血液或分泌物中所含病毒和病原相關蛋白質檢測，其中包括ELISA、膠體金等方法；4)通過傳染源核酸序列，進行特異性的螢光定量PCR檢測法；5)快速發展的生物晶片微陣列高通量方法。微生物培養法由於直觀方便等特點，還是最主要的傳染病診斷工具，但有些傳染原如病毒和鉤端螺旋體無法進行人工培養，就只能藉助其他診斷工具；血清學標記物檢測法，也是通過病原體感染機體後產生的特異性抗體進行檢測，通行的抗體檢測由於存在「血清學窗口期」，只能在感染2-4周後才能確診，而且該方法還需要和微生物培養法相互引證；基於血液或分泌物的病原蛋白質檢測，如ELISA和膠體金法也是對血清學檢測方法的改進，也同樣存在以上弊端；新近湧現的針對病原體的RNA或DNA的螢光定量PCR檢測方法，有靈敏性高，準確率高，能夠有效縮短「病原窗口期」等特點。但該檢測方法也只能針對已知病原體設計特異的PCR引物和探針，不能實現高通量檢驗檢測，不能滿足新發與突發性傳染病的快速、準確、靈敏的診斷需求，是重大傳染性疾病的防疫防控與及時救治的主要技術瓶頸之一。生物晶片方法，在考慮了傳統和現有傳染病檢測方法的局限性基礎之上，結合現代分子生物學高通量技術優勢，而建立起來的傳染病病原體診斷檢測方法。該方法主要技術優點包括:1)高通量。一張晶片上的一個點陣可以對一份樣本同時分析成千上萬種的病原體，而一張晶片上有可以同時分析數十個臨床樣本；2)快速、準確和靈敏。單次檢測I天即可完成，加之高通量特異性，檢測效力明顯優於現有的其他方法；由於檢測過程中採用全封閉的螢光自動化檢測系統，集合特異性探針，檢測準確度高、靈敏度好；3)可檢測未知病原體。現有病原體檢測方法，只能對已知病原體進行確認，對於未知病原體檢測則無能為力，例如螢光定量PCR方法，有很多技術優勢，但前提必須知道被檢病原體核酸序列，否則將無法檢測。而生物晶片檢測系統，由於探針設計本身就具有兼容性，檢測序列發生突變將不會影響雜交檢測。大部分病原體新品種其實都是已知病原體在藥物和環境壓力下的突變體，序列具有很高同源性。由於生物晶片檢測技術本身技術優點和臨床應用的潛在價值，使得國內外眾多科技專家專注於生物晶片檢測技術在傳染病學中的研究。例如，美國加州大學舊金山分校DeRisi實驗室研發的能檢測多種病毒的Virochip晶片，美國哥倫比亞大學Lipkin實驗室研發的能同時檢測多種病毒、細菌、真菌和寄生蟲的GreeneChip晶片等。生物晶片探針設計的目的在於:經過計算方法優化後的探針能夠在檢測到更多的生物分子的同時，保證有較高的檢測可靠性，即同時兼顧覆蓋率和準確率兩個方面，對於高通量的病原體檢測這一點是至關重要的。通常的做法是首先查詢如EMBL和GenBank等國際公共資料庫，取得相應的DNA序列數據作為生物晶片探針設計的參照目標序列，然後從中選擇特異性很高的核苷酸片段來設計探針。特異性是指目標物種和非目標物種間的存在的差異，是檢測型生物晶片鑑別物種的核心依據。特異性探針的選擇是探針設計過程中的關鍵環節，探針優化設計算法研究已成為檢測型基因晶片信息處理中一個急需解決的問題。對於小規模物種的鑑別，主要是通過序列比對的結果依靠人工分析選擇，但是隨著對單個晶片檢測物種數量需求的快速增加，待分析的序列越來越多，再加上探針設計還要考慮很多其他方面的複雜因素，人工設計不僅費時費力，而且質量難以保證，因此計算方法在探針設計方面得到了廣泛的應用。Waibhav提出了一套從病原體全基因組序列出發的探針設計流程，Satya在此流程基礎之上又進行了改進，除了有效地減少了計算時間以外，還使用了多套度量探針專一性的判據對探針質量進行了理論評估。Jabado等人進行了針對於病毒檢測晶片的探針設計工作，他們認為在序列保守性分析方面，使用蛋白質-蛋白質比對相較於核酸序列之間的比對更有優勢，因此他們提出了基於一套從病毒蛋白質序列出發的探針設計流程。為了兼顧對探針高覆蓋率的要求，還補充了一些以非編碼區域為模板設計出來的探針。綜上所述，目前的生物晶片探針設計方法，更加科學、合理，所設計出的探針有著比較好的覆蓋率和準確率，能夠滿足高通量檢測的需求。但是這些設計方法也存在著兩方面的主要不足:1)計算耗時，設計效率較低。以Satya等人的TOF1-beta流程為例，在74個CPU上設計一個物種Brucella melitensis的檢測探針,就需要21個小時；2)很多的探針設計流程，由於序列資源的限制，只能在屬的層次上得到滿足條件檢測探針，難以做到更加精細的檢測。隨著序列資源的不斷豐富，檢測種或者亞種層次上的病原體都將成為可能，而現有的設計流程都缺少一個動態的數據管理更新系統，不能做到與快速增長的序列資料庫做到同步更新
發明內容
生物晶片是在現代分子生物學高通量技術的基礎之上，建立起來的可用於病原體診斷檢測方法。隨著序列資源的不斷豐富，檢測屬、種甚至於亞種層次上的病原體都將成為可能，各大醫療和公共衛生機構對單個晶片檢測物種數量需求也相應地在快速增加。傳統的探針設計方法主要集中於對小規模物種的鑑別，主要是通過序列比對的結果依靠人工分析選擇，設計效率較低，且質量不高。本發明在整合了國際上最先進的探針設計方法的基礎之上，進行了有針對性的改進。對於細菌、病毒、真菌等不同類型的病原體，採用了不同的序列模板進行探針設計。在設計流程中，充分考慮了病原體序列的情況，儘量在從屬到種再到亞種，越來越精細的層次上設計檢測探針。同時兼顧了探針的覆蓋率和準確率，這對於高通量的病原體檢測是非常重要的。


圖1是針對檢測對象為細菌、真菌以及原生動物三類病原體的，以rRNA為模板的探針設計流程。圖2是針對檢測對象為病毒，以結構蛋白編碼序列為模板的探針設計流程。圖3為細菌Brevibacterium epidermidis中四條序列進行多序列比對後的片段圖4是從進化樹的分支上尋找細菌Brevibacterium epidermidis最近鄰菌種的示意圖
具體實施例方式下面結合具體的實例及附圖對本方法作進一步說明。一、針對細菌、真菌以及原生動物的以rRNA為模板的設計流程我們將細菌Brevibacterium epidermidis作為目標物種，並以它為例介紹圖1所示的探針設計流程。首先,從Ribosomal Database Project (RDP)資料庫裡得到目標物種的16S rRNA序列。根據這些16S rRNA序列，進行序列比對，從GenBank中抽提出該物種更多的16S rRNA序列，同時對序列的種屬描述信息進行校正，確保為目標物種的16S rRNA序列。對目標物種的多條16SrRNA進行多序列比對，抽提出種內保守的序列區域。圖3所示為其中的一段保守序列片段。通過系統發生分析，對所研究額全部細菌菌種的代表性序列構建進化樹，從進化樹的分支中可以找到目標物種的最近鄰物種，如圖4所示，細菌Brevibacteriumepidermidis的最近鄰菌種為Kineosporia aurantiaca。將兩個菌種進行序列比對，得到種間的保守區。從Brevibacterium epidermidis的種內保守區域中去除這部分種間保守區，即得到了目標菌種的特異性區域，作為備選序列進行下一步的探針設計。根據如下的幾類實驗條件，包括探針長度為60mer，所有探針的理論融解溫度在2度內波動，GC含量在30% -70%的範圍內等等，從備選序列中抽提出滿足條件的備選探針集合。構建將脊椎動物序列和相應的病原體序列整合到一起的非目標物種序列庫，通過Blastn對備選探針進行同源性檢測。我們設置的特異性標準是備選探針對於非目標物種基因的連續互補片段長度小於15bp，總的互補長度應小於75%。通過篩選，去除掉可能與非目標物種序列產生交叉雜交的結果，得到高專一性的探針。
二、針對病毒以蛋白質編碼序列為模板的設計流程圖2所示的探針設計流程為針對病毒的，並以蛋白質編碼序列為模板的設計流程。首先，從European Molecular Biology Laboratory(EMBL)資料庫中下載病毒序列標準文件。從中抽提整理屬於目標病毒的序列，根據序列文件提供的信息，進一步抽提出編碼結構蛋白的核酸序列以及所編碼的蛋白質序列。將這些蛋白質序列與Pfam proteinfamilies database中的種子序列進行比對，得到保守的序列區域，將其對應的核酸編碼區作為下一步設計的備選序列。對於那些不能夠通過與Pfam資料庫比對得到保守區的序列，直接將它們的核酸編碼區進行序列比對、聚類，得到保守區域，作為備選序列的另一個來源。從備選序列出發設計探針的步驟與以rRNA為模板的設計流程中後面的步驟是是一致的。
權利要求
1.一種針對細菌、真菌以及原生動物三類病原體的探針，其特徵是一種基於16SrRNA或18S rRNA序列模板的設計方法為基礎的探針，包括:從RibosomalDatabaseProject(RDP)資料庫裡得到目標物種的rRNA序列，抽提出物種內部的保守的序列區域； (1)通過系統發生分析，對多個物種的代表性序列構建進化樹，從進化樹的分支中找到目標物種的最近鄰物種； (2)將兩個物種進行序列比對得到種間的保守區； (3)從目標物種的種內保守區域中去除這部分種間保守區，得到目標物種的特異性區域，作為備選序列； (4)針對該備選序列進行探針設計，對得到的備選探針進行特異性評估，去除那些可能產生交叉雜交的低質量探針。
2.一種針對病毒的探針，其特徵是一種基於結構蛋白編碼序列的設計方法為基礎的探針，通過蛋白-蛋白比對獲取保守區域的信息，包括: (1)從EMBL資料庫中下載病毒序列標準文件，從中抽提出編碼結構蛋白的核酸序列以及相應的蛋白質序列； (2)將這些蛋白質序列與Pfam資料庫中的種子序列進行比對，得到保守的序列區域，將與其對應的核酸編碼區作為下一步設計的備選序列； (3)按照權利要求1中所述的步驟(4)，進行後續的探針設計。
全文摘要
本發明涉及一種生物晶片的探針設計方法，尤其是設計出用於對以脊椎動物為宿主的病毒、細菌、真菌等病原體進行高通量檢測的探針。本發明提供的方法，包括1)針對檢測對象為細菌、真菌以及原生動物三類病原體的，以rRNA為模板的探針設計方法；2)針對檢測對象為病毒，以結構蛋白編碼序列為模板的探針設計方法。
文檔編號G06F19/20GK103093120SQ20111034875
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者張鑫磊, 蔣小雲, 肖琛 申請人:北京健數通生物計算技術有限公司