一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑及其製備方法

2023-06-15 06:28:46 1

一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑及其製備方法
【專利摘要】一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，是將功能微生物的二級菌種接種於雙黃連組方發酵液中，利用功能微生物的生命活動，在常溫、常壓下進行液體深層高密度發酵，將雙黃連組方中有效成分充分有效地溶出和轉化，而製成的雙黃連口服液生物製劑。本發明同時也提供了該獸用雙黃連口服液製劑的製備方法。本發明篩選了雙黃連組方作為中藥組方，並利用功能微生物-嗜酸乳桿菌、產朊假絲酵母將雙黃連組方中所含的抗菌、抗病毒及解熱的活性成分最大限度地提取出來,增強了療效，同時，嗜酸乳桿菌、產朊假絲酵母能起到維護和調整動物胃腸道菌群平衡的作用。
【專利說明】一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑及其製備方 法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及獸用中藥製劑，具體涉及一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液制 齊IJ，同時涉及製備方法。

【背景技術】
[0002] 中草藥飼料添加劑是指根據我國傳統的中醫理論，而在飼料中加入的一些具有益 氣健脾、消食開胃、補氣養血的天然中草藥。能夠促進動物生長發育，提高生產性能，增強機 體免疫機能，提高動物抗應激、抗疾病能力，且具有無殘留、不易產生耐藥性和毒副作用。
[0003] 雙黃連為純中藥製劑，由黃芩、金銀花、連翹三味中藥組方而成，方中金銀花性甘 寒，芳香疏散，善清肺經熱邪，為君藥；黃芩性苦寒，善清肺火及上焦之的實熱；連翹性苦 微寒，疏散上焦風熱，並有清熱解毒功效，為臣藥。三藥共用，共奏辛涼解表、清熱解毒 之功效。雙黃連製劑己被廣泛應用於獸醫臨床上如犬、豬、雞、羊治療各種細菌性、病毒性疾 病及感冒發熱等，均取得了明顯的療效。連翹苷和黃芩苷作為其主要有效成分之一。
[0004] 黃芩中抗病毒的活性成分主要是黃酮苷元。金銀花、連翹中含有大量的揮髮油，對 抗病毒有很好的療效，但是三味中藥的提取工藝都是沿用原地方標準的水煮液再沉澱的方 法，造成大量揮發性成分以及熱不穩定成分的損失。
[0005] 中藥苷類成分因其重要的生理活性越來越受到重視。苷，又稱配糖體，是由糖或 糖的衍生物的半縮醛羥基與另一非糖物質中的羥基以縮醛鍵脫水縮合而成的環狀縮醛衍 生物，水解後能生成糖與非糖化合物，非糖部分稱為苷元，苷類藥物的藥效是由苷元決定 的。
[0006] 苷類成分在腸道內難以吸收、生物利用度低、腸內滯留時間較長，在動物體內難 以直接發揮藥效作用，因此絕大多數需經腸道微生物分解為苷元而發揮療效。
[0007] 微生物有著非常強大的分解轉化物質的能力，並能產生豐富的次生代謝產物。微 生物能在常溫、常壓等較為溫和的條件下進行苷的轉化，可以比一般的物理或化學的炮製 手段更大幅度地改變藥性，能最大限度保護中藥化學成分免遭破壞。同時，有利於環境的保 護，降低生產成本。在發酵過程中，植物組織內大多數有效成分也充分有效地溶出和轉 化，大幅度提1? 了其含量。
[0008] 但是，現在抗生素的濫用已經嚴重損害了動物體內的正常腸道菌群，使腸道菌群 失去平衡，不能正常分泌糖苷酶。因此，不能有效地對攝入體內的糖苷進行分解代謝，導 致雙黃連製劑中主要有效成分苷類物質的難以有效吸收，最終達不到其應有的療效。
[0009] 目前也有不少採用微生物對動物的飼料進行處理的文獻。例如，專利號為 200810151212. 4、專利名稱為"雙黃連口服液的中藥生物製劑及其製備方法"的中國專利 中，公開了"將EM原露接種到雙黃連口服液中，在10_30°C和光照條件下發酵1-5個月，進 而對藥液進行分離，提取，精製，滅菌，製成各種劑型"。其中，EM原露包含芽孢桿菌、乳酸杆 菌、酵母菌、光和細菌。但是，這種方法的缺陷在於：採用的發酵條件與動物消化系統的環境 相差較大，因此，而且EM原露內含有的微生物隨試劑進入動物消化系統後，會對其自身的 發酵環境帶來影響。還有專利申請號為200810230649. 7、專利名稱為"用多菌種發酵生產畜 禽用微生態中藥製劑及發酵方法"，以及專利申請號為200610069628. 2、專利名稱為"飼用 酵解中草藥製劑的製備方法"的中國專利，也均涉及到了利用微生物對獸用的中藥製劑進 行發酵。但是，這兩種方法主要是針對獸用的中藥製劑進行，其中的中藥製劑含有多味中草 藥，但是，本領域的技術人員應該知曉，像上述兩種中藥製劑，一方面是成本極高，另一方面 微生物在發酵時，除了產生某些有益成分，同時也會產生一些不利於動物自身消化系統的 成分，例如決明子中就主要含有大黃酚、大黃素等化合物，長期服用可引起腸道病變；同時， 以上兩種方法都是利用一級微生物菌種對中藥材進行發酵後直接飼養動物，一級微生物菌 種對動物消化系統自身菌落的破壞力極強，很容易導致動物消化系統自身菌群失衡。
[0010] 因此，很有必要從中藥材、菌種的篩選、菌種的培養方面入手，創造性的開發一種 在保持並增強原有雙黃連口服液藥效的基礎上兼有維護和調整動物胃腸道菌群平衡作用 的方法，以解決傳統方法的缺陷。


【發明內容】

[0011] 本發明所要解決的技術問題是提供一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液制 劑及其製備方法，其在保持並增強原有雙黃連口服液藥效的基礎上兼有維護和調整動物胃 腸道菌群平衡的作用，從而消除上述【背景技術】中缺陷。
[0012] 為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
[0013] 一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，是將功能微生物的二級菌種接種 於雙黃連組方發酵液中，利用功能微生物的生命活動，在常溫、常壓下進行液體深層高密度 發酵，將雙黃連組方中有效成分充分有效地溶出和轉化，而製成的雙黃連口服液生物製劑。
[0014] 作為一種優選的技術方案，所述雙黃連組方由重量比為（1-2) : (1-2) : (2-4)的黃 芩、金銀花、連翹組成。
[0015] 作為一種更優選的技術方案，所述雙黃連組方由重量比為1:1:2的黃芩、金銀花、 連翹組成。
[0016] 作為一種優選的技術方案，所述每IOOOml雙黃連組方發酵液中含有黃苳25g、金 銀花25g、連翹50g。
[0017] 作為一種優選的技術方案，所述功能微生物是嗜酸乳桿菌ACCC00160和產朊假絲 酵母ACCC20060,均來源於中國農業微生物菌種保藏中心。
[0018] 以下提及的嗜酸乳桿菌和產朊假絲酵母均優選上述兩種。
[0019] 所述獸用雙黃連口服液製劑的製備方法，包括如下步驟：
[0020] (1)雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按雙黃連組方重量比混合均勻，粉碎 過篩；
[0021] (2)嗜酸乳桿菌一級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基高溫高壓滅菌；冷 卻後在無菌條件下接種嗜酸乳桿菌菌種，於搖床中培養，即得嗜酸乳桿菌一級菌種；
[0022] (3)產朊假絲酵母一級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基高溫高壓滅 菌；冷卻至後在無菌條件下接種產朊假絲酵母菌種，於搖床中培養，即得產朊假絲酵母一級 菌種；
[0023] (4)嗜酸乳桿菌二級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基高溫高壓滅菌；冷 卻後在無菌條件下接種步驟（2)得到的嗜酸乳桿菌一級菌種，於搖床中培養，即得嗜酸乳 桿菌二級菌種；
[0024] (5)產朊假絲酵母二級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基高溫高壓滅 菌；冷卻至後在無菌條件下接種步驟（3)得到的產朊假絲酵母一級菌種，於搖床中培養，即 得產朊假絲酵母二級菌種；
[0025] (6)益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：向步驟（1)製備的雙黃連中 藥粉中注入過濾除菌後的潔淨溫水，製成雙黃連組方發酵液，並向所述雙黃連組方發酵液 中分別接種步驟（4)製備的嗜酸乳桿菌二級菌種和步驟（5)製備的產朊假絲酵母二級菌 種，培養後，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑。
[0026] 作為一種優選的技術方案，所述獸用雙黃連口服液製劑的製備方法，詳細步驟如 下：
[0027] (1)雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按重量比（1-2) : (1-2) : (2-4)混合均 勻，粉碎過40-80目篩；
[0028] (2)嗜酸乳桿菌一級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 120-125°C、7. 84-8. 8MPa滅菌15-25min，冷卻至35-45°C後無菌條件下接種篩選的嗜酸乳 桿菌試管菌種，於搖床在35_45°C、100-120r/min的條件下培養45_52h，即得嗜酸乳桿菌一 級菌種；
[0029] (3)產朊假絲酵母一級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中， 並在120-125°C、7. 84-8. 8MPa下滅菌15-25min，冷卻至25-35°C後無菌條件下接種篩選的 產朊假絲酵母試管菌種，於搖床在25-33°C、100-120r/min的條件下，培養45-53h，即得產 朊假絲酵母一級菌種；
[0030] (4)嗜酸乳桿菌二級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 120-125°C、7. 84-8. 8MPa滅菌15-25min，冷卻至40-50°C後無菌條件下接種步驟（2)得到的 嗜酸乳桿菌一級菌種，於搖床在35-45°C、100_120r/min的條件下培養35-37h，即得嗜酸乳 桿菌二級菌種；
[0031] (5)產朊假絲酵母二級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中， 並在120-125°C、7. 84-8. 8MPa滅菌15-25min，冷卻至28-32°C後無菌條件下接種步驟（3) 得到的產朊假絲酵母一級菌種，於搖床在28-30°C、100_120r/min的條件下培養35-37h，即 得產朊假絲酵母二級菌種；
[0032] (6)益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：向步驟（1)製備的雙黃連中 藥粉中注入過濾除菌後的潔淨溫水，製成雙黃連組方發酵液，保證每IOOOml雙黃連組方 發酵液中含有黃芩25g、金銀花25g、連翹50g，並向所述雙黃連組方發酵液中分別接種步 驟（4)製備的嗜酸乳桿菌二級菌種和步驟（5)製備的產朊假絲酵母二級菌種，保證雙黃連 組方發酵液、嗜酸乳桿菌二級菌種和產朊假絲酵母二級菌種的體積比為（33-30) :1:1，在 32-38°C下培養100-150天，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，再將得到的 獸用雙黃連口服液製劑過濾後灌裝。
[0033] 上述製備方法，作為一種優選的技術方案，所述嗜酸乳桿菌液體菌種培養基中，含 雙黃連中藥粉l〇_15g/L、檸檬酸二銨l-3g/L、磷酸氫二鉀l-3g/L、T Ween801-3g/L、三水乙 酸鈉 3-8g/L。
[0034] 上述製備方法，作為一種優選的技術方案，所述產朊假絲酵母液體菌種培養基中， 含雙黃連中藥粉3-5g/L、玉米粉2-4g/L、磷酸氫二鉀l-3g/L、硫酸鎂1-1. 5g/L。
[0035] 作為一種更優選的技術方案，所述獸用雙黃連口服液製劑的製備方法，詳細步驟 如下：
[0036] (1)雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按重量比1:1:2混合均勻，粉碎過60 目篩；
[0037] (2)嗜酸乳桿菌液體菌種培養基：雙黃連中藥粉10g/L、檸檬酸二銨2g/L、磷酸氫 二鉀 2g/L、Tween80 2g/L、三水乙酸鈉 5g/L;
[0038] (3)嗜酸乳桿菌一級菌種製備：500ml三角瓶裝入嗜酸乳桿菌液體菌種培養基 300ml，121°C 8. OMPa滅菌20min ;冷卻至40°C後無菌條件下接種篩選保存的嗜酸乳桿菌試 管菌種，於搖床40°C、llOr/min培養48h，即得嗜酸乳桿菌一級菌種；
[0039] (4)產朊假絲酵母液體菌種培養基：雙黃連中藥粉4g/L、玉米粉3g/L、磷酸氫二鉀 2g/L、硫酸鎂 lg/L ;
[0040] (5)產朊假絲酵母一級菌種製備：500ml三角瓶裝入產朊假絲酵母液體菌種培養 基300ml，121°C 8. OMPa滅菌20min ;冷卻至30°C後無菌條件下接種篩選保存的產朊假絲酵 母試管菌種，於搖床29°C、110r/min培養48h即得產朊假絲酵母一級菌種；
[0041] (6)嗜酸乳桿菌二級菌種製備：500ml三角瓶裝入嗜酸乳桿菌液體菌種培養基 300ml，121 °C 8. OMPa滅菌20min ;冷卻至45°C後無菌條件下接種步驟（3)得到的嗜酸乳杆 菌一級菌種，於搖床40°C，llOr/min，培養36h，即得嗜酸乳桿菌二級菌種；
[0042] (7)產朊假絲酵母二級菌種製備：500ml三角瓶裝入產朊假絲酵母液體菌種培養 基300ml，121 °C 8. OMPa滅菌20min ;冷卻至30°C後無菌條件下接種步驟（5)得到的產朊假 絲酵母一級菌種，於搖床29°C，110r/min，培養36h即得產朊假絲酵母二級菌種；
[0043] (8)益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：1000L全自動液體發酵罐中 加入步驟（1)製備的雙黃連中藥粉，注入940L過濾除菌後的潔淨溫水，保證每IOOOml雙 黃連組方發酵液中含有黃芩25g、金銀花25g、連翹50g，然後分別接種嗜酸乳桿菌二級菌種 30L、產朊假絲酵母二級菌種30L，35°C培養120天，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口 服液製劑；
[0044] (9)將得到的獸用雙黃連口服液製劑過濾後灌裝，得到每ml液體含以下成分分別 不低於：黃芩苷6. 72mg、黃芩素0· 82mg、漢黃芩素0· 56mg、連翹苷0· 27mg、綠原酸0· 69mg的 獸用雙黃連口服液製劑。
[0045] 本發明中，採用的中藥組方為雙黃連組方，其中，
[0046] 金銀花中含有忍冬花含綠原酸、異綠原酸、白果醇、β_谷甾醇、豆甾醇、β_谷甾 醇-D-葡萄糖甙、豆留醇-D-葡萄糖甙等成分，主要的藥理作用如下：1.抗病原微生物作 用：體外實驗表明，花和藤對多種致病菌如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌、痢疾 桿菌、霍亂弧菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌等均有一定抑制作用，對肺炎球菌、腦膜炎雙球菌、 綠膿桿菌，結核桿菌亦有效。水浸劑比煎劑作用強，葉煎劑比花煎劑作用強。若和連翹合用， 抗菌範圍還可互補；與青黴素合用，能加強青黴素對耐藥金黃色葡萄球菌的抗菌作用，這可 能是在抑制細菌體內蛋白質合成上有協同的作用。有人認為綠原酸和異綠原酸是金銀花主 要的抗菌有效成分。另有實驗證明木犀草素也有較強的抗菌作用。本品水浸劑在體外對鐵 鏽色小芽胞癬菌、星形奴卡氏菌等皮膚真菌有不同程度的抑制作用。金銀花水煎劑（1 :20) 在人胚腎原單層上皮細胞組織培養上，對流感病毒、孤兒病毒、皰疹病毒有抑制作用。藤的 水溶液也有延緩孤兒病毒所致的細胞致病的作用。試管實驗表明金銀花及其藤的煎劑，對 鉤端螺旋體均有抑制作用。用忍冬藤和千裡光配伍，作腹腔注射和皮下注射，據稱有治療兔 和預防鉤藤螺旋體病的效果。腹腔注射金銀花注射液7. 5g/kg，能使接受LD90的綠膿桿菌 內毒素或綠膿桿菌的小鼠存活半數以上。靜脈注射金銀花蒸餾液6g/kg，對綠膿桿菌內毒素 中毒的兔有治療作用。未治療的動物體溫和白細胞總數明顯下降，白細胞有核左移現象而 給藥組動物體溫略有升高，白細胞雖有增加但分類沒有明顯變化，且靜脈注射給予金黃注 射液（金銀花黃芩等量製成）7. 5g/kg，對家兔綠膿桿菌內毒素中毒也有一定對抗作用，可 減輕中毒症狀和死亡數。2.抗炎和解熱作用：腹腔注射金銀花提取液0.25g/kg，能抑制大 鼠角叉菜膠性腳腫。另有報導金銀花注射液30-40g/kg能減輕蛋清性腳腫程度。腹腔注射 金銀花提取液8g/kg，2次/天，連續6天，對大鼠巴豆油性肉芽囊，也有明顯抗滲出和抗增 生的作用。早期報導金銀花具有明顯的解熱作用，但用霍亂菌苗、馬鈴薯桿菌、枯草浸液等 給家兔耳靜脈注射，致熱，未證實金銀花煎劑5g/kg灌胃有退熱作用，認為這可能和使用的 金銀花製劑、劑量或家兔的耐受性不同有關。3.加強防禦機能作用：金銀花煎劑稀釋至1 : 1280的濃度，仍能促進白細胞的吞噬功能。小鼠腹腔注射金銀花注射液，也有明顯促進炎性 細胞吞噬功能的作用。4.中樞興奮作用：經電休克、轉籠等多種實驗方法證明口服綠原酸 後，可引起大鼠、小鼠等動物中樞神經系統興奮，其作用強度為咖啡因的1/6,二者合用無相 加及增強作用。5.降血脂作用：大鼠灌胃金銀花2. 5g/kg能減少腸內膽固醇吸收，降低血漿 中膽固醇含量。體外實驗也發現金銀花可和膽固醇相結合，但四妙勇安湯（金銀花、玄參、 當歸、甘草）治療家兔實驗性動脈粥樣硬化。未觀察到有降血脂和主動脈壁膽固醇含量的 作用。6.抗內毒素：用鱟試驗法測定內毒素含量，300%金銀花（忍冬）注射液以I :2-1 :64 稀釋，體外試驗無論用凹片法或試管法，均明顯降低試液中的內毒素含量，其中I :2-1 :8的 稀釋管與陰性對照管一樣呈液態，陽性對照呈凝膠狀。金銀花（忍冬）蒸餾液6g/kg靜脈 注射，對綠膿桿菌內毒互2. 8mg/kg靜脈注射引起的兔體溫下降及白細胞數下降有對抗作 用，金銀花（忍冬）蒸饋液7. 5g/kg或注射液2. 5g/kg腹腔注射，對綠膿桿菌內毒素65mg/ kg腹腔注射的小鼠有保護作用，減少小鼠死亡率。
[0047] 黃芩中含有黃芩素、黃芩新素、黃芩甙、漢黃芩素、漢黃芩甙、木蝴蝶素 A等，主要 有以下藥理作用：1.抗菌作用：黃芩煎劑100%濃度，平板法試驗，對痢疾桿菌、傷寒桿菌、 副傷寒桿菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、溶血性璉球菌（a，B)、肺 炎雙球菌、白喉桿菌等有抑制作用。黃芩煎劑試管法試驗I :1280濃度可抑制傷寒桿菌、溶 血性鏈球菌a，I :640濃度抑制溶血性鏈球菌B，肺炎雙球菌及福氏痢疾桿菌、人結核桿菌 H37，l :320濃度可抑制霍亂弧菌、志賀氏痢疾桿菌；1 :80濃度時宋內氏痢疾桿菌有抑制作 用。黃芩醇浸液〇. 5g/ml或0. 05g/ml，用瓊脂斜面培養，藥液與培養基1 :1混合，對綠膿杆 菌有抑制作用。黃苳醇浸液2g/ml濃度，平皿法試驗對大腸桿菌、桔草桿菌、金黃色葡萄球 菌有抑制作用。黃芩煎劑、醇提劑lg/ml濃度，用平板法試驗時對腦膜炎球菌均有抑作用。 2.抗真菌作用：黃芩煎液，試管斜面法試驗4%濃度抑制狗小牙胞菌及堇色毛癬菌，8 %濃 度抑制許蘭氏黃癬菌，10 %濃度抑制許蘭氏黃癬菌蒙古變種，15 %濃度抑制共心性毛癬菌 及鐵鏽色毛癬菌。黃芩水浸劑I :3濃度在試管內對堇色毛癬菌、同心性毛癬菌，許蘭氏黃 癬菌、奧杜盎氏小芽胞癬菌、羊毛樣小芽胞癬菌、紅色表皮癬菌、K、W、氏表皮癬菌、星形奴卡 氏菌等有不同程度抑菌作用。3.抗病毒作用：黃芩煎劑25-100%濃度，體外試驗對乙型肝 炎病毒DNA複製有抑制作用。4.抗炎抗變態反應：黃芩70 %乙醇提取物200, 500mg/kg灌 胃黃芩素、黃芩甙、漢黃芩素50,100mg/kg灌胃，可抑制醋酸引起的小鼠腹腔滲出增加，對 48/80(-種化合物名稱，Sigma生產）引起的大鼠足腫也有抑制作用，黃芩70%乙醇提取 物500mg/kg灌胃，黃芩素、黃芩甙及漢黃芩素100mg/kg灌胃對大鼠佐劑性關節炎有抑制 作用。黃芩水提物100, 200mg/kg灌胃，對大鼠被動皮膚過敏反應（PCA)有抑制作用，但對 氯化苦引起的小鼠接觸皮炎（耳腫脹）無明顯影響。黃芩抑制被動皮膚過敏反應（PCA)的 有效成分為黃芩甙及黃芩素。黃芩甙、黃芩素對實驗性氣喘有效，黃芩甙l〇_4g/ml濃度可 抑制豚鼠氣管Schult z-Dale反應38 %，並有抗組胺，抗膽鹼及罌粟鹼樣作用。黃芩素不溶 於水，其兩個水溶性衍生物黃芩素-6-磷酸二鈉（BPS)及黃芩素-6-硫酸二鈉（BSS)於抗 原攻擊前5mg/kg靜脈注射，對大鼠 PCA有抑制作用；10mg/kg靜脈注射於抗原攻擊前10分 鍾給藥，對豚鼠過敏性氣喘有抑制作用；BPS及BSS於10-4g/ml濃度對離體豚鼠腸管及氣 管Chultz-Dale反應均有抑制作用；BPS及BSS 5mg/kg靜脈注射，對大鼠反向皮膚過敏反 應（RCA)有抑制作用；5-10mg/kg靜脈注射也抑制Forssman皮膚血管炎，但對Arthus反應 無明顯影響。黃芩素及BPS結構上與抗過敏藥色甘酸二鈉（DSCG)相類似，但DSCG為雙色 酮類，黃芩素及BPS為單色酮類，DSCG對反應素（Reagin)抗體介導的過敏反應有高度特異 性，而對非反應素（IgG)抗體介導的過敏反應幾無作用，PBS則不僅抑制反應素抗體介導的 過敏反應，如PBS10-6-10-4g/ml抑制抗原引起的猴肺介質釋放，PBS 200mg/kg腹腔注射抑 制大鼠同種PCA，10-4g/ml抑制反應素抗體介導的大鼠肥大細胞脫顆粒等，也抑制非反應 素抗體介導的反應，如BPS10-4g/ml可抑制卵白蛋白致敏豚鼠肺釋放介質及抑制抗IgE抗 體引起的人肺釋放過敏介質，認為DSCG分子中兩個色酮核間有一定距離，可結合於反應素 抗體功能位置上，而不適合於非反應素抗體，但單色酮的黃芩素或BPS可以兩個分子結合 於這兩種抗體上。黃芩素對大鼠血小板花生四烯酸代謝中環氧酶與脂氧酶均有抑制作用， 對脂氧酶更具選擇性，其IC50為0. 12 μ m，而對環氧的IC50為6917倍於脂氧酶。黃芩素對 大鼠白細胞可抑制花生四烯酸代謝，抑制脂氧酶代謝產物5-羥基二十碳四烯酸（5-HETE) 及環氧酶代謝產物12-羥基十七碳三烯酸（HHT)的生成，其IC50分別為7. 13±0. 767 μ m 及5. 53 ± 16. 9 μ m ;黃芩甙對白細胞5-HETE形成也抑制，但不抑制HHT的形成；漢黃芩素抑 制HHT的形成，IC50為14. 6±3. 51 μ m黃芩成分對化合物48/80刺激大鼠腹腔肥大細胞釋 放組胺的抑制作用，黃芩素的IC50為52. Ιμπι，黃芩甙IC50為> 200μπι，漢黃芩素的IC50 為40.(^111，漢黃芩素-7-0-0葡萄糖醛酸的扣50為140.0111〇1/1，（25)2'，5,6'，7-四羥黃 烷酮的 IC50 為 17. 7μπι，（2R，3R)-2'，3,5,6'，7_ 五羥黃烷酮的 IC50 為 15. 5μπι，白楊素 (Chrysin)的 IC50 > 200 μ m，黃尊新素 II (Skullcapflavon II )的 IC50 為 15. 0 μ m。黃 芩甙10,100mg/ml，對鈣離子載體A23187誘導的大鼠腹腔巨噬細胞產生PGE2及TXA2均有 明顯抑制作用。5.對中樞神經系統的作用：黃芩煎劑4g/kg腹腔注射，對小鼠防禦性條件 反射可使陽性反射時延長，而對非條件反射及分化無影響，說明黃芩可加強皮層抑制過程。 黃芩煎劑2g/kg，對傷寒混合疫苗致熱家兔有解熱作用。但也有報導黃芩水煎劑或酒浸劑 5_9g/只灌胃，或2g/只im，均不能證明黃芩對傷寒疫苗致熱家兔有解熱作用。6.對心血管 的作用：黃芩醇提液lg/kg靜脈注射，可使麻醉犬血壓下降。黃芩煎劑0.06g/kg靜脈注射， 對麻醉犬有明顯降壓作用。黃芩素20mg/kg靜脈注射，可使麻醉犬血壓下降40-50%。黃 芩浸劑灌胃/kg灌胃，3次/天，連續4周，使慢性腎性高血壓犬血壓下降，心率變慢。黃芩 甙2X10 Mm〇l/l，在豚鼠離體主動脈條、肺動脈條、氣管條及右心房均有競爭性的拮抗腎 上腺素，去甲腎上腺素及多巴胺引起的收縮作用，也拮抗異丙腎上腺素舒張氣管和增加右 心房自發頻率作用，提示黃芩甙對a，Bl，B2受體均有阻斷作用。7.抗血小板聚集及抗凝 ： 黃芩素、漢黃芩素、千層紙素 A、黃芩黃酮II及白楊素（chrysin)於濃度LOmM時，均可抑制 膠原誘導的大鼠血小板聚集，白楊素對ADP誘導的血小板聚集也有抑制作用，黃芩素及漢 黃芩素對花生四烯酸誘導的血小板聚集也有抑制作用，黃芩素及黃芩甙對凝血酶誘導的纖 維蛋白原轉化為纖維蛋白也抑制；黃芩素及黃芩甙20,50mg/kg灌胃，對內毒素誘導的大鼠 瀰漫性血管內凝血，可以防止血小板及纖維蛋白原含量的降低。8.降血脂作用：黃芩水浸 液10% 2ml/只灌胃，連續給藥7周，可使膽固醇餵飼的家兔血清膽固醇含量下降。黃芩素、 黃芩甙100mg/kg灌胃，可降低實驗性高血脂大鼠玉米油-膽固醇-膽酸餵飼血清游離脂肪 酸、甘油三酯及肝甘油三酯的含量，黃芩黃酮II 100mg/kg灌胃，可降低血清總膽固醇及肝 甘油三酯的含量，增加血清高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-ch)的含量，漢黃芩素100mg/kg灌 胃，可防止肝甘油三酯的沉積並增加血清HDL-ch的含量。黃芩素、黃芩甙100mg/kg灌胃， 對乙醇引起的高血脂大鼠，可降低肝總膽固醇、游離膽固醇及甘油三酯含量，漢黃芩素能降 低血清甘油三酯的水平，黃芩素能增加血清HDL-ch含量。9.保肝、利膽、抗氧化：黃芩甲醇 提取物l〇〇〇mg/kg腹腔注射，對異硫氰酸萘酯（ANIT)引起的大鼠肝損害有抑制作用，可抑 制血清膽紅素的增加。黃芩醇提物50,100mg/kg，黃芩甙50,100mg/kg灌胃，對家兔有利膽 作用。漢黃芩素 l〇(_4)-l〇(_6)mol/l濃度體外試驗，對大鼠肝微粒體脂質過氧化有抑制作用， 使丙二醛（MDA)含量下降。黃芩素及黃芩甙Z.SXIOmmol/la.OXIoHVol/l，漢黃芩素 2. 5Χ 10M)mol/l，黃芩黃酮 II 2. 5Χ 10M)mol/l，漢黃芩素-7-0-D 葡萄糖醛酸 2. 5Χ 10(_4) mol/1，I. OX 10(_4)mol/l，對FeCl2維生素 C-ADP混合物誘導的大鼠肝勻漿脂質過氧化有抑 製作用，使肝MDA的形成顯著下降，對NADPH-ADP引起的脂質過氧化也抑制。
[0048] 連翹中含有連翹甙、連翹甙元、右旋鬆脂酚、右旋鬆脂醇葡萄糖甙等，主要的藥理 作用為：1.抗菌、抗病毒作用1. 1.抗細菌作用：將連翹種子揮髮油乳劑以試管倍量稀釋法 進行抗菌試驗，結果顯示該藥除對綠膿桿菌作用稍低外，對其它10株革蘭氏陽性和陰性細 菌均有較強的抗菌作用。其中對金黃色葡萄球菌的作用最強（抗菌效價為1/1.024);其 次為肺炎球菌；甲、乙型鏈球菌；卡他奈氏球菌；福氏痢疾桿菌；甲型副傷寒桿菌；（抗菌效 價均為1/512)和大腸桿菌（抗菌效價為1/256)，對肺炎桿菌、普通變形桿菌抗菌效價均為 1/28。選取對所試菌有抗菌作用之試驗液，進行再傳代培養試驗，結果顯示連翹種子揮發 油對所試細菌的抗菌作用較為徹底而且穩定。連翹濃縮煎劑在體外有抗菌作用，可抑制傷 寒桿菌、副傷寒桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、白喉桿菌及霍亂弧菌、葡萄球菌、鏈球菌等。連 翹在體外的抑菌作用與金銀花大體相似；為銀翹散中抗菌之主要成分。金銀花對沙門氏菌 屬，特別是傷寒桿菌以及溶血性鏈球菌的抑制作用似超過連翹，而對痢疾桿菌、金黃色葡萄 球菌之抑制則以連翹似較好。二者聯合使用，在試管中並無協同作用，與黃連、黃芩組成的 複方，體外抑菌作用比單用連翹時據云更強。連翹中抗菌的有效成分研究不多，連翹酚在試 營中對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度為I :5120 ;對痢疾桿菌為I :1280 ;對白喉桿菌及副傷 寒（甲）桿菌為1 :640,可能力抗菌有效成分。花對小鼠實驗性結核病有一定療效，對豚鼠 則無效。此外，還報告過它在試管中及臨床上的抗結核桿菌的作用。連翹的醇提取物在體 外有抗鉤端螺旋體作用，其強度不及黃連、荔枝草或金銀花、黃芩，而與黃柏、蚤休相似。連 翹水浸劑（1 :5)在試管內對星形奴卡氏菌有些抑制作用。1.2.抗真菌作用：將連翹種子揮 髮油乳劑以試管倍量稀釋法進行抗白色和熱帶念珠菌的試驗，結果顯示該藥對所試的二個 菌株均有較明顯的抗菌作用，其抗菌效價分別為1/1. 024和1/512。1.3.抗病毒作用將連 翹種子揮髮油乳劑以雞胚內法（藥物濃度為1/32)和雞胚外法進行抗亞洲甲型流感病毒和 I型副流感病毒作用試驗。可見連翹種子揮髮油對京科68-1珠病毒在感染同時給藥能顯 示作用，仙臺株病毒在感染同時給藥和感染前給藥能顯示作用。可以看出連翹種子揮髮油 乳劑在雞胚外對京科68-1株和仙臺株病毒均有顯著的抗病毒作用。對所試兩種病毒的抗 病毒效價均為1/65, 536。用斑點雜交法試驗，連翹煎劑25% -100%濃度，有降低B型肝炎 病毒脫氧核糖核酸（HBVDNA)含量的作用。2.對心血管系統的影響2.1.連翹注射液對中 毒性休克時在體貓心的影響：實驗用貓3隻，腹腔麻醉，頸動脈插管測量血壓，氣管插管，連 電動人工呼吸機，打開胸腔及心包，暴露心臟，用絲線將心尖聯於微拉力傳感儀，用三筆記 錄儀描記心臟舒縮曲線。實驗前，先描記一段心肌舒縮波及血壓曲線作為正常對照，然後靜 脈注射傷寒菌苗0. 8-2. 5ml/kg待出現較明顯損害的心肌曲線（心肌舒縮波高低不齊，節律 不整），血壓下降。靜脈注射連翹注射液8g/kg後，心律變齊其中2隻貓心肌舒縮波振幅增 大，血壓在30分鐘後上升約40mmHg。提示有強心及升壓作用。2.2.對毛細血管通透性的 影響選健康小鼠雌雄不拘，體重18_22g，分為實驗組和對照組，實驗組7隻動物，由尾靜脈 或皮下注射連翹注射液（60g/kg)，對照組9隻動物，用生理鹽水代替藥物（0. 4ml/只）。10 分鐘後經尾靜脈注入0. 5 %伊文氏藍液0. 2ml/只。30分鐘後，腹腔注射0. 4%醋酸0. 4ml/ 只。再30分鐘後將小鼠脫血處死，打開腹腔用生理鹽水衝洗腹腔滲出液，將洗出液置於5ml 刻度試管至刻度，以2000轉/分離心10分鐘，取上清液測定其伊文氏藍濃度。結果對照組 腹腔滲出液伊文氏藍濃度（μ g% )為368. 47±28. 55 (平均值土標準差，下同），而實驗組 為160. 12±28. 37 (P < 0. 01)。表明連翹注射液對醋酸所致的毛細血管通透性有明顯抑制 作用。3.對離體小腸的抑制作用實驗用豚鼠，按Magnur法作離體腸標本。離體小腸置於 12 X 10-2連翹營養液中，共做10次試驗，結果4次表現為腸張力降低，6次先升後降。收縮 振幅8次減弱，2次無變化。等容量生理鹽水對離體腸無影響。提示連翹對豚鼠離體小腸有 抑制作用。4.抑制彈性蛋白酶活力作用：連翹等稀釋成每Iml含I. 5g、0. 75g及0. 375g，3 種濃度。豬胰彈性蛋白酶（PPE)稀釋成19u/0. 5mg ·πι1及9. 5u/0. 25mg ·πι1兩種濃度。將 19u/0. 5mg · ml的酶液與上述不同濃度的藥物分別等量混勻後，各取10 μ 1，分別滴入瓊脂 板孔內，每一皿內均留兩孔各滴1〇μ 1、9. 5u/0. 25mg.ml的酶液作酶溶解平行對照，37°C溫 育24小時後測量溶解環直徑。（酶活力與溶解環直徑成線性關係）。連翹抑制彈性蛋白酶活 力的作用見表5。可見三種濃度的連翹均可顯著抑制0· 095u的PPE的酶活力（P <0· 001)， 其中在7. 5mg濃度時完全抑制PPE酶活力。連翹水溶性粗提物10_3g/ml、10_4g/ml對磷酸二 脂酶有抑制作用。
[0049] 另外，本發明採用的功能微生物是經過大量反覆的試驗，然後篩選出來的。其中， 乳酸菌屬於厭氧或兼性厭氧菌，是動物消化道尤其是家禽腸道的優勢菌群。乳酸菌可利用 糖類發酵產生大量乳酸，乳酸菌通過自身以及代謝產物與其他微生物之間的相互作用，調 整菌群之間的關係。嗜酸乳桿菌屬於乳桿菌屬，嗜酸乳桿菌不僅在胃中，它還是人體小腸內 的主要益生菌。嗜酸乳桿菌在腸道內發酵後，還可產生乳酸，能提高鈣、磷、鐵的利用率，促 進鐵和維生素 D的吸收，產生維生素 K及維生素 B，還可以減少膽固醇的吸收，提高動物的 免疫力。產朊假絲酵母為兼性厭氧菌，在動物體內生長繁殖，能消耗腸道內的氧氣形成厭氧 環境，並代謝產生乳酸等有機酸，有利於乳酸菌等有益菌的生長，抑制大腸桿菌、沙門氏菌 等有害菌的生長，從而改善胃腸道環境和菌群結構，促進胃腸對營養物質的消化、吸收和利 用。
[0050] 與傳統雙黃連的口服液不同的是，本發明利用有益微生物在常溫、常壓等較為溫 和的條件下將植物組織內大多數有效成分也充分有效地溶出和轉化，大幅度提高了其含 量。在保持並增強原有雙黃連口服液藥效的基礎上兼有維護和調整動物胃腸道菌群平衡的 作用，這種是通過促進有益菌的增殖和抑制有害菌的繁殖入侵兩條途徑來實現的，而抗生 素則是直接通過抑菌殺菌來實現預防和治療的，包括對有益菌的抑制殺滅。本發明利用功 能微生物將三味中藥中所含的抗菌、抗病毒及解熱的活性成分最大限度地提取出來，增加 產品中抗菌和抗病毒的成分，提高對細菌性和病毒性感染的療效，本發明還利用微生物的 生長代謝和生命活動，模仿腸道微生物轉化苷的過程，建立體外微生物炮製模型，在體外 把雙黃連口服液製劑中主要藥效成分一苷，轉化為能被畜禽迅速吸收的有效成分一苷元。 在體外實現苷類成分的轉化，提高了雙黃連製劑中苷元含量，增強了療效。
[0051] 由於採用了上述技術方案，本發明的有益效果是：
[0052] 1、傳統的炮製工藝中需要大量輔料才能成型，而且也造成了造成大量揮發性成分 以及熱不穩定成分的損失，中藥有效利用率低。本發明利用微生物強大的分解能力，在常 溫、常壓下可以將植物組織內大多數有效成分充分有效地溶出和轉化，大幅度提高了其含 量。比一般的物理或化學的炮製手段更大幅度地改變藥性，能最大限度保護中藥化學成分 免遭破壞。同時，有利於環境的保護，降低生產成本。
[0053] 2、苷類成分在腸道內難以吸收、生物利用度低、腸內滯留時間較長，在動物體內 難以直接發揮藥效作用。本發明利用微生物的生長代謝和生命活動，模仿腸道微生物轉化 苷的過程，建立體外微生物炮製模型，在體外把雙黃連口服液製劑中主要藥效成分一苷， 轉化為能被畜禽迅速吸收的有效成分一苷元。在體外實現苷類成分的轉化，提高了雙黃連 製劑中苷元含量，增強了療效。
[0054] 3、本發明選用的有益微生物在以黃芩、金銀花、連翹為底物的發酵過程中不僅有 效的溶出和轉化雙黃連口服液的中的有效成分，嗜酸乳桿菌和產朊假絲酵母兩種有益菌也 得到大量增殖。嗜酸乳桿菌在腸道內定植，與腸黏膜細胞相互作用，密切結合構成了生物學 屏障，阻止了致病菌的的侵入和定植，相當於自然免疫。
[0055] 4.嗜酸乳桿菌在繁殖過程中不斷產生乳酸，使發酵液中的pH值不斷降低，最終達 至IJ PH3左右，可以有效阻止其它微生物侵入發酵液中，不加任何防腐劑即可有效保存2年以 上時間。
[0056] 綜上所述，本發明篩選了雙黃連組方作為中藥組方，並利用功能微生物-嗜酸乳 桿菌、產朊假絲酵母將雙黃連組方中所含的抗菌、抗病毒及解熱的活性成分最大限度地提 取出來，增強了療效，同時，嗜酸乳桿菌、產朊假絲酵母能起到維護和調整動物胃腸道菌群 平衡的作用。

【具體實施方式】
[0057] 為了使本發明實現的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結 合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0058] -種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，是將功能微生物的二級菌種接種 於雙黃連組方發酵液中，利用功能微生物的生命活動，在常溫、常壓下進行液體深層高密度 發酵，將雙黃連組方中有效成分充分有效地溶出和轉化，而製成的雙黃連口服液生物製劑。
[0059] 其中，所述功能微生物是嗜酸乳桿菌ACCC00160和產朊假絲酵母ACCC20060,均來 源於中國農業微生物菌種保藏中心。
[0060] 上述雙黃連口服液製劑的製備方法如以下若干實施例。
[0061] 實施例1
[0062] 上述獸用雙黃連口服液製劑的製備方法，步驟包括以下：
[0063] (1)雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按重量比1:2:4混合均勻，粉碎過40 目篩；
[0064] (2)嗜酸乳桿菌一級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 120°C、7. 84MPa滅菌15min，冷卻至35°C後無菌條件下接種篩選的嗜酸乳桿菌試管菌種，於 搖床在35°C、lOOr/min的條件下培養45h，即得嗜酸乳桿菌一級菌種；
[0065] (3)產朊假絲酵母一級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中， 並在120°C、7. 84MPa滅菌15min，冷卻至25°C後無菌條件下接種篩選的產朊假絲酵母試管 菌種，於搖床在25°C、lOOr/min的條件下，培養45h，即得產朊假絲酵母一級菌種；
[0066] (4)嗜酸乳桿菌二級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 120°C、8. SMPa滅菌15min，冷卻至40°C後無菌條件下接種步驟（2)得到的嗜酸乳桿菌一級 菌種，於搖床在35°C、100r/min的條件下培養35h，即得嗜酸乳桿菌二級菌種；
[0067] (5)產朊假絲酵母二級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中， 並在120°C、7.9MPa滅菌15min，冷卻至28°C後無菌條件下接種步驟（3)得到的產朊假絲酵 母一級菌種，於搖床在28°C、100r/min的條件下培養35h，即得產朊假絲酵母二級菌種；
[0068] (6)益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：向步驟（1)製備的雙黃連中 藥粉中注入過濾除菌後的潔淨溫水，製成雙黃連組方發酵液，保證每IOOOml雙黃連組方發 酵液中含有黃芩25g、金銀花50g、連翹100g，並向所述雙黃連組方發酵液中分別接種步驟 (4)製備的嗜酸乳桿菌二級菌種和步驟（5)製備的產朊假絲酵母二級菌種，保證雙黃連組 方發酵液、嗜酸乳桿菌二級菌種和產朊假絲酵母二級菌種的體積比為33 :1 :1，在32°C下培 養100天，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，再將得到的獸用雙黃連口服 液製劑過濾後灌裝。
[0069] 上述製備方法，所述嗜酸乳桿菌液體菌種培養基中，含雙黃連中藥粉10g/L、檸檬 酸二銨lg/L、磷酸氫二鉀lg/L、Tween80 lg/L、三水乙酸鈉3g/L。所述產朊假絲酵母液體 菌種培養基中，含雙黃連中藥粉3g/L、玉米粉2g/L、磷酸氫二鉀lg/L、硫酸鎂lg/L。
[0070] 將得到的獸用雙黃連口服液製劑過濾後灌裝，得到每ml液體含以下成分分別不 低於：黃芩苷6. 72mg、黃芩素0· 82mg、漢黃芩素0· 56mg、連翹苷0· 27mg、綠原酸0· 69mg的獸 用雙黃連口服液製劑。
[0071] 實施例2
[0072] 獸用雙黃連口服液製劑的製備方法，詳細步驟如下：
[0073] (1)雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按重量比1:1:2混合均勻，粉碎過60 目篩；
[0074] (2)嗜酸乳桿菌液體菌種培養基：雙黃連中藥粉10g/L、檸檬酸二銨2g/L、磷酸氫 二鉀 2g/L、Tween802g/L、三水乙酸鈉 5g/L ;
[0075] (3)嗜酸乳桿菌一級菌種製備：500ml三角瓶裝入嗜酸乳桿菌液體菌種培養基 300ml，121°C、8. OMPa滅菌20min ;冷卻至40°C後無菌條件下接種篩選保存的嗜酸乳桿菌試 管菌種，於搖床40°C、IlOr/min培養48h，即得嗜酸乳桿菌一級菌種；
[0076] (4)產朊假絲酵母液體菌種培養基：雙黃連中藥粉4g/L、玉米粉3g/L、磷酸氫二鉀 2g/L、硫酸鎂 lg/L ;
[0077] (5)產朊假絲酵母一級菌種製備：500ml三角瓶裝入產朊假絲酵母液體菌種培養 基300ml，121°C、8. OMPa滅菌20min ;冷卻至30°C後無菌條件下接種篩選保存的產朊假絲酵 母試管菌種，於搖床29°C、110r/min培養48h即得產朊假絲酵母一級菌種；
[0078] (6)嗜酸乳桿菌二級菌種製備：500ml三角瓶裝入嗜酸乳桿菌液體菌種培養基 300ml，121 °C 8. OMPa滅菌20min ;冷卻至45°C後無菌條件下接種步驟（3)得到的嗜酸乳杆 菌一級菌種，於搖床40°C，llOr/min，培養36h，即得嗜酸乳桿菌二級菌種；
[0079] (7)產朊假絲酵母二級菌種製備：500ml三角瓶裝入產朊假絲酵母液體菌種培養 基300ml，121 °C 8. OMPa滅菌20min ;冷卻至30°C後無菌條件下接種步驟（5)得到的產朊假 絲酵母一級菌種，於搖床29°C，llOr/min，培養36h即得產朊假絲酵母二級菌種；
[0080] (8)益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：1000L全自動液體發酵罐中 加入步驟（1)製備的雙黃連中藥粉，注入940L過濾除菌後的潔淨溫水，保證每IOOOml雙 黃連組方發酵液中含有黃芩25g、金銀花25g、連翹50g，然後分別接種嗜酸乳桿菌二級菌種 30L、產朊假絲酵母二級菌種30L，35°C培養120天，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口 服液製劑；
[0081] (9)將得到的獸用雙黃連口服液製劑過濾後灌裝，得到每ml液體含以下成分分別 不低於：黃芩苷6. 72mg、黃芩素0· 82mg、漢黃芩素0· 56mg、連翹苷0· 27mg、綠原酸0· 69mg的 獸用雙黃連口服液製劑。
[0082] 實施例3
[0083] 獸用雙黃連口服液製劑的製備方法，步驟包括以下：
[0084] (1)雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按重量比2:1:3混合均勻，粉碎過80 目篩；
[0085] (2)嗜酸乳桿菌一級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 125°C、8. SMPa滅菌25min，冷卻至45°C後無菌條件下接種篩選的嗜酸乳桿菌試管菌種，於 搖床在45°C、120r/min的條件下培養52h，即得嗜酸乳桿菌一級菌種；
[0086] (3)產朊假絲酵母一級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中， 並在125°C、8. SMPa滅菌25min，冷卻至35°C後無菌條件下接種篩選的產朊假絲酵母試管菌 種，於搖床在33°C、120r/min的條件下，培養53h，即得產朊假絲酵母一級菌種；
[0087] (4)嗜酸乳桿菌二級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 125°C、7. 84MPa滅菌25min，冷卻至50°C後無菌條件下接種步驟（2)得到的嗜酸乳桿菌一級 菌種，於搖床在45°C、120r/min的條件下培養37h，即得嗜酸乳桿菌二級菌種；
[0088] (5)產朊假絲酵母二級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中， 並在125°C、8.8MPa滅菌25min，冷卻至32°C後無菌條件下接種步驟（3)得到的產朊假絲酵 母一級菌種，於搖床在30°C、120r/min的條件下培養37h，即得產朊假絲酵母二級菌種；
[0089] (6)益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：向步驟（1)製備的雙黃連中 藥粉中注入過濾除菌後的潔淨溫水，製成雙黃連組方發酵液，保證每IOOOml雙黃連組方發 酵液中含有黃芩50g、金銀花25g、連翹75g，並向所述雙黃連組方發酵液中分別接種步驟 (4)製備的嗜酸乳桿菌二級菌種和步驟（5)製備的產朊假絲酵母二級菌種，保證雙黃連組 方發酵液、嗜酸乳桿菌二級菌種和產朊假絲酵母二級菌種的體積比為30 :1 :1，在38°C下培 養150天，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，再將得到的獸用雙黃連口服 液製劑過濾後灌裝。
[0090] 上述製備方法，所述嗜酸乳桿菌液體菌種培養基中，含雙黃連中藥粉15g/L、檸檬 酸二銨3g/L、磷酸氫二鉀3g/L、Tween803g/L、三水乙酸鈉8g/L，所述產朊假絲酵母液體菌 種培養基中，含雙黃連中藥粉5g/L、玉米粉4g/L、磷酸氫二鉀3g/L、硫酸鎂I. 5g/L。
[0091] 將得到的獸用雙黃連口服液製劑過濾後灌裝，得到每ml液體含以下成分分別不 低於：黃芩苷6. 72mg、黃芩素0· 82mg、漢黃芩素0· 56mg、連翹苷0· 27mg、綠原酸0· 69mg的獸 用雙黃連口服液製劑。
[0092] 實施例4
[0093] 化學成分研究。
[0094] 利用HPLC(高效液相色譜法）對以下液體製劑的成分進行檢測，檢測範圍主要是 黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、連翹苷和綠原酸等對動物有顯著療效的成分，檢測結果如下表。
[0095] 下表中，製劑A為本發明技術方案製備的雙黃連口服液製劑，製劑B為傳統意義 上的雙黃連組方液體製劑，製劑C為單純利用嗜酸乳桿菌ACCC00160處理的雙黃連口服液 製劑，製劑D為單純利用產朊假絲酵母ACCC20060處理的雙黃連口服液製劑，製劑E為採用 EM原露處理的雙黃連口服液製劑，製劑F為採用嗜酸乳桿菌（非ACCCOO160)、產朊假絲酵 母（非ACCC20060)處理的雙黃連口服液製劑。
[0096]

【權利要求】
1. 一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，其特徵在於：是將功能微生物的二 級菌種接種於雙黃連組方發酵液中，利用功能微生物的生命活動，在常溫、常壓下進行液體 深層高密度發酵，將雙黃連組方中有效成分充分有效地溶出和轉化，而製成的雙黃連口服 液生物製劑。
2. 如權利要求1所述的一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，其特徵在於： 所述雙黃連組方由重量比為（1-2) : (1-2) : (2-4)的黃芩、金銀花、連翹組成。
3. 如權利要求2所述的一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，其特徵在於： 所述雙黃連組方由重量比為1:1:2的黃芩、金銀花、連翹組成。
4. 如權利要求3所述的一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，其特徵在於： 所述每1000ml雙黃連組方發酵液中含有黃芩25g、金銀花25g、連翹50g。
5. 如權利要求1-4任一項所述的一種利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，其特 徵在於：所述功能微生物是嗜酸乳桿菌ACCC00160和產朊假絲酵母ACCC20060,均來源於中 國農業微生物菌種保藏中心。
6. -種製備如權利要求5所述製劑的方法，其特徵在於：包括如下步驟： (1) 雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按雙黃連組方重量比混合均勻，粉碎過篩； (2) 嗜酸乳桿菌一級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基高溫高壓滅菌；冷卻後 在無菌條件下接種嗜酸乳桿菌菌種，於搖床中培養，即得嗜酸乳桿菌一級菌種； (3) 產朊假絲酵母一級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基高溫高壓滅菌；冷 卻至後在無菌條件下接種產朊假絲酵母菌種，於搖床中培養，即得產朊假絲酵母一級菌 種； (4) 嗜酸乳桿菌二級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基高溫高壓滅菌；冷卻後 在無菌條件下接種步驟（2)得到的嗜酸乳桿菌一級菌種，於搖床中培養，即得嗜酸乳桿菌 二級菌種； (5) 產朊假絲酵母二級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基高溫高壓滅菌；冷 卻至後在無菌條件下接種步驟（3)得到的產朊假絲酵母一級菌種，於搖床中培養，即得產 朊假絲酵母二級菌種； (6) 益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：向步驟（1)製備的雙黃連中藥粉 中注入過濾除菌後的潔淨溫水，製成雙黃連組方發酵液，並向所述雙黃連組方發酵液中分 別接種步驟（4)製備的嗜酸乳桿菌二級菌種和步驟（5)製備的產朊假絲酵母二級菌種，培 養後，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑。
7. -種如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於：步驟如下： (1) 雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按重量比（1-2) : (1-2) : (2-4)混合均勻，粉 碎過40-80目篩； (2) 嗜酸乳桿菌一級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 120-125°C、7. 84-8. 8MPa滅菌15-25min，冷卻至35-45°C後無菌條件下接種篩選的嗜酸乳 桿菌試管菌種，於搖床在35_45°C、100-120r/min的條件下培養45_52h，即得嗜酸乳桿菌一 級菌種； (3) 產朊假絲酵母一級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中，並在 120-125°C、7. 84-8. 8MPa下滅菌15-25min，冷卻至25-35°C後無菌條件下接種篩選的產朊 假絲酵母試管菌種，於搖床在25-33°C、100-120r/min的條件下，培養45-53h，即得產朊假 絲酵母一級菌種； (4) 嗜酸乳桿菌二級菌種製備：將嗜酸乳桿菌液體菌種培養基裝入容器中，並在 120-125°C、7. 84-8. 8MPa滅菌15-25min，冷卻至40-50°C後無菌條件下接種步驟（2)得到的 嗜酸乳桿菌一級菌種，於搖床在35-45°C、100_120r/min的條件下培養35-37h，即得嗜酸乳 桿菌二級菌種； (5) 產朊假絲酵母二級菌種製備：將產朊假絲酵母液體菌種培養基裝入容器中，並在 120-125°C、7. 84-8. 8MPa滅菌15-25min，冷卻至28-32°C後無菌條件下接種步驟（3)得到的 產朊假絲酵母一級菌種，於搖床在28-30°C、l(K)-12r/min的條件下培養35-37h，即得產朊 假絲酵母二級菌種； (6) 益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：向步驟（1)製備的雙黃連中藥粉 中注入過濾除菌後的潔淨溫水，製成雙黃連組方發酵液，保證每1000ml雙黃連組方發酵液 中含有黃芩25g、金銀花25g、連翹50g，並向所述雙黃連組方發酵液中分別接種步驟（4)制 備的嗜酸乳桿菌二級菌種和步驟（5)製備的產朊假絲酵母二級菌種，保證雙黃連組方發酵 液、嗜酸乳桿菌二級菌種和產朊假絲酵母二級菌種的體積比為（33-30) :1 :1，在32-38°C下 培養100-150天，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液製劑，再將得到的獸用雙黃 連口服液製劑過濾後灌裝。
8. -種如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於：步驟如下：所述嗜酸乳桿菌液 體菌種培養基中，含雙黃連中藥粉10-15g/L、檸檬酸二銨l-3g/L、磷酸氫二鉀l-3g/L、 Tween801-3g/L、三水乙酸鈉 3-8g/L。
9. 一種如權利要求8所述的製備方法，其特徵在於：步驟如下：所述產朊假絲酵母 液體菌種培養基中，含雙黃連中藥粉3-5g/L、玉米粉2-4g/L、磷酸氫二鉀l-3g/L、硫酸鎂 1-1. 5g/L。
10. -種如權利要求9所述的製備方法，其特徵在於：步驟如下： (1) 雙黃連中藥粉製備：黃芩、金銀花、連翹按重量比1:1:2混合均勻，粉碎過60目篩； (2) 嗜酸乳桿菌液體菌種培養基：雙黃連中藥粉10g/L、檸檬酸二銨2g/L、磷酸氫二鉀 2g/L、Tween802g/L、三水乙酸鈉 5g/L ; (3) 嗜酸乳桿菌一級菌種製備：500ml三角瓶裝入嗜酸乳桿菌液體菌種培養基300ml， 121°C、8. OMPa滅菌20min ;冷卻至40°C後無菌條件下接種篩選保存的嗜酸乳桿菌試管菌 種，於搖床40°C、llOr/min培養48h，即得嗜酸乳桿菌一級菌種； (4) 產朊假絲酵母液體菌種培養基：雙黃連中藥粉4g/L、玉米粉3g/L、磷酸氫二鉀2g/ L、硫酸鎂lg/L ; (5) 產朊假絲酵母一級菌種製備：500ml三角瓶裝入產朊假絲酵母液體菌種培養基 300ml，121°C、8. OMPa滅菌20min ;冷卻至30°C後無菌條件下接種篩選保存的產朊假絲酵母 試管菌種，於搖床29°C、110r/min培養48h即得產朊假絲酵母一級菌種； (6) 嗜酸乳桿菌二級菌種製備：500ml三角瓶裝入嗜酸乳桿菌液體菌種培養基300ml， 121°C、8. OMPa滅菌20min ;冷卻至45°C後無菌條件下接種步驟（3)得到的嗜酸乳桿菌一級 菌種，於搖床40°C，llOr/min，培養36h，即得嗜酸乳桿菌二級菌種； (7) 產朊假絲酵母二級菌種製備：500ml三角瓶裝入產朊假絲酵母液體菌種培養基 300ml，121°C、8. OMPa滅菌20min ;冷卻至30°C後無菌條件下接種步驟（5)得到的產朊假絲 酵母一級菌種，於搖床29°C，110r/min，培養36h即得產朊假絲酵母二級菌種； (8) 益生菌炮製雙黃連複合液體生物中藥製劑製備：1000L全自動液體發酵罐中加入 步驟（1)製備的雙黃連中藥粉，注入940L過濾除菌後的潔淨溫水，保證每1000ml雙黃連組 方發酵液中含有黃芩25g、金銀花25g、連翹50g，然後分別接種嗜酸乳桿菌二級菌種30L、產 朊假絲酵母二級菌種30L，35°C培養120天，即得到利用益生菌炮製的獸用雙黃連口服液制 劑； (9) 將得到的獸用雙黃連口服液製劑過濾後灌裝，得到每ml液體含以下成分分別不低 於：黃芩苷6. 72mg、黃芩素0· 82mg、漢黃芩素0· 56mg、連翹苷0· 27mg、綠原酸0· 69mg的獸用 雙黃連口服液製劑。
【文檔編號】A61P31/04GK104288236SQ201410536082
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】任夕德, 趙方圓 申請人:任夕德