提高毛細管區帶電泳靈敏度的方法和儀器的製作方法

2023-06-14 23:52:01 2

專利名稱：提高毛細管區帶電泳靈敏度的方法和儀器的製作方法
技術領域：
10002本發明涉及提高毛細管區帶電泳(CZE)靈敏度的新方法和儀 器。本發明尤其關注由包括在線溶膠-凝膠柱的通道組成的可以濃縮 毛細管電泳樣品的儀器，以及使用該儀器提高毛細管區帶電泳的靈敏 度。
背景技術：
00031對生物分子包括蛋白質、多肽和DNA進行分析的需求日益增 長。毛細管電泳(CE)是一種基於分子的大小和電荷進行分離的方 法。在毛細管電泳中，分子進入液體填充的毛細管並受到電場的作用 (見Kemp， G. (1998) "Capillary electrophoresis: a versatile family
of analytical techniques (毛細管電泳 一類多功能分析技術)，"
Biotechnol. Appl. Biochem. 27:9—17; Wu, D.爭.(1992)。 Schwartz, H等 人對毛細管電泳技術進行了綜述("Separation of Proteins and Peptides by Capillary Electrophoresis: Application to Analytical Biotechnology (蛋白和肽的毛細管電泳分離分析型生物及栓的應 用)，"Beckman BioResearch Literature No. 727484)。
高峰容量(即，每單位時間可分離的峰數)使CZE成為一種分 析各種生物分子的有效方法，包括蛋白質和多肽(Kasicka, V. (2004) "Recent Advances In Capillary Electrophoresis And Capillary Electrochromatography Of Peptides (肽的毛細管電泳和毛細管色 語新進展),"Electrophoresis 24(22-23):4013-4046; Kasicka, V. (2001) "Recent Advances In Capillary Electrophoresis Of Peptides (肽的 毛細管電泳新進展)，，，Electrophoresis 22(19):4139-4162; Bossuyt, X. (2003) "Separation Of Serum Proteins By Automated Capillary Zone Electrophoresis (自動毛細管區帶電泳對血清蛋白的分離)，" Clin Chem Lab Med. 41(6):762-772); Monton, M.R. (2005) "Recent Developments In Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry Of Proteins And Peptides (蛋白和肽的毛細管電泳質語新進展)，" Anal Sci. 21(1):5-13);核酸分子(Mitchelson， K.R. (2001) "THE Application Of Capillary Electrophoresis For DNA Polymorphism Analysis (毛細管電泳分析DNA多形性的應用)，" Methods Mol Biol. 162:3-26);藥物(Hilhorst， M.J 等(2001) "CAPILLARY
Electro腿etic Separation Techniques For Profiling Of Drugs And Related Products (藥物及相關產物圖譜的毛細管電動力學分 離技術)，，，Electrophoresis 22(12):2542-2564)，農業化合物(Menzinger, F.等(2000) "Analysis Of Agrochemicals By Capillary Electrophoresis (農業化學品的毛細管電泳分析),"j Chromatogr A. 891(1):45-67)甚至細菌和病毒(Kremser, L.等(2004) "capillary Electrophoresis Of Biological Particles: Viruses, Bacteria, And EukaryoticCells (生物學顆粒的毛細管電泳分析病毒、細菌和真 核生物細胞)，"Electrophoresis 25(14).'2282-2291)。0011|雖然CZE具有許多優點，但是CZE基於濃度的檢測限遠小於 HPLC並且還不足以滿足很多實際應用的要求。CZE的局限性反應出 毛細管筒流動室中極短(通常是HPLC流動室路徑長度的1%)的毛 細管內路徑長度(即，檢測窗)。較短的路徑長度意味著必須有更高 的分析物濃度才可以被檢測到(Shihabi, Z.K. (2000) "STACKINGIn Capillary Zone Electrophoresis (毛細管區帶電泳中的堆疊)，"j Chromatogr A. 902(1): 107-117)。因此，雖然已有之前的這些進展但是我們仍然需要可以解決分 析低濃度樣品中存在的問題並且使CET可應用於分析低濃度樣品的 方法和儀器。 發明概述
0018j詳細而言，本發明提供了一種包含由含有色譜吸附顆粒的聚合 烷基矽酸鹽凝膠基質塊材料形成的毛細管筒的通道的溶膠-凝膠濃縮 裝置，該裝置中的凝膠基質在允許溶劑蒸發而不影響該塊材料穩定性 的條件下聚合。
10019j本發明尤其關注這種溶膠-凝膠濃縮裝置的應用，這種裝置中的 通道可以是一種微通道、 一種毛細管筒或一種柱子等。本發明尤其關 注這樣一種裝置的應用，其中的凝膠基質在毛細管筒中聚合，該毛細 管筒與多孔玻璃粘結並且微通道包埋在碎片或板中。
本發明尤其關注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應用，其中的分 步、多步溫育包括在適於促進矽膠塊材料聚合併不引起溶劑顯著蒸發 的條件下加熱，然後在足以促進溶劑從聚合矽膠塊材料中揮發的條件
下溫育，然後在足以固化烷基矽酸鹽凝膠基質的條件下溫育。本發明 尤其關注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應用，其中該裝置應用於分 析或製備過程以促進對樣品中分析物的濃縮。
10022本發明還關注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應用，其中的分析 或製備方法選自液相色譜、毛細管區帶電泳、毛細管電泳、毛細管電 色譜法、反相色譜法、離子交換色譜、吸附色i普和正相色譜。(J023I本發明尤其關注這樣一種溶膠-凝膠濃縮裝置的應用，其中的分 析或製備方法選自免疫測定法和酶促反應，並且/或其中的分析物選 自蛋白質、肽、核酸分子、藥物、農業化合物、細菌和病毒。 |00241本發明還進一 步提供了濃縮分析或製備過程中樣品分析物的方 法，其中該方法包括使用由含有色鐠吸附顆粒的聚合烷基矽酸鹽凝膠 基質組成的溶膠-凝膠濃縮裝濃縮分析物，其中所述凝膠基質在足以 允許溶劑揮發而且不顯著影響矽膠塊材料穩定性的條件下聚合。
本發明尤其關注這樣一些方法的應用，其中所述裝置被應用於 分析或製備方法中以促進對樣品分析物的濃縮。 100281本發明還關注這樣一些方法的應用，其中的分析或製備方法選 自液相色譜、毛細管區帶電泳、毛細管電泳、毛細管電色譜法、反相 色謙法、離子交換色語(CEC)、吸附色譜和正相色譜。
本發明的組合物和方法也尤其適用於使用微型通道的分析方 法。下列文章中描述了形成和使用微型通道的方法Backhouse, C.J. 等(2003) ("Improved Resolution With Microchip-Based Enhanced Field Inversion Electrophoresis, Electrophoresis 24(11): 1777-1786), Bharadwaj, R.等(2002) ("Design And Optimization Of On-Chip Capillary Electrophoresis, Electrophoresis 23(16):2729-2744), Bromberg, A.等(2004) ("Multichannel Homogeneous Immunoassay For Detection Of 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) Using
A MlCROFABRICATED CAPILLARY ARRAY ELECTROPHORESIS CHIP,
Electrophoresis 25(12): 1895-1900), Chen, G.等(2004) ("Fast And Simple Sample Introduction For Capillary Electrophoresis Microsystems, Analyst 129(6):507-511 (Epub 2004 Apr 20》，Chen, S.H.等(2002) ("Flow-Through Sampling For Electrophoresis-Based Microchips And Their Applications For Protein Analysis, Anal. Chem. 74(19): 5146-5153), Doherty, E.A.等
(2003) ("MICROCHANNEL WALL COATINGS FOR PROTEIN SEPARATIONS
By Capillary And Chip Electrophoresis, Electrophoresis 24(l-2):34-54), Du, Y,等(2005) ("MICROCHIP CAPILLARY Electrophoresis With Solid-State Electrochemiluminescence Detector, Anal. Chem. 77(24):7993-7997), Futterer, C.等(2004) ("Injection And Flow Control System For Microchannels, Lab Chip. 4(4):351-356 (Epub 2004 May 11》，Griffiths, S.K.等(2002) ("Design And Analysis Of Folded Channels For Chip-Based Separations, Anal. Chem. 74(13):2960-2967)， Hong, J.W.等(2001)
("MlCROFABRICATED POLYMER CHIP FOR CAPILLARY GEL
Electrophoresis, Biotechnol. Prog. 17(5):958匿962), Jung, B.等(2006)("On-Chip Mill腿fold Sample Stacking Using Transient ISOTACHOPHORESIS, Anal. Chem. 78(7):2319-2327)， Lee, G.B.等(2005) ("On The Surface Modification Of Microchannels For Microcapillary Electrophoresis Chips, Electrophoresis 26(24):4616-4624), Li, H.F.等(2004) ("A COMPACTLY INTEGRATED Laser-Induced Fluorescence Detector For Microchip Electrophoresis, Electrophoresis 25(12): 1907-1915)， Li, M.W.等 (2006) ("Design And Characterization Of Poly(Dmethylsiloxane)-Based Valves For Interfacing Continuous-Flow Sampling To Microchip Electrophoresis, Anal Chem. 78(4):1042-1051), Lichtenberg, J.等(2002) ("AMiCROCHiP Electrophoresis System With Integrated In-Plane Electrodes For Contactless Conductivity Detection, Electrophoresis 23(21):3769-3780), Liu, J.等(2004) ("Surface-Modified
Microchips For Protein And Peptide Analysis, Anal. Chem. 76(23):6948-6955), Liu, Y.等(2005) ("Stacking Due To Ionic Transport Number Mismatch During Sample Sweeping On Microchips, Lab Chip 5(4):457-465 (Epub 2005 Mar 7》，Pallandre, A. 等(2006) ("Surface Treatment And Characterization: Perspectives To Electrophoresis And Lab-On-Chips, Electrophoresis 27(3):584-610), Petsev, D.N.等(2005) ("MICROCHANNEL PROTEIN Separation By Electric Field Gradient Focusing, Lab Chip 5(6):587-597 (Epub 2005 Apr 15》，Richards, P.等(2002) ("FUNCTIONAL Proteomics Using MicroChannel Plate Detectors," Proteomics, 2(3):256-261), Rossier,丄等(2002) ("POLYMER MICROFLUIDIC CHIPS For Electrochemical And Biochemical Analyses, Electrophoresis 23(6):858-867), Scherer,丄R.等(2001) ("High-Pressure Gel Loader
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For Gapillary Array Electrophoresis MicroChannel Plates, Biotechniques31(5):1150畫1152, 1154), Wang, K.等(2006) C'Microchannel-Electrode Alignment And Separation Parameters Comparison In Microchip Capillary Electrophoresis By Scanning Electrochemical Microscopy, J. Chromatogr. A. 1110(l-2):222-226 (Epub 2006 Feb 3》，and Xuan, X.等(2005) ("Accelerated Particle Electrophoretic Motion And Separation In Converging-Diverging Microchannels, Anal. Chem. 77(14):4323-4328)。
|00601本發明的組合物和方法也可與分析過程(例如，免疫分析等； 參見美國專利5,863,401 )協同使用，從而達到對多種分析物的同時 分析。同樣的，本發明的組合物和方法也可用於定量液體中總蛋白的 各蛋白組份濃度(見美國專利號5,490,909)。在優選的實施方案中，本發明的濃縮裝置也可以對樣品脫鹽。 在高度優選的實施方案中可以調節所述濃縮裝置以同時達到對樣品 分析物的濃縮和被分析樣品的脫鹽。依據本發明，可以使用單個濃縮 裝置或多個裝置(串聯或平行排列)。使用下列填柱過程將200 pl四乙基原矽酸鹽短時渦旋溶解在 156|iil乙醇中。然後加入258 iLin.OM硝酸並旋渦混合直至溶液清澈 均勻。緩慢加入顆粒並仔細地將顆粒與溶液漩渦混合直至所有的顆粒 都被適當潤溼。短時超聲處理漿狀物質去除顆粒周圍夾帶的空氣。通 過Teflon⑧隔膜向裝有漿狀物質的管形瓶中插入毛細管直至毛細管 的末端沒入漿狀物質。使用氮氣罐調節器施加約20 lbs/in2 (psi)的壓力 直至約5-10cm的毛細管被填充了漿狀物質。
|0066]使用下列程序生成矽酸鹽溶膠-凝膠將所有的毛細管平放在烘 箱內的託盤上。在室溫下(25。C)溫育毛細管1.0小時，然後根據下列 溫度程序加熱毛細管筒400 。C加熱16-18小時，然後50°C加熱 1.0 hour,然後70。C加熱16-18小時，然後100°C加熱1小時，然 後120。C加熱2小時。
10067j圖2顯示了本發明的一個濃縮裝置。圖3顯示了使用本發明的 一個濃縮裝置進行分析物濃縮、洗脫和分離的過程。如圖3所示，在 含有所需CEZ基質的毛細管筒中安裝了一個濃縮裝置(濃縮器)。 加入樣品後樣品可以與濃縮裝置的基質結合。用洗脫緩衝液洗脫後可 以得到濃縮的樣品。施加電場後可進行電泳並將樣品分析物分離。
圖6顯示了本發明濃縮裝置分離綿羊細胞色素C (ShCytc)和豬 細胞色素C(PcCytc)消化產物的能力，這兩種樣品具有相同的胺基酸 序列。如圖6所示，用本發明的濃縮裝置進行2分鐘的預濃縮使被分 離的肽片段可以被檢測，在相同的情況下，未經預濃縮的樣品無法被 檢測。圖7顯示了使用本發明濃縮裝置分離分析物的重現性。所顯示 的為消化之前被還原和烷基化的Hcytc樣品的分離曲線。該75 p的毛 細管中含有由5pl溶膠-凝膠組成的0.5cm的塞。電泳電壓為167 v/cm, 5 kv。用0.5M的乙酸上樣然後用60%的乙腈(ACN)上樣緩衝液洗脫。 圖8顯示了分析Hcytc消化產物的重現性(7pmole ；運行76-91;進 樣於25 psi， 0.4 min)。
00721圖9顯示了本發明的方法和一義器分離酵母己糖激酶肽消化產物 的能力。使用溶膠-凝膠濃縮裝置濃縮酵母己糖激酶(5飛摩爾 (femtomole ) /pl)用於在200nm處檢測吸附。

圖10顯示了多次分析 酵母己糖激酶消化產物的重現性(10納摩爾(nanomole)/iiil;運行2-10 進樣於25psi， 0.4min)。
00731圖11顯示了使用本發明裝置可以得到的極高檢測靈敏度。使用 溶膠-凝/!交毛細管以不同的時間間隔濃縮牛己糖激酶消化產物(52 kDa MW;50飛摩爾(fentomoles) (fmoles))。曲線A表示進樣0.2 picomoles (pmoles)並用1.0 pmoles/pl洗脫得到的電泳圖。曲線B表示 進樣6.25pmoles並用89 fmoles/|Lil洗脫得到的電泳圖。曲線C表示 進樣1.25fmoles並用17.8 fmoles/pl洗脫得到的電泳圖。 [00741本說明書中提到的出版物和專利在這裡的引用相當於明確和單
獨指明將單個的出版物或專利應用在本文以文獻形式引用。
[0075J雖然本發明與特定的實施方案一起描述，應當理解的是可以對 本發明進行近一步的修改，所以本發明包括任何變體、應用或總體上 根據本發明的原理對本發明進行的調整並包括本發明所屬技術領域 已知的或常規的對本申請公開內容的偏離和對上文中提到的本質特 徵的應用。
權利要求
1.一種包含含有色譜吸附顆粒的聚合烷基矽酸鹽凝膠基質塊材料柱子形成的通道的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述凝膠基質在足以使溶劑蒸發而基本不影響所述塊材料穩定性的條件下聚合而成。
2. 權利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述裝置的通道為毛細管筒並被多孔玻璃料粘結，其中所述裝置的柱子在所述毛細管筒中 聚合。
3. 權利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述烷基矽酸鹽凝膠 基質為四乙基原矽酸鹽凝膠基質。
4. 權利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述色譜吸附顆粒為 十八烷基矽膠顆粒。
5. 權利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述溶膠-凝膠通過 分步、多步溫育聚合而成。
6. 權利要求5的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分步、多步溫育 包括在適於促進塊材料聚合而不會引起溶劑顯著蒸發的條件下加熱，固化烷基矽酸鹽凝膠基質的條件下溫育。
7. 權利要求1的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述裝置用於在分析 或製備過程中促進對樣品分析物的濃縮。
8. 權利要求7的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分析或製備過程 選自液相色語、毛細管區帶電泳、毛細管電泳、毛細管電色譜法(CEC)、反相色譜法、離子交4灸色譜、吸附色譜和正相色譜。
9. 權利要求7的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分析或製備過程 選自免疫分析法和酶促反應。
10. 權利要求7的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述分析物選自蛋 白質、肽、核酸分子、藥物、農業化合物、細菌和病毒。
11. 權利要求l的溶膠-凝膠濃縮裝置，其中所述裝置的通道為 碎片或薄板型微型通道。
12. —種濃縮分析或製備過程中的樣品中分析物的方法，其中所述方法包括使用溶膠-凝膠濃縮裝置濃縮所述分析物，所述裝置包 含含有色譜吸附顆粒的聚合烷基f圭酸鹽凝膠基質塊材料柱子形成的 通道，其中所述凝膠基質在足以使i^劑蒸發而基本不影響所述塊材料 穩定性的條件下聚合而成。
13. 權利要求12的方法，其中所述裝置在毛細管筒中聚合併被 多孔性玻璃粘結。.
14. 權利要求12的方法，其中所述烷基矽酸鹽凝膠基質為四乙 基原矽酸鹽凝膠基質。
15. 權利要求12的方法，其中所述色語吸附顆粒為十八烷基矽 膠顆粒。
16. 權利要求12的方法，其中所述溶膠-凝膠基質通過分步、 多步溫育聚合而成。
17. 權利要求16的方法，其中所述分步、多步溫育包括在適於 促進塊材料聚合而不會引起溶劑顯著蒸發的條件下加熱，然後在足以 促進溶劑從聚合塊材料中蒸發的條件下溫育，然後在足以固化烷基矽 酸鹽凝凝膠基質的條件下溫育。
18. 權利要求12的方法，其中所述裝置用於在分析或製備過程 中促進對樣品分析物的濃縮。
19. 權利要求18的方法，其中所述分析或製備過程選自液相色 譜、毛細管區帶電泳、毛細管電泳、毛細管電色譜法(CEC)、反相 色譜法、離子交換色語、吸附色譜和正相色i普。
20. 權利要求18的方法，其中所述分析或製備過程選自免疫分 析法和酶促反應。
21. 權利要求18的方法，其中所述分析物選自蛋白質、肽、核 酸分子、藥物、農業化合物、細菌和病毒。
22. 權利要求12的方法，其中所述裝置的通道為碎片或薄板型 微型通道。
全文摘要
本發明涉及提高毛細管區帶電泳(CZE)靈敏度的新方法和儀器。本發明尤其關注包含含有在線溶膠-凝膠的柱子形成的通道的用於濃縮毛細管區帶電泳樣品的裝置和本裝置提高毛細管區帶電泳的靈敏度的用途。
文檔編號G01N30/56GK101341402SQ200680030934
公開日2009年1月7日 申請日期2006年6月13日 優先權日2005年6月23日
發明者C·K·拉特納亞克, M·P·亨利 申請人:貝克曼·庫爾特公司