一株順式環氧琥珀酸水解酶產生菌及其在l-酒石酸生產中的應用的製作方法

2023-09-20 11:34:25

一株順式環氧琥珀酸水解酶產生菌及其在l-酒石酸生產中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一株產順式環氧琥珀酸水解酶的雙頭菌屬CICC23800菌株（ Labrys sp .CICC23800），保藏編號為CGMCCNo.9849。雙頭菌屬CICC23800菌株經過發酵培養，離心得菌體細胞，菌體細胞加入順式環氧琥珀酸鈉溶液進行生物轉化，經氯化鈣沉澱、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結晶乾燥得L-酒石酸成品。雙頭菌屬CICC23800菌株用於L-酒石酸生產可提高生產效率，降低生產成本。CGMCC No984920141027
【專利說明】一株順式環氧琥珀酸水解酶產生菌及其在L-酒石酸生產中的應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一株雙頭菌屬CICC 23800菌株5/7.CICC 23800)，其可以用於生物轉化順式環氧琥珀酸鈉生產L-酒石酸。

【背景技術】
[0002]L (+ )酒石酸，即2，3-二羥基丁二酸，為天然有機酸，無水結晶、無臭、味酸、無色透明，屬單斜晶系，相對密度1.76，熔點168°C?17(TC，易溶於水、甲醇、乙醇，難溶於乙醚、氯仿。
[0003]L(+)_酒石酸是一種天然有機酸，廣泛分布於自然界，特別是葡萄和羅望子果中。L(+)_酒石酸首先由Scheele於1769年從葡萄酒中發現，是一種重要的食品添加劑和工業原料。作為食品添加劑，它的酸味值約是檸檬酸的1.25倍，可作為飲料、糖果及葡萄酒等的酸味劑，它和檸檬酸、氧化亞鐵產生鮮綠色可作為食用色素用於糕點，亦可用作防腐劑和乳化穩定劑。在工業方面主要用於印染的防染劑、照相顯影劑、金屬離子隱匿劑；在製藥工業中，可作為藥物拆分劑，如在生產抗結核藥乙胺丁醇中，L(+)_酒石酸作為不可替代的拆分劑用於拆分中間體(±)_2_氨基丁醇，它也可作為酒石酸苯茚胺，酒石酸異丁嗪等藥品的成鹽劑；此外在電鍍和製革等行業也有廣泛的用途。
[0004]L-酒石酸生產方法主要有酒石提取法、化學合成法、直接發酵法以及生物轉化法。但最具有工業生產價值的方法是生物轉化法。
[0005](1)酒石提取法:早期酒石酸主要從葡萄酒釀造的副產物酒石中提取，缺點是酒石供應量有限、來源不穩定。
[0006](2)化學合成法:化學法合成酒石酸為D-酒石酸和L-酒石酸的混合體，還需進行光學異構體拆分才能得L-酒石酸，生產成本較高。
[0007](3)直接發酵法:1929年佳木首先報導了灰綠麴黴glaucus)在葡萄糖基質上產生L(+)-酒石酸；1968年山田浩一等人採用Gluconobacter SuboxyansIAM-1829 (ATCC 621)直接發酵生產L (+)-酒石酸，產酸為14.6g/L，轉化率為29.2%。直接發酵法生產L-酒石酸產酸及轉化率低，目前處於研究階段。
[0008](4)生物轉化法:利用微生物產生的順式環氧琥珀酸水解酶(ESH)水解順式環氧琥珀酸鈉成L (+)_酒石酸生物轉化的方法。目前報導的，產順式環氧琥珀酸水解酶微生物菌種主要有:無色桿菌(Achromobacter tartarogens)和產喊桿菌iAlcaligenesepoxylyticus)，諾卡氏菌 iNocardia tartaricans)，棒狀桿菌{Corynebacterium sp.)，強壯根瘤菌mhizobiutn validum)等。生物轉化法的主要優點是反應立體專一'丨生強,轉化率高，基本上沒有其他副產物，後期的分離提純也更加方便。


【發明內容】

[0009]本發明所解決的技術問題為通過自主選育獲得一株產順式環氧琥珀酸水解酶的微生物菌種雙頭菌屬CICC 23800 Uabrys sp.CICC 23800)，用於水解順式環氧琥珀酸鈉生產L-酒石酸，轉化效率高，降低了 L-酒石酸生產成本。
[0010]本發明自主選育的雙頭菌屬CICC 23800 {Labrys sp.CICC 23800)保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC N0.9849。
[0011]本發明的雙頭菌屬CICC 2^mLabrys sp.CICC 23800)順式環氧琥珀酸水解酶活力高，經過發酵培養酶活力可達2300U/g溼細胞。用於水解順式環氧琥珀酸鈉生產L-酒石酸，底物順式環氧琥珀酸鈉濃度高，因而可生物合成高濃度的L-酒石酸，便於後續提取，可提高生產效率，降低生產成本。
[0012]本發明進一步提供一種微生物轉化順式環氧琥珀酸鈉生產L-酒石酸的方法。將雙頭菌屬CICC 23800發酵培養後發酵液離心獲得微生物菌體，加入順式環氧琥珀酸鈉溶液，通過菌體細胞內的順式環氧琥珀酸水解酶，光學專一性水解順式環氧琥珀酸鈉，生成L-酒石酸，然後經過氯化鈣沉澱、過濾水洗得酒石酸鈣沉澱，再經硫酸溶液酸解，過濾水洗得L-酒石酸溶液，經濃縮、熱濾、結晶得L-酒石酸成品。
[0013]具體步驟為:
(1)將雙頭菌屬CICC23800斜面菌種，接種種子培養基，25?37°C發酵培養18?30h得接種液；
(2)接種液接入發酵培養基中，25?37°C，培養30?48h，得雙頭菌屬CICC23800發酵液；
(3)發酵液離心獲得雙頭菌屬CICC23800菌體細胞；
(4)雙頭菌屬CICC23800菌體細胞加入pH值6.(T9.0順式環氧琥珀酸鈉溶液，25-45°C生物轉化生成L-酒石酸，經沉澱、過濾、酸解、過濾、濃縮、結晶、乾燥得成品L-酒石酸。
[0014]雙頭菌屬CICC 23800的斜面種子培養可採用本領域常用技術手段。斜面培養基可以採用試管或者茄子瓶製備。通常情況下可採用搖瓶發酵培養獲得適量接種液及發酵液，若需大規模培養，可再利用發酵罐進行擴大培養。
[0015]一些典型的培養基組成如下:
斜面培養基(g/L):葡萄糖6.(Γ12.0，酵母浸粉3.0?8.0，瓊脂15.0, ρΗ6.0?7.5。
[0016]種子培養基(g/L):葡萄糖4.(Γ12.0，硫酸銨3.(ΓΙΟ.0，磷酸二氫鉀1.0?4.0，七水硫酸鎂0.2?0.8，硫酸亞鐵0.01?0.04，調節ρΗ6.0?7.5。
[0017]微生物保藏信息
微生物分類命名:雙頭菌sp.)
保藏編號:CGMCC N0.9849 保藏日期:2014年10月27日；
保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0018]微生物保藏信息
微生物分類命名:雙頭菌屬CICC 23800 Uabrys sp.CICC 23800)
保藏編號:CGMCC N0.9849 保藏日期:2014年11月6日；
保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心； 保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0019]【具體實施方式】:
為進一步說明本發明，結合以下實施例具體說明。
[0020]實施例1 微生物菌種鑑定
1、基因組DNA提取
(1)用接種環挑取一環斜面菌種，懸浮於lml0.85% NaCl溶液中，10000r/min離心2min,棄上清；
(2)沉澱重懸於550ul 1XTE 中，加 17ul 溶菌酶(35mg/ml)，37°C溫育 30min ；
(3)加3ul 蛋白酶 K (20ug/ml), 37°C溫育 30min ；
(4)加30ul 10% SDS，37。。溫育 30min ；
(5)加lOOul5M NaCl溶液充分混勻，再加80ul CTAB/NaCl混勻，65°C水浴lOmin ；
(6)加等體積氯仿/異戍醇(24:1),輕輕震蕩混勻，10000r/min離心8min；
(7)取上清液，加等體積酹/氯仿/異戍醇(25:24:1),輕輕震蕩搖勻；13000r/min離心8min ；
(8)重複步驟6；
(9)取上清，加0.6-0.8倍體積異丙醇，輕輕混勻後室溫靜置30min ；
(10)10000r/min離心8min,棄上清,加500ul 70%乙醇,顛倒數次洗鹽，棄上清；重複洗鹽兩次；
(11)倒置離心管，至DNA沉澱乾燥；沉澱溶於50-100uldd H20，-20°C保存備用。
[0021]2、16S rDNA 擴增
PCR 反應體系 50ul:DNA 模版 0.5ul (約 10ng)，10XTaq DNA 聚合酶 Buffer5ul, lOpmol /ul dNTP lul, lOpmol/ul 正反向引物各 lul (正向引物 27F:5』-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』 ；反向引物 1492R: 5』-GGTTACCTTGTTACGACTT_3』)，2.5u/ulTaq DNA 聚合酶 0.5ul，添加 ddH20 至 50ul。PCR 擴增反應程序:94°C 5min ；94°C 30s ；50°C30s ；72°C lmin 30s ；35 cycles ；72°C lOmin ;4°C保存。PCR 擴增產物用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物用ABI3700基因測序儀測序。
[0022]3、序列比對鑑定
微生物菌種16S rDNA序列於NCBI資料庫比對與雙頭菌屬Uabrys)模式菌株Labrysportucalensis FI 1τ(AY362040), Labrys neptuniae Liujia_146T(DQ417335), Labrysmonachus VKM B_1479T (AJ535707)相似性分別為 99.63%、99.56% ,98.10%。菌株鑑定命名為雙頭菌屬sp.)
實施例2
斜面培養基(g/L):葡萄糖10.0，酵母浸粉5.0，瓊脂15.0, pH6.5。
[0023]種子培養基(g/L):葡萄糖10.0，硫酸銨6.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.6，硫酸亞鐵0.02，調節pH6.5。
[0024]發酵培養基:葡萄糖10.0，硫酸銨6.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.6，硫酸亞鐵0.02，順式環氧琥珀酸鈉2.0，調節pH6.5。
[0025]取雙頭菌屬CICC 23800斜面菌種一環接種到30mL種子培養基中，搖床200rpm，29°C培養18h得接種液。取接種液2ml，接種到裝有200mL發酵培養基的三角瓶，200rpm攪拌，29°C培養44h，獲得雙頭菌屬CICC 23800發酵液，發酵液lOOOOrpm離心得菌體細胞，力口入200mL的15%順式環氧琥珀酸鈉溶液，pH值7.0，30°C生物轉化44h生成L-酒石酸，加入氯化鈣，過濾得L-酒石酸鈣沉澱，酒石酸鈣沉澱加入硫酸溶液，酸解後過濾得L-酒石酸溶液，80°C濃縮，冷卻結晶乾燥後得L-酒石酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合併到下一批L-酒石酸溶液中。
[0026]實施案例3
斜面培養基(g/L):葡萄糖12.0，酵母浸粉8.0，？!17.5。
[0027]種子培養基(g/L):葡萄糖12.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,調節pH7.5。
[0028]發酵培養基:葡萄糖15.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,順式環氧琥珀酸鈉5.0，調節pH7.5。
[0029]取雙頭菌屬CICC 23800斜面菌種一環接種到裝有300mL種子培養基的1L三角瓶中，搖床200rpm，35°C培養28h得接種液。取接種液400mL，接種到裝有40L發酵培養基的50L發酵罐中，400rpm攪拌，通氣量lv/v.min，35°C培養44h，獲得雙頭菌屬CICC 23800發酵液，發酵液lOOOOrpm離心得菌體細胞，加入40L的15%順式環氧琥珀酸鈉溶液，pH值9.0，45°C生物轉化42h生成L-酒石酸，加入氯化鈣，過濾得L-酒石酸鈣沉澱，酒石酸鈣沉澱加入硫酸溶液，酸解後過濾得L-酒石酸溶液，80°C濃縮，冷卻結晶乾燥後得L-酒石酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合併到下一批L-酒石酸溶液中。
[0030]實施案例4
斜面培養基(g/L):葡萄糖12.0，酵母浸粉8.0，？!17.5。
[0031]種子培養基(g/L):葡萄糖12.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,調節pH7.5。
[0032]發酵培養基:葡萄糖15.0，硫酸銨10.0，磷酸二氫鉀4.0，七水硫酸鎂0.8，硫酸亞鐵0.04,順式環氧琥珀酸鈉5.0，調節pH7.5。
[0033]取雙頭菌屬CICC 23800斜面菌種一環接種到裝有300mL種子培養基的1L三角瓶中，搖床200rpm，35°C培養28h得接種液。取接種液400mL，接種到裝有40L種子培養基的50L發酵罐中，400rpm攪拌，通氣量lv/v.min，35°C培養28h，獲得雙頭菌屬CICC 23800二級種子液。取二級種子液160L，接種裝有16m3發酵培養基的20 m3發酵罐通氣量0.5v/v.min, 200rpm, 35°C培養44h,發酵液lOOOOrpm離心得菌體細胞，加入16m3的15%順式環氧琥珀酸鈉溶液，pH值9.0，45°C生物轉化42h生成L-酒石酸，加入氯化鈣，過濾得L-酒石酸鈣沉澱，酒石酸鈣沉澱加入硫酸溶液，酸解後過濾得L-酒石酸溶液，80°C濃縮，冷卻結晶乾燥後得L-酒石酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合併到下一批L-酒石酸溶液中。
[0034]以上所述的實施案例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明的設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。
[0035]序列表
中國食品發酵工業研究院
〈120〉一株順式環氧琥珀酸水解酶產生菌及其在L-酒石酸生產中的應用〈160〉 I
PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
〈211>1369
DNA
〈213〉雙頭菌屬 CICC 23800 Uabrys sp.CICC 23800)
1
ggcttaccat gcaagtcgaa cgccccgcaa ggggagtggc agacgggtga gtaacgcgtg60
gggatgtgcc ttgaggtggg gaataactgt gggaaactac agctaatacc gcataagccc120
ttcgggggaa agatttatcg cctttagagc aacccgcgtc agattagcta gttggtaggg180
taatggccta ccaaggcgac gatctgtagc tggtctgaga ggatgaccag ccacactggg240
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg300
caagcctgat ccagccatgc cgcgtgagtg atgacggcct tagggttgta aagctctttt360
aacagggacg ataatgacgg tacctgtaga ataagccccg gcaaacttcg tgccagcagc420
cgcggtaata cgaagggggc tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg480
cggattgtta agtcgggggt gaaatcctga ggctcaacct cagaactgcc ttcgatactg540
gcgatcttga gttcggaaga ggttggtgga acagctagtg tagaggtgaa attcgtagat600
attagctaga acaccagtgg cgaaggcggc caactggtcc gatactgacg ctgaggtgcg660
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg720
ccagccgtcg gggagcttgc tcttcggtgg cgcagctaac gctttaagca ttccgcctgg780
ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga840
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca gcccttgaca tcccggtcgc900
ggatcacaga gatgagatcc ttcagttcgg ctggaccggt gacaggtgct gcatggctgt960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgcccct1020
agttgccagc attcagttgg gcactctagg gggactgccg gtgataagcc gcgaggaagg1080
tggggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggctggg ctacacacgt gctacaatgg1140
cggtgacagt gggaagcgaa ggggtgaccc ttagcaaatc tccaaaagcc gtctcagttc1200
agattgcact ctgcaactcg agtgcatgaa ggtggaatcg ctagtaatcg cagatcagca1260
tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagttgg1320
ttttacccga aggcgctgcg ccaaccgcaa ggaggcaggc gaccacgta1369
【權利要求】
1.一株雙頭菌屬 CICC 23800 菌株sp.CICC 23800)，保藏編號為 CGMCCN0.9849。
2.如權利要求1所述的雙頭菌屬CICC23800菌株，其特徵在於能夠產生順式環氧琥珀酸水解酶，用於生物轉化順式環氧琥珀酸鈉生產L-酒石酸。
3.如權利要求2所述的一種生物轉化順式環氧琥珀酸鈉生產L-酒石酸的方法，其特徵在於將權利要求1所述的雙頭菌屬CICC 23800菌株發酵培養，離心得菌體細胞，菌體細胞加入順式環氧琥珀酸鈉溶液進行生物轉化，經氯化鈣沉澱、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結晶乾燥得L-酒石酸成品。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)雙頭菌屬CICC23800斜面菌種接種種子培養基培養18?30h，得接種液； (2)接種液接入發酵培養基發酵培養3(T48h，發酵液離心獲得雙頭菌屬CICC23800菌體細胞； (3)雙頭菌屬CICC23800菌體細胞加入順式環氧琥珀酸鈉溶液，生物轉化生成L-酒石酸，經沉澱、過濾、酸解、濃縮、過濾、結晶得成品L-酒石酸。
5.如權利要求4所訴的方法，其特徵在於步驟(I)和(2)雙頭菌屬CICC23800培養溫度為 25-37°C。
6.如權利要求4所訴的方法，其特徵在於步驟(2)發酵培養基組成(g/L)為:葡萄糖4.(Γ15.0,硫酸銨3.(Γ10.0,磷酸二氫鉀1.0?4.0,七水硫酸鎂0.2?0.8，硫酸亞鐵0.01?0.04，順式環氧琥珀酸鈉1.0?5.0，調節ρΗ6.0?7.5。
7.如權利要求4所訴的方法，其特徵在於步驟(3)順式環氧琥珀酸鈉溶液pH值為6.0?9.0。
8.如權利要求4所訴的方法，其特徵在於步驟(3)生物轉化溫度3(T45°C。
【文檔編號】C12R1/01GK104388346SQ201410648880
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】程池, 劉勇, 裴疆森, 徐友強, 張京濤, 王哲 申請人:中國食品發酵工業研究院