一種檢測液體中內毒素含量的方法
2023-05-05 09:20:16 2
一種檢測液體中內毒素含量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測液體中內毒素含量的方法，通過混合待測液體與重組鱟C因子，經與多肽修飾電極接觸反應後，測該電極在電解液中的電化學響應來獲知待測液體中內毒素的濃度；在製備鱟C因子時，採用基因工程的手段，重組表達出鱟C因子。本案通過電化學技術直接得出結果，不受比色法等傳統方法中樣品顏色的幹擾；避免使用鱟試劑，可以降低檢測成本並且一定程度上減輕生態壓力；專一對內毒素起反應，避免了傳統鱟試劑反應中G因子旁路的幹擾；同時，使用基因工程的方法，保證了檢測方法中試劑批次間的均一性，有利於產業化生產。
【專利說明】一種檢測液體中內毒素含量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及內毒素的檢測【技術領域】，特別涉及一種檢測液體中內毒素含量的電化學分析方法。
【背景技術】
[0002]內毒素是由多糖、脂質和蛋白質組成的複合體，是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一。當細菌破裂後，內毒素會釋放出來，環境中到處存在內毒素。內毒素能引起發熱反應，白細胞反應，內毒素血症、內毒素休克和彌散性血管內凝血。因此內毒素檢測在環境監測、藥廠質量控制、醫療器械熱原監測等領域具有十分重要的意義。
[0003]內毒素具有以下性質:穩定性強，具有耐熱性；抗原性弱，免疫動物後，形成的抗體較少。目前內毒素檢測方法主要有兩種，包括家兔檢測熱源法和鱟試驗法。隨著製藥工業的發展，熱原法已不能適合許多品種的熱原檢查。鱟試驗因其簡單、快速、靈敏、準確的特點，被世界各國廣泛採用，中國藥典和歐美藥典將其定為法定的細菌內毒素檢查法。目前鱟試驗檢測法試劑盒有以下幾種:
[0004](I)凝膠法鱟試劑(定性，半定量)
[0005](2)動態濁度法鱟試劑(定量)
[0006](3)終點濁度法鱟試劑(定量)
[0007](4)動態顯色法鱟試劑(定量)
[0008](5)終點顯色法鱟試劑(定量)
[0009]鱟試驗檢測法的檢測容易受到樣品中顯色物質的幹擾，而且鱟試劑的凝固過程對光學測量也有一定幹擾，此外，鱟試劑反應中G因子旁路也會對檢測的特異性造成影響。利用鱟這種珍稀動物製備鱟試劑成本較高，並且會造成一定程度的生態破壞，基於以上一些因素，鱟試驗的廣泛應用有一定的局限性，對內毒素的檢測需要開發新型的傳感策略。
【發明內容】
[0010]本發明的目的在於提供一種檢測液體中內毒素含量的方法，本發明所述方法對內毒素的檢測具有快速、選擇性強、靈敏度高等特點。
[0011]本發明提供一種檢測液體中內毒素含量的方法，包括以下步驟:
[0012]步驟I)將含飽和鱟C因子的水溶液加入到待測液體中，得到一混合液，待測液體中的內毒素能夠激活所述鱟C因子，產生活性鱟C因子；
[0013]步驟2)將經過修飾的電極插入到所述混合液中，電極表面與所述活性鱟C因子發生酶切反應，電極表面的電化學性質被改變；隨後取出電極，插入到另一含電化學活性物質的電解液中，測該電極對所述電解液的電化學響應值；
[0014]步驟3)配製至少三個含特定濃度的內毒素標準液，按照步驟I)和2)進行操作後得到相應的至少三組電化學響應值，並將所得電化學響應值繪成標準曲線；將步驟2)中所得電化學響應值與所述標準曲線進行比對，從而得出所述待測液體的內毒素含量；[0015]步驟I)中所用鱟C因子是採用基因重組的方法製得。
[0016]優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，步驟I)中所用鱟C因子是採用以下方法製得:從鱟的血液中提取出RNA，逆轉錄出鱟C因子的DNA，在原核表達系統或真核表達系統中重組表達出鱟C因子，並對重組表達出的鱟C因子進行純化。
[0017]優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，重組表達出的鱟C因子採用透析法、超濾法、鹽析法、密度梯度離心法、電泳法、離子交換層析法、親和層析法或低溫有機溶劑沉澱法中的任意一種方法進行純化。
[0018]優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，步驟2)中所用電極在插入到所述混合液之前，電極表面修飾有包含鱟三肽的多肽序列。
[0019]優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述多肽序列所含胺基酸數量為5?50個；所述多肽序列配成溶液修飾到電極表面上，所述多肽序列的濃度為0.1 μ M?IOOmM;修飾電極的方法採用吸附固定法、共價鍵合法或交聯法中的任意一種。
[0020]優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述電極為金電極或碳電極。
[0021 ] 優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述電解液中電化學活性物質選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物、吩惡嗪衍生物或具有電化學性質的納米材料中的任意一種，所述電解液中電化學活性物質的濃度為0.1mM?lOOmM。
[0022]優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，測試電化學響應所用方法選自循環伏安法、計時電量法或示差脈衝伏安法中的任意一種。
[0023]優選地，所述的檢測液體中內毒素含量的方法，所述電極表面的反應溫度為37.0±1°C，所述酶切反應的反應時間為IOmin?3h。
[0024]本發明的有益效果是:通過電化學過程檢測出內毒素的濃度，不受樣品顏色的幹擾，不使用鱟試劑，有效地降低了成本，緩解了部分生態壓力，還避免了傳統鱟試劑反應中G因子旁路的幹擾。同時，使用基因工程的方法，保證了檢測方法中試劑批次間的均一性，有利於產業化生產，適合於環境監測、藥廠質量控制、醫療器械熱原監測等領域。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為本發明所述內毒素檢測的工作原理示意圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
[0027]鑑於內毒素定量檢測的重大意義，以及現階段檢測技術的缺陷，本發明提供了一種檢測液體中內毒素含量的新方法。具體地講，參見圖1，本發明通過特定的方法，將含有鱟三肽的多肽序列固定到電極表面，當樣品中存在內毒素時，會激活重組表達的鱟C因子，後者可特異性地將鱟三肽切斷，從而改變了電極表面的電化學性質，即可利用電化學工作站或者其他檢測設備，檢測到電信號在加入樣品前後的變化。不同濃度的內毒素加入體系後，得到的電信號會有差異，從而實現對內毒素濃度的定量標定。
[0028]作為本發明的一個較優實施方案，其所涉及的內毒素檢測方法可通過如下步驟實現:[0029]I)從鱟血液中提取RNA，人工合成引物，使用逆轉錄試劑盒得到鱟C因子的cDNA。
[0030]2)採用基因工程的手段，將cDNA裝載入原核表達載體或真核表達載體中，重組表達出鱟C因子，並進一步優化表達條件。
[0031]3)利用透析法、超濾法、鹽析法、密度梯度離心法、電泳法、離子交換層析法、親和層析法或低溫有機溶劑沉澱法中的任意一種方法純化重組鱟C因子，優選為採用親和層析的方法純化重組鱟C因子；並使用蛋白質印跡法進行鑑定。
[0032]4)將鱟C因子配成飽和水溶液，隨後與待測液體混合，得到一混合液，待測液體中的內毒素能夠激活鱟C因子，產生活性鱟C因子。
[0033]5)人工合成包含鱟三肽的多肽序列並將其修飾到電極表面上,多肽序列的C端設計為半胱氨酸，多肽序列所含胺基酸數量為5?50個，優選為20?30個；先將多肽序列配成溶液再修飾到電極表面上，多肽序列的濃度優選為0.1 μ M?IOOmM ;將多肽序列採用吸附固定法、共價鍵合法或交聯法中的任意一種修飾到電極上，優選為採用共價鍵合法；電極可以是金電極或碳電極，優選為金電極。
[0034]6)將經過修飾的電極插入到混合液中，電極表面與活性鱟C因子發生酶切反應，電極表面的電化學性質被改變。酶切反應的反應時間為IOmin?3h，優選為1.5h，酶切反應結束後用雙蒸水清洗電極表面。
[0035]7)採用三電極系統，在含電化學活性物質的電解液中測試電極對電解液的電化學響應值，一般地，可測定電流與電壓關係變化圖，或電流與時間關係變化圖，或電量與時間關係變化圖。在本案中，電解液中電化學活性物質選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物、吩惡嗪衍生物或具有電化學性質的納米材料中的任意一種，電解液中電化學活性物質的濃度為0.1mM?IOOmM ;電解液優選為鐵氰化鉀溶液，其中鐵氰化鉀的濃度優選為50mM。測試電化學響應所用方法選自循環伏安法、計時電量法或示差脈衝伏安法中的任意一種。
[0036]8)配製至少三個含特定濃度的內毒素標準液，按照步驟6)和7)進行操作後得到相應的至少三組電化學響應值，並將所得電化學響應值繪成標準曲線；將步驟7)中所得電化學響應值與標準曲線進行比對，從而得出待測液體中的內毒素含量。
[0037]值得注意的是，在以上整個操作步驟裡，電極表面的反應溫度均優選為37.0±1。。。
[0038]實施例1
[0039]I)從鱟血液中提取RNA，人工合成引物，使用逆轉錄試劑盒得到鱟C因子的cDNA。
[0040]2)採用基因工程的手段，將cDNA裝載入酵母表達載體中，重組表達出鱟C因子，並進一步優化表達條件。
[0041]3)利用親和層析法純化重組表達的鱟C因子，並使用蛋白質印跡法進行鑑定。
[0042]4)將鱟C因子配成飽和水溶液，隨後與待測液體混合，得到一混合液，待測液體中的內毒素能夠激活鱟C因子，產生活性鱟C因子。
[0043]5)人工合成包含鱟三肽的多肽序列並將其修飾到電極表面上,多肽序列的C端設計為半胱氨酸，多肽序列所含胺基酸數量為25個；先將多肽序列配成溶液再修飾到電極表面上，多肽序列的濃度為50mM ;將多肽序列採用共價鍵合法修飾到電極上；電極為金電極。
[0044]6)將經過修飾的電極插入到混合液中，電極表面與活性鱟C因子發生酶切反應，電極表面的電化學性質被改變。電極表面的反應溫度為37.0±1°C,酶切反應的反應時間為1.5h，酶切反應結束後用雙蒸水清洗電極表面。
[0045]7)採用三電極系統，在含電化學活性物質的電解液中測試電極對電解液的電化學響應值，本實施例中測定的是電流與電壓關係變化圖。電解液中電化學活性物質是鐵氰化鉀，其濃度為50mM。測試電化學響應所用方法為循環伏安法。
[0046]8)配製五個含特定濃度的內毒素標準液，按照步驟6)和7)進行操作後得到相應的五組電化學響應值，並將所得電化學響應值繪成標準曲線；將步驟7)中所得電化學響應值與標準曲線進行比對，從而得出待測液體中的內毒素含量。
[0047]實施例2
[0048]I)從鱟血液中提取RNA，人工合成引物，使用逆轉錄試劑盒得到鱟C因子的cDNA。
[0049]2)採用基因工程的手段，將cDNA裝載入昆蟲表達載體中，重組表達出鱟C因子，並進一步優化表達條件。
[0050]3)利用離子交換層析法純化重組表達的鱟C因子，並使用蛋白質印跡法進行鑑定。
[0051]4)將鱟C因子配成飽和水溶液，隨後與待測液體混合，得到一混合液，待測液體中的內毒素能夠激活鱟C因子，產生活性鱟C因子。
[0052]5)人工合成包含鱟三肽的多肽序列並將其修飾到電極表面上,多肽序列的C端設計為半胱氨酸，多肽序列所含胺基酸數量為5個；先將多肽序列配成溶液再修飾到電極表面上，多肽序列的濃度為0.1 μΜ ;將多肽序列採用吸附固定法修飾到電極上；電極為碳電極。
[0053]6)將經過修飾的電極插入到混合液中，電極表面與活性鱟C因子發生酶切反應，電極表面的電化學性質被改變。電極表面的反應溫度為37.0±1°C,酶切反應的反應時間為IOmin,酶切反應結束後用雙蒸水清洗電極表面。
[0054]7)採用三電極系統，在含電化學活性物質的電解液中測試電極對電解液的電化學響應值，本實施例中測定的是電流與時間關係變化圖。電解液中電化學活性物質是吩惡嗪衍生物，其濃度為0.1mM。測試電化學響應所用方法為示差脈衝伏安法。
[0055]8)配製三個含特定濃度的內毒素標準液，按照步驟6)和7)進行操作後得到相應的三組電化學響應值，並將所得電化學響應值繪成標準曲線；將步驟7)中所得電化學響應值與標準曲線進行比對，從而得出待測液體中的內毒素含量。
[0056]實施例3
[0057]I)從鱟血液中提取RNA，人工合成引物，使用逆轉錄試劑盒得到鱟C因子的cDNA。
[0058]2)採用基因工程的手段，將cDNA裝載入大腸桿菌表達載體中，重組表達出鱟C因子，並進一步優化表達條件。
[0059]3)利用超濾法純化重組表達的鱟C因子，並使用蛋白質印跡法進行鑑定。
[0060]4)將鱟C因子配成飽和水溶液，隨後與待測液體混合，得到一混合液，待測液體中的內毒素能夠激活鱟C因子，產生活性鱟C因子。
[0061]5)人工合成包含鱟三肽的多肽序列並將其修飾到電極表面上，多肽序列的C端設計為半胱氨酸，多肽序列所含胺基酸數量為50個；先將多肽序列配成溶液再修飾到電極表面上，多肽序列的濃度為IOOmM;將多肽序列採用交聯法修飾到電極上；電極為金電極。
[0062]6)將經過修飾的電極插入到混合液中，電極表面與活性鱟C因子發生酶切反應，電極表面的電化學性質被改變。電極表面的反應溫度為37.0± I °C，酶切反應的反應時間為3h，酶切反應結束後用雙蒸水清洗電極表面。
[0063]7)採用三電極系統，在含電化學活性物質的電解液中測試電極對電解液的電化學響應值，本實施例中測定的是電量與時間關係變化圖。電解液中電化學活性物質是亞鐵氰化鉀，其濃度為lOOmM。測試電化學響應所用方法為計時電量法。
[0064]8)配製七個含特定濃度的內毒素標準液，按照步驟6)和7)進行操作後得到相應的七組電化學響應值，並將所得電化學響應值繪成標準曲線；將步驟7)中所得電化學響應值與標準曲線進行比對，從而得出待測液體中的內毒素含量。
[0065]儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種檢測液體中內毒素含量的方法，包括以下步驟: 步驟I)將含飽和鱟C因子的水溶液加入到待測液體中，得到一混合液，待測液體中的內毒素能夠激活所述鱟C因子，產生活性鱟C因子； 步驟2)將經過修飾的電極插入到所述混合液中，電極表面與所述活性鱟C因子發生酶切反應，電極表面的電化學性質被改變；隨後取出電極，插入到另一含電化學活性物質的電解液中，測該電極對所述電解液的電化學響應值； 步驟3)配製至少三個含特定濃度的內毒素標準液，按照步驟I)和2)進行操作後得到相應的至少三組電化學響應值，並將所得電化學響應值繪成標準曲線；將步驟2)中所得電化學響應值與所述標準曲線進行比對，從而得出所述待測液體的內毒素含量； 其特徵在於，步驟I)中所用鱟C因子是採用基因重組的方法製得。
2.根據權利要求1所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，步驟I)中所用鱟C因子是採用以下方法製得:從鱟的血液中提取出RNA，逆轉錄出鱟C因子的DNA，在原核表達系統或真核表達系統中重組表達出鱟C因子，並對重組表達出的鱟C因子進行純化。
3.根據權利要求2所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，重組表達出的鱟C因子採用透析法、超濾法、鹽析法、密度梯度離心法、電泳法、離子交換層析法、親和層析法或低溫有機溶劑沉澱法中的任意一種方法進行純化。
4.根據權利要求1所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，步驟2)中所用電極在插入到所述混合液之前，電極表面修飾有包含鱟三肽的多肽序列。
5.根據權利要求4所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，所述多肽序列所含胺基酸數量為5?50個；所述多肽序列配成溶液修飾到電極表面上，所述多肽序列的濃度為0.1 μ M?IOOmM ;修飾電極的方法採用吸附固定法、共價鍵合法或交聯法中的任意一種。
6.根據權利要求1所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，所述電極為金電極或碳電極。
7.根據權利要求1所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，所述電解液中電化學活性物質選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物、吩惡嗪衍生物或具有電化學性質的納米材料中的任意一種，所述電解液中電化學活性物質的濃度為0.1mM?lOOmM。
8.根據權利要求7所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，測試電化學響應所用方法選自循環伏安法、計時電量法或示差脈衝伏安法中的任意一種。
9.根據權利要求1?8中任何一項所述的檢測液體中內毒素含量的方法，其特徵在於，所述電極表面的反應溫度為37.0±1°C，所述酶切反應的反應時間為IOmin?3h。
【文檔編號】G01N27/26GK103675051SQ201310712306
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】繆鵬, 王弼陡, 羅剛銀, 錢慶, 王鍾周, 程文播 申請人:中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所