一種具有殺菌防腐功能的小肽及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-15 04:24:01

專利名稱：一種具有殺菌防腐功能的小肽及其製備方法和應用的製作方法
一種具有殺菌防腐功能的小肽及其製備方法和應用
技術領域：
本發明屬生物技術領域，具體涉及豬源性具有殺菌活性的小肽。本發明還涉及這 種小肽的製備方法及其在飼料防腐中的應用。
背景技術：
抗生素的發現與應用對保護人類和動物的健康作出了巨大的貢獻。但是近年來， 隨著抗生素的大量應用，導致了耐藥菌株的產生，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)禾口綠胺桿菌(Pseudomonas aeruginosaMigula)幾乎對所有抗生素都 有抗性，已成為臨床上一個嚴重的問題。抗生素作為病菌抑制劑和抗菌助長劑添加到飼料 和食品中由來已久。20世紀50年代開始，隨著抗生素的廣泛使用和人們對食品質量和環境 質量的要求不斷提高，抗生素的副作用也就日益表現出來，抗生素作為食品添加劑和防腐 劑面臨著被淘汰的局面。研究發現動物抗菌肽具有代替傳統抗生素的潛力，是近幾年開發 的一類新型飼料添加劑，(劉毅和寧正祥，1999 ；邱芳萍等，2002 ；溫劉發和何建國，2003)， 其優點主要表現在抑制微生物的生長非常迅速；抗菌譜廣，不僅對植物病原菌有強抑制 作用，而且對畜禽和水產動物的病原菌也有很強的抑制作用(金豐良等，2005 Jin et al., 2006,2007)；迄今為止，在動物中發現的抗菌肽已達200多種(Boman et al. ,2003) 目前，國內作為添加劑生產應用的主要是蠶抗菌肽AD-酵母製劑，大多數的畜禽 試驗也是圍繞這種抗菌肽進行的。溫劉發等(2001b)通過在斷奶仔豬的飼料中用抗菌肽代 替抗生素，對仔豬的腹瀉、生產性能等作了比較。結果表明，抗菌肽在仔豬斷奶應激期間抗 腹瀉效果不比抗生素差，適量的抗菌肽比抗生素促生長的效果要好，但高劑量的抗菌肽則 降低了仔豬的生長，推測造成這一現象的是高劑量的抗菌肽破壞了豬腸道內微生物種群的 平衡，降低了豬腸的免疫力。黃永彤等(2004)發現，抗菌肽對肉雞有促進生長和提高免疫 力作用，與中草藥抗生素相比，在出欄率、平均體重、飼料效率等方面均無顯著性差異，且在 出欄前3d停喂，抽檢無殘留。溫劉發等(2001a)通過飲水方式給粵黃雞添加抗菌肽的飼養 試驗結果表明，抗菌肽可促進小雞生長和減少排洩物氮含量。陳曉生等(2005a)於肉鴨日 糧中添加液體的蠶抗菌肽AD-酵母製劑發現，血清代謝激素的活動顯著增強，IGF-I濃度升 高，營養物質合成加強，尿素氮濃度顯著降低，體內氮排出減少。陳曉生等(2005b)發現抗 菌肽能使肉鴨的產肉率提高，腹脂率、內臟器官比重降低，在適當劑量時，使用效果與金黴 素基本一致。陳曉生等(2005c)發現，添加抗菌肽製劑2ml/kg能有效提高肉鴨生產性能， 尤其是小鴨階段(1 2周齡)效果顯著；23ml/kg添加量均可顯著提高產肉率。從尿素氮 和總蛋白濃度結果看，添加抗菌肽會使機體在蛋白質合成量變化不大的情況下減少機體蛋 白質的分解代謝，從而促進生長。雖然天然抗菌肽作為食品和飼料添加劑具有眾多傳統抗生素所沒有的優點，但天 然抗菌肽在動物組織中含量很少，直接從血淋巴中純化抗菌肽成本太高，得率低，工序繁 瑣，並且在應用中表現出單一天然抗菌肽抗菌活力低和抗菌譜窄等缺陷。這些都不利於抗 菌肽在食品和飼料添加劑中的廣泛應用。畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統作為近幾年新興的外源蛋白表達系統，已表現出相當大的潛力，彌補了原核系統的一些缺陷(Lin 等，2001)。Cregg等(2000)報導至今已有300多種外源蛋白在該表達系統中成功表達， Werten等(1999)已報導胞內的最高表達量為22g/L ;HasSlacher等(1997)已報導分泌胞 外的最高表達量為14.8g/L。利用酵母表達載體生產有用的蛋白質和多肽類物質顯示出良 好的前景。但是近幾年來，利用畢赤酵母表達抗菌肽也出現了一些問題，如表達的外源蛋白 被酵母本身的鹼性蛋白酶降解和表達量低等現象(陳海旭等，2001)。為保持酵母重組抗菌 肽的表達量和活性，金豐良等(2005，2006，2007)利用分子手段，以動物內源性分子為融合 伴侶，改造了酵母表達載體和酵母菌株，以此酵母系統表達抗菌肽，不僅提高了抗菌肽的表 達量，為國內最高水平(22. Og/Ι)，並保持了抗菌肽的殺菌活性，為重組抗菌肽作為飼料添 加劑的應用奠定了良好基礎。

發明內容本發明旨在提供一種殺菌活力更強、殺菌譜更廣的具有殺菌防腐功能的小肽。本發明還提供了上述小肽的製備方法。本發明還提供了上述小肽的應用。本發明所述的具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD，其胺基酸序列為KKIGKKIERV GQRVRDAVIS AAPAVDTLAK AKALGQG。本發明所述的製備上述具有殺菌防腐功能的小肽的方法，包括以下步驟(1)選擇豬小腸抗菌肽Cecropin P前11個胺基酸序列和惜古比天蠶Cecropin D 的後26個胺基酸序列設計具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD的cDNA ；(2)根據酵母偏愛的密碼子，設計引物Pl和P2，(3)進行常規鏈式聚合酶反應擴增殺菌活性肽CP-CD的cDNA ；(4)在適於表達的載體中克隆CP-⑶的基因；(5)表達質粒pPICZ α A-CP-OT在酵母細胞中的高效表達；(6)在適於表達該cDNA片段的條件下培養宿主細胞，並從中回收所需的產物。在一個優選的實施例中，步驟(2)中所述的設計引物Pl 5'-AGCCTCGAGTGGCCGCTCGAGAAAAGAAAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAGTGAGAGACGCAGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTG-3'，CTCGAG表示引入的酶切位點為Xho I，Ρ2 5' -GGCGCGGCCGCTTATCCTTGACCTAATGCCTTTGCCTTCGCGAACGTATCAACAGCTGGAGC TGCTGAGATGACTGCGTCTCTCACTCTCT-3 『，GCGGCCGC-3 『，GCGGCCG表示引入的酶切位點為 NotI。在另一個優選的實施例中，步驟(3)具體為將混合液在94°C預變性5min，然後進入下列循環94°C、40秒，55°C >40秒，72°C、 50秒，共進行35個循環，最後72°C延伸7分鐘，擴增完畢後置4°C終止反應。所述混合液組成如下含20mM Mg2+ 的 10 X PCR 緩衝液5 μ 1dATP、dTTP、dCTP、dGTP 的濃度
各為2. 5mM的dNTP混合物4 μ 1濃度為10 μ M的引物Pl4μ 1濃度為10 μ M的引物Ρ24μ 1濃度為5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1滅菌水32·5μ1在另一個優選的實施例中，步驟(4)中所述的載體為pPICZa A ；在一個更優選的 實施例中，步驟(4)具體包括(a)殺菌活性肽的獲得。為了在殺菌活性肽CP-CD的N-端不引入其它胺基酸序 列，在設計Pl和P2引物時，Pl引物引入載體PPICZaA中a-factor信號肽的四個胺基酸 (LeU、GlU、LyS、Arg)，並引入起始密碼子ATG，在P2引物引入Asn編碼，使其C端醯胺化，引 物5'端引入Xho I酶切位點，3'引入Not I酶切位點。(b)將殺菌活性肽的cDNA進行Xho I和Not I雙酶切，膠純化回收後，與經同樣酶 切回收的質粒PPICZ α A體外連接，構建酵母表達質粒pPICZ α A-CP-OT ；在另一個優選的實施例中，步驟(5)具體包括1)酵母細胞的電擊轉化用5 10 μ g線性化的pPICZ α A_CP_⑶電擊轉化KM71宿 主菌，轉化後的菌液塗布在含有50 μ g/mL Zeocin的YPDS平板，30°C倒置培養2 3天；2)高拷貝轉化子的篩選由於KM71本身就是Muts，無論怎樣重組，皆為Muts，不用 進行表型確定；3)重組酵母基因組的PCR鑑定挑取高拷貝重組酵母KM71-CP-⑶一株，在YPD上 傳代10次，以分析外源基因在菌體內的穩定性，然後接種於YPD液體培養基中，培養後提取 基因組DNA。以此DNA為模板，使用引物5' AOXl Primer, 3' AOX 1 Primer進行PCR擴 增，目的是檢查CP-⑶插入到畢赤酵母AOXl基因後的重組情況；4)CP_⑶的高效表達陽性克隆在搖瓶中進行表達，優化的表達條件為26°C，1. 0% 甲醇，誘導120h。在另一個優選的實施例中，步驟(6)中所述的宿主細胞為酵母細胞KM71 ；在一個 更優選的實施例中，步驟(6)具體包括將宿主細胞按照10 %的接種量接入三角搖瓶中，28-30°C，220-250rpm培 養18-24h後，按20 %的接種量接入50L發酵罐，在28-30 °C，450_550r/min，罐壓為 0. 05-0. 08Pa，通風量為60_80NL/min，pH = 5. 5-6. 0，溶氧量不低於45%的條件下進行發 酵，在培養24h時加入體積比為0. 6%的甲醇進行誘導發酵表達72h。然後通入100°C蒸汽 20min對發酵液進行滅菌，60°C噴霧乾燥得到CP-⑶蛋白的粗製品。本發明所述的具有殺菌防腐功能的小肽的應用，是該小肽在製備殺菌性乳豬飼料 的添加劑中的應用。在一個優選的實施例中，所述的小肽的添加比例為基礎飼料重量的1% 5%。本發明以豬小腸中抗菌肽Cecropin P和惜古比天蠶Cecropin D為藍本，利用基 因工程的方法篩選出殺菌活力更強、殺菌譜更廣的抗菌肽CP-CD，並在以動物內源性分子作 為伴侶的酵母表達載體中獲得高效表達。將表達產物添加到乳豬飼料中，能增強了豬飼料 的抗菌防腐、並增加豬飼料的利用率；抑制了外來病原微生物對豬的侵染，維持了豬腸內益 生菌生態的平衡，提高了豬自身的免疫力。本發明開發的綠色、健康、環保的新型飼料添加劑，可以廣發應用到畜禽的養殖中。
圖1是pPICZ α A物理譜圖；圖2是殺菌活性肽CP-⑶的PCR結果圖；其中，M為 DL2000Marker I，1 為 CP-CD 為擴增片段圖3是重組表達質粒pPICZ α ACP⑶的表達框架；圖4是重組表達質粒pPICZ α ACP⑶的構建示意圖；圖5是重組酵母ΚΜ71-CP⑶的PCR結果圖，1，2為陽性重組子，3為質粒空白對照， M 為 DL2000Marker I ；圖6是表達上清對大腸桿菌的殺菌活性分析；圖7是重組蛋白CP-CD對E. clli K12D31 (A)和S. aureus (B)的活性檢測圖。具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 於此。實施例殺菌活性肽CP-CD在畢赤酵母中的高效表達1)重組表達質粒pPICZ α A-CP-⑶的構建(1) CP-CD序列的擴增(a)根據豬小腸cecropin P(I-Il)的胺基酸序列和惜古比天蠶 CecropinD (12-37)的胺基酸序列設計殺菌活性肽的cDNA ；(b)根據酵母偏愛的密碼子，設計引物Pl和P2，Pl 5'-AGCCTCGAGTGGCCGCTCGAGAAAAGAAAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAGTGAGAGACGCAGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTG-3'(黑斜體表示引入的酶切位點為Xho I),P2 5' -GGCGCGGCCGCTTATCCTTGACCTAATGCCTTTGCCTTCGCGAACGTATCAACAGCTGGAGC TGCTGAGATGACTGCGTCTCTCACTCTCT-3'，GCGGCCGC-3'(黑斜體表示引入的酶切位點為 Not I)；由上海英俊生物技術有限公司合成，使用前用ddH20稀釋至10 μ Μ。(c)進行常規鏈式聚合酶反應擴增重組抗菌肽。以Pl和Ρ2互為模板互為引物，以高保真DNA聚合酶(Pyrobest DNAPolymerase) 進行 PCR，CP-CD 的 PCR 反應條件50 μ 1 體系中含有 10 XPCRbuffer (含 20mM Mg2+) 5 μ 1, dNTP mixtures (各 2. 5mM)4y 1，Pl (10 μ Μ) 4 μ 1，P2 (10 μ Μ) 4 μ 1，高保真 DNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 5 μ 1，ddH20 32. 5 μ 1 ；將混合液在94°C預變性5min，然後進入下列循環:94°C、40 秒，5540秒，7250秒，共進行35個循環，最後72°C延伸7分鐘，擴增完畢後置4°C終 止反應。得到 CP-CD cDNA 序列(AAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAGTGAGAGACGC AGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTGTTGATACGTTCGCGAAGGCAAAGGCATTAGGTCAAGGATAA)。PCR 產物用質 量分數為1. 2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，在120bp附近存在單一的目標條帶，結果如圖2，表明實驗獲得了與預期相符的特異DNA片段即重組抗菌肽的cDNA。所述混合液組成如下含20mM Mg2+ 的 10 X PCR 緩衝液5 μ 1dNTP 混合物(濃度為 2. 5mM 的 dATP，dTTP, dCTP, dGTP) 4 μ 1濃度為10 μ M的引物Pl4μ 1濃度為10 μ M的引物Ρ24μ 1濃度為5U/ μ 1的高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1滅菌水32. 5 μ 1。(2)重組表達質粒pPICZ α A_CP_CD的構建由於抗菌肽N端對抗菌活性相當重要，N端額外添加胺基酸會導致抗菌肽活性顯 著降低(Cabral et al. ,2003 ；Li et al.，2005)。因此在設計引物時，上遊引物引入載體 pPICZaA中a-factor信號肽的四個胺基酸(Leu、Glu、Lys、Arg)，並引入起始密碼子ATG， 在下遊引物引入Asn編碼，使其碳端醯胺化，引物5'端引入Xho I酶切位點，3'引入Not I酶切位點。使CP-⑶基因位於α -factor信號肽下遊，插入到載體pPICZ α A相應的窗口， CP-⑶序列與載體上的myc序列及6His序列融合，表達的重組CP-⑶羧基末端將帶有c-myc 表原和6His，而且α-factor可引導CP-CD分泌到細胞外，而α-factor在引導CP-CD蛋白 分泌過程中，被酵母本身的KEX2酶在Leu Glu Lys Arg (KEX2識別位點)處被切下，可以使 表達的CP-⑶保持天然N端，達框架如圖3所示。將膠純化回收後CP-⑶PCR產物即重組殺菌活性肽的cDNA進行Xho I和Not I雙酶切，膠純化回收後，與經同樣酶切回收的質粒PQEUBI體外連接，構建重組表達質粒 pPICZ α ACP⑶。電擊轉化ΚΜ71，在含有25 μ g/mL Zeocin平板上篩選陽性的重組質粒。陽 性重組質粒的提取，酶切和PCR鑑定均按文獻(Sambrook et al.，1989)進行。將酶切和 PCR鑑定正確的重組質粒送上海英俊生物技術有限公司進行序列測定。表達質粒的構建過 程如圖4。(3)重組表達質粒的酶切鑑定在含有25 μ g/mL Zeocin平板上篩選陽性的重組質粒pPICZ α ACP⑶，抽提重組質 粒DNA，進行雙酶切分析，並同時設空載體做雙酶切對照，酶切產物經1. 2%瓊脂糖凝膠電 泳檢測。(4)重組表達質粒的PCR鑑定以酶切鑑定為陽性的重組質粒DNA為模板，分別用pPICZ α A測序引物5' AOXl Primer和3 『 AOXl Primer及Pl和P2為引物，進行PCR反應，同時設空載做對照，比較PCR
產物的差異。(5)重組表達質粒的序列測定取經雙酶切和PCR鑑定正確的陽性重組菌株，送上海英俊生物有限公司進行序列 測定，測序結果正確。2)誘導表達產物的Tricine-SDS-PAGE分析(1)酵母細胞的電擊轉化及高拷貝轉化子的篩選用5 10 μ g線性化的pPICZ α A-CP-OT電擊轉化ΚΜ71宿主菌，轉化後的菌液塗布 在分別含有25 μ g/mL Zeocin和100 μ g/mL Zeocin的YPDS平板。30°C倒置培養2 3天。結果發現，電擊轉化KM71時，使用25 μ g/mL Zeocin的YPDS，轉化效率明顯高於100 μ g/mL Zeocin YPDS。KM71在四個平板上都獲得約50 60個左右的轉化子。用5 10 μ g線性 化的PPICZ α A空載體電擊轉化KM71的結果相似。(2)重組酵母基因組的PCR鑑定挑取高拷貝重組酵母KM71-CP⑶一株，在YPD上傳代10次，以分析外源基因在菌 體內的穩定性，然後接種於YPD液體培養基中，培養後提取基因組DNA。以此DNA為模板，使 用引物5' AOXl Primer, 3' AOXl Primer進行PCR擴增，目的是檢查CP-⑶插入到畢赤酵 母AOXl基因後的重組情況。以上操作同時用空載體轉化的重組酵母作對照，結果如圖5。(3)甲醇表型對CP-⑶表達的影響陽性克隆在搖瓶中小量表達，甲醇誘導120h後，分別取Muts和Mut+甲醇表型重組 菌株的誘導表達上清，經Tricine-SDS-PAGE電泳檢測，表明CP-⑶在Muts菌株中的表達量 遠高於Mut+菌株。因而，我們選取Muts重組菌株用做以後表達及純化的研究。Muts表型菌 株由於AOXl基因的缺失，其代謝甲醇的速度較慢。相應，Muts表型菌株在以甲醇為碳源生 長時，需氧量少於Mut+表型菌株。Mut+在高密度生長時，需要通以氧氣以維持生長的需要。 因此Muts表型菌株更適合在實驗室中規模高密度培養。3)表達產物的檢測(1) CP-⑶表達上清的生物活性檢測將重組酵母CP-⑶進行搖瓶發酵，以1. 0% (ν/ν)甲醇誘導，分別於誘導後每隔 24h取60yL發酵上清液置於-20°C保存備用。從中取出10 μ L發酵上清液，以E. coli K12D31為指示菌，採用瓊脂孔穴平板擴散法測定表達產物抑菌活性，用空載體轉化做陰性對 照，37°C過夜培養，結果如圖6所示。4) CP-CD蛋白製品的製備(1)重組抗菌肽CP-⑶的生物活性檢測重組蛋白CP-⑶的凍乾粉用滅菌ddH20溶解成1 μ g/ml的溶液，以E. ColiK12D31和 S. aureus為指示菌，採用瓊脂孔穴平板擴散法測定表達產物抑菌活性，以1 μ g/ml氨苄青 黴素為陽性對照，以滅菌ddH20作為陰性對照，37°C過夜培養，結果如圖7。(2)重組蛋白的殺菌譜測定將純化的重組抗菌肽CP-⑶用0.01%的乙酸和0.2%牛血清白蛋白1/2倍梯度 稀釋，對其殺菌的廣譜性及最小抑制濃度進行了測定，結果殺菌活性肽CP-CD具有相類似 的抗菌活力和抗菌譜，都具有廣譜抗菌性，不僅對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有廣譜 的抗性，而且對真菌也有一定的抑制作用。CP-CD對大腸桿菌豬霍亂沙門氏菌和豬霍亂沙 門氏菌的MIC分別為1.7μΜ和1.6μΜ。對一些真菌有較強的抑制作用，如灰黴菌(MIC = 14. 0 μ Μ)、青黴菌(MIC = 11. 3 μ Μ)、黑腐菌(MIC = 16. 8 μ Μ)，為殺菌活性肽CP-CD在豬病 害上的應用奠定了基礎。(3)重組蛋白的發酵將以上步驟中篩選到的具有高拷貝數且殺菌活力強的重組酵母KM71-CP-⑶菌 株，經活化後，按照10%的接種量接入三角搖瓶中，28-300C，220-250rpm培養18_24h後，按 20 %的接種量接入50L發酵罐，在28-30°C，450_550r/min，罐壓為0. 05-0. 08Pa,通風量為 60-80NL/min,pH = 5. 5-6. 0，溶氧量不低於45%的條件下進行發酵，在培養24h時加入體積比為0. 6%的甲醇進行誘導發酵表達72h。然後通入100°C蒸汽20min對發酵液進行滅菌， 600C噴霧乾燥得到CP-⑶蛋白的粗製品。(4)抗菌肽CP-CD製品在乳豬飼料中的應用將CP-⑶的蛋白製品添加到乳豬飼料中，添加比例為基礎飼料重量的 5%。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種具有殺菌防腐功能的小肽，其特徵在於所述的小肽CP CD的胺基酸序列為KKIGKKIERV GQRVRDAVIS AAPAVDTLAK AKALGQG。
2.製備如權利要求1所述的具有殺菌防腐功能的小肽的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)選擇豬小腸抗菌肽CecropinP前11個胺基酸序列和惜古比天蠶Cecropin D的後 26個胺基酸序列設計具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD的cDNA ；(2)根據酵母偏愛的密碼子，設計引物Pl和P2，(3)進行常規鏈式聚合酶反應擴增殺菌活性肽CP-CD的cDNA；(4)在適於表達的載體中克隆CP-⑶的基因；(5)表達質粒pPICZα A-CP-⑶在酵母細胞中的高效表達；(6)在適於表達該cDNA片段的條件下培養宿主細胞，並從中回收所需的產物。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的設計引物Pl 5' AGCCTCGAGTGGCCGCTCGAGAAAAGAAAGAAGATCGGCAAGAAGATTGAGAGAGTCGGACAGAGAG TGAGAGACGCAGTCATCTCAGCAGCTCCAGCTG-3'，CTCGAG 表示引入的酶切位點為 Xho I，Ρ2 5' -GGCGCGGCCGCTTATCCTTGACCTAATGCCTTTGCCTTCGCGAACGTATCAACAGCTGGAGCTGCT GAGATGACTGCGTCTCTCACTCTCT-3『，GCGGCCGC 表示引入的酶切位點為 Not I。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的載體為pPICZα A。
5.如權利要求2或4所述的方法，其特徵在於步驟(4)包括(a)殺菌活性肽的獲得。為了在殺菌活性肽CP-CD的N-端不引入其它胺基酸序列，在 設計Pl和P2引物時，Pl引物引入載體pPICZaA中a-factor信號肽的四個胺基酸(Leu、 Glu、LyS、Arg)，並引入起始密碼子ATG，在P2引物引入Asn編碼，使其C端醯胺化，引物5 『 端引入Xho I酶切位點，3'引入Not I酶切位點。(b)將殺菌活性肽的cDNA進行XhoI和Not I雙酶切，膠純化回收後，與經同樣酶切回 收的質粒pPICZ α A體外連接，構建酵母表達質粒pPICZ α A-CP-OT ；
6.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述的宿主細胞為酵母細胞ΚΜ71。
7.如權利要求2或6所述的方法，其中步驟(6)包括將宿主細胞按照10%的接種量 接入三角搖瓶中，28-30°C，220-250rpm培養18_24h後，按20%的接種量接入50L發酵罐， 在 28-30°C，450-550r/min，罐壓為 0. 05-0. 08Pa，通風量為 60_80NL/min，pH = 5. 5-6. 0，溶 氧量不低於45%的條件下進行發酵，在培養24h時加入體積比為0. 6%的甲醇進行誘導發 酵表達72h。然後通入100°C蒸汽20min對發酵液進行滅菌，60°C噴霧乾燥得到CP-⑶蛋白 的粗製品。
8.如權利要求1所述的具有殺菌防腐功能的小肽在製備殺菌性乳豬飼料的添加劑中 的應用。
9.如權利要求7所述的應用，其特徵在於所述的小肽的添加比例為基礎飼料重量的 5%。全文摘要
本發明屬生物技術領域，具體涉及豬源性具有殺菌活性的小肽。本發明還涉及這種小肽的製備方法及其在飼料防腐中的應用。所述的具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD，其胺基酸序列為KKIGKKIERV GQRVRDAVIS AAPAVDTLAKAKALGQG。所述的製備方法包括設計具有殺菌防腐功能的小肽CP-CD的cDNA；根據酵母偏愛的密碼子，設計引物P1和P2；進行常規鏈式聚合酶反應擴增殺菌活性肽CP-CD的cDNA；在適於表達的載體中克隆CP-CD的基因；表達質粒pPICZαA-CP-CD在酵母細胞中的高效表達；在適於表達該cDNA片段的條件下培養宿主細胞，並從中回收所需的產物。所述的具有殺菌防腐功能的小肽可以應用在製備殺菌性乳豬飼料的添加劑中。
文檔編號C07K14/47GK101948522SQ20101025713
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月18日 優先權日2010年8月18日
發明者郭吉餘 申請人:廣東海大集團股份有限公司