一種生物轉化富馬酸生產l-蘋果酸的方法

2023-09-20 11:41:25 4

一種生物轉化富馬酸生產l-蘋果酸的方法
【專利摘要】本發明涉及一種生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸的方法。利用自主選育的葡萄牙棒孢酵母CICC33054（Clavispora lusitaniae CICC 33054），經發酵培養，離心得酵母細胞。酵母細胞加入富馬酸鈉溶液進行生物轉化，經富馬酸鈣置換沉澱、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結晶乾燥得L-蘋果酸成品。葡萄牙棒孢酵母CICC33054易於培養，轉化效率高，用於L-蘋果酸生產可提高生產效率，降低生產成本。CGMCC No.98482014.10.27
【專利說明】一種生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用富馬酸生產L-蘋果酸的方法，尤其是涉及葡萄牙棒孢酵母CICC 33054生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸的方法。

【背景技術】
[0002]L-蘋果酸又名羥基琥珀酸或羥基丁二酸，分子式為C4H6O5，分子量為134.09。在常溫下，L-蘋果酸為白色結晶或結晶性粉末，無臭，有爽快的酸味，比重1.601，熔點98、9°C。在20°C下，34%的L-蘋果酸水溶液無旋光性，加水稀釋後可出現左旋，當其濃度超過34%時，又出現右旋。
[0003]由於L-蘋果酸分子中含有-OH基及-COOH基，因此對極性溶媒的溶解度大，化學性質較為活潑。在常溫下它極易溶於乙醇中，在水中其溶解度隨水溫的升高而增大，呈強酸性。它還能與醇類、濃硫酸、苯酚、過氧化氫、三氯乙醛及醋酸鉛等發生反應，並能與萘酚、間苯酚及2，7_萘二酚作用，使溶液呈不同的顏色。
[0004]L-蘋果酸是生物體代謝過程中所產生的重要有機酸。在微生物中，它的產生與多條重要的代謝途徑有關，出現於三羧酸循環(TCA)及其支路乙醛酸循環中，也是CO2固定反應的產物。
[0005]幾十年來，人們對L-蘋果酸在微生物中的代謝途徑進行了研究，尤其對裂褶菌{Schizphylhls代謝途徑的研究比較深入。目前從事這方面工作的研究者大都認為CO2固定反應是L-蘋果酸生成及積累的重要過程。
[0006]L-蘋果酸在水中溶解度大、酸味柔和、風味別致、質地穩定，其用途相當廣泛:
1.在食品工業上，L-蘋果酸是國際上公認的一種安全性食品添加劑，也是一種優良的調酸劑和保鮮劑。與檸檬酸相比，L-蘋果酸的刺激較為緩慢，酸味可保留較長時間，與檸檬酸配合使用，可以模擬天然果實的酸味特徵，使甜酸口感顯得自然、豐滿、調諧。現在歐美及日本各國的食品生產中，它已成為不可缺少的基本原料之一。另外，由於食品中添加L-蘋果酸可使PH值得到調整，加上其本身固有的抗菌作用，L-蘋果酸亦被廣泛地用於其它食品工業，如作水產品的保鮮劑等。
[0007]2.在醫藥上，L-蘋果酸具有重要的生理功能。L-蘋果酸直接參與人體代謝，對人體的健康有幫助。可用於治療貧血、肝功能不全、肝衰竭，並可作混合胺基酸注射液的組分和乳酸鈣注射液的安定劑。把L-蘋果酸加入藥物中還可增進藥物的穩定性、改善人體對藥物的吸收能力。L-蘋果酸鉀可作為鉀的重要來源，亦具防止水腫、血壓過高及脂肪積聚之功效。L-蘋果酸及其鹽類還能作動物的生長促進劑。
[0008]3.工業上的其它用途。由於L-蘋果酸具抗氧化作用和較強的鰲合作用，因此廣泛地應用於印染工業作為保色劑和增效劑。在化學工業方面，由於L-蘋果酸可調節pH值，因此可作牙膏及菸草的調味劑、皮膚清潔劑、焊錫助焊劑、空氣清新劑、洗滌劑助劑和廢氣脫硫劑，還可代替檸檬酸作為各種金屬容器及表面的除鏽劑。在建材上，添加適量的L-蘋果酸於水泥中，可縮短凝固時間，防止鹼性凝聚反應的發生，提高混凝土的強度。L-蘋果酸還可代替草酸作為各種石塊的表面清洗劑，使其表面變得光滑、平整和美觀。
[0009]隨著L-蘋果酸應用研究的不斷深入，其市場需求量逐年增加。經過不斷努力，L-蘋果酸的生產方法已從早期單一的直接提取法，發展到今天的多種生產方法。根據生產原料的不同，可將L-蘋果酸的生產分為5種:
1.直接提取法:把石灰乳直接加人富含L-蘋果酸的果汁及蔬菜汁中，形成的L-蘋果酸鈣沉澱用硫酸處理，然後再回收游離的L-蘋果酸。
[0010]2.拆分法:在一定條件下，糖醛、β -內醋、環戊二烯及丁烯二酸等均可合成DL-蘋果酸。將化學合成的DL-蘋果酸拆分就可獲得L-蘋果酸。
[0011]3.利用微生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸。以能夠產生富馬酸酶的微生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸。到目前為止，篩選出來具有較高富馬酸酶活性的菌種有短乳杆 lif ^Lactobacillus brevis、、產氛短杆舊 Uirevibacterium ammoniagenes)>黃色短桿菌(Mrevibacterium fIavum)、脫氮副球菌iParacoccus denitrificans、、苜Ij腸道菌iPorocolobactoriuo sp.)、解脂假絲酵母{Candida Iipolytica )及溫特麴黴(.Aspergillus wentii)等。生物轉化法採用的方法有固定化酶或固定化細胞以及游離細胞法。固定化酶或固定化細胞法的酶和細胞能重複利用，但是固定化操作繁瑣，設備要求高。游離細胞法操作簡單工藝易控。
[0012]4.利用微生物發酵糖質原料生產L-蘋果酸。採用此法的生產途徑有兩條:第一條是用單一菌種一步發酵生產L-蘋果酸,所用的菌種有黃麴黴(As/76?r^777w5.flavus、、寄生麴黴(AspergiIlus parasi ticus )、米麴黴(AspergiIlus oryzae )及出芽短梗黴(Aureobasidium pulIulans)等；第二條是混種發酵兩步生產L-蘋果酸,首先採用少根根黴(Mdzopus arrizus)或華根黴{Rhizopus)把糖質原料轉化成富馬酸,然後利用膜醭畢赤酵母(/7ZcAia 普通變形桿菌{Proteus vulgaris)及宛氏擬青黴iPaecilomyces var1tii)中的一種,把富馬酸轉化成L-蘋果酸。由於發酵周期較長，產酸率相對較低、副產物較多，因此直到目前為止還尚未見有應用於大規模工業生產的報導。
[0013]5.利用微生物發酵非糖質原料生產L-蘋果酸。目前人們已成功地採用布倫假絲酵母brumptii )發酵正構石臘,宛氏擬青黴發酵乙醇、甘油、醋酸及丙酸等,產鹼菌Ulcaligenes sp.T501)發酵馬來酸，其轉化率分別達80%、48%及98.4%。但這些非糖質原料發酵生產L-蘋果酸的試驗目前仍處於實驗室階段，尚未投人工業生產。


【發明內容】

[0014]本發明所解決的技術問題為提供一種以產富馬酸酶的微生物菌種葡萄牙棒孢酵母 CICC 33054 (Clavispora lusitaniae CICC 33054))生物轉化富馬酸生產 L-蘋果酸。
[0015]本發明自主選育的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9848。
[0016]葡萄牙棒孢酵母CICC 33054的26S rDNA序列見序列表。
[0017]本發明的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054富馬酸酶活力高，經過發酵培養酶活力可達2000U/g溼細胞。用於生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸，轉化效率高，便於後續提取，可提高生產效率，降低生產成本。
[0018]本發明進一步提供一種微生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸的方法。將葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發酵培養後發酵液離心獲得酵母細胞，加入富馬酸鈉溶液，通過菌體細胞內的富馬酸酶，光學專一性合成L-蘋果酸，然後經過富馬酸鈣置換沉澱、過濾水洗得L-蘋果酸鈣沉澱，再經硫酸溶液酸解，過濾水洗得L-蘋果酸溶液，經濃縮、結晶、乾燥得L-蘋果Ife成品。
[0019]具體步驟為:
(O葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種接種種子培養基發酵培養18?24h，得接種液；
(2)接種液接入發酵培養基,發酵2(T30h得發酵液,發酵液離心獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 細胞；
(3)葡萄牙棒孢酵母CICC33054細胞加入富馬酸鈉溶液，生物轉化生成蘋果酸，經沉澱、過濾、酸解、過濾、濃縮、結晶、乾燥得成品L-蘋果酸酸。
[0020]葡萄牙棒孢酵母CICC 33054的斜面種子培養可採用本領域常用技術手段。斜面培養基可以採用試管或者茄子瓶製備。通常情況下可採用搖瓶發酵培養獲得適量種子培養液，若需大規模培養，可再進行發酵罐擴大培養，獲得量大的種子培養液。工業生產中，葡萄牙棒孢酵母CICC 33054細胞發酵液可通過發酵罐進行發酵培養。
[0021]一些典型的培養基組成如下:
斜面培養基(g/L):麥芽浸粉8(Γ150.0，瓊脂15.0，pH值6.0?7.0。
[0022]種子培養基(g/L):葡萄糖30.(Γ70.0，酵母粉2.(Γ8.0，硫酸銨3.(Γ8.0，磷酸二氫鉀1.(Γ5.0，七水硫酸鎂0.1?0.6，調節ρΗ6.(Γ7.0。
[0023]發酵培養基(g/L):葡萄糖50.(Γ120.0，酵母粉2.(Γ8.0，硫酸銨3.(Γ8.0，磷酸二氫鉀1.(Γ5.0，七水硫酸鎂0.1?0.6，調節pH值6.0?7.0。
[0024]微生物保藏信息
微生物分類命名:葡萄牙棒孢酵母Iusitaniae)
保藏編號:CGMCC N0.9848 保藏日期:2014年10月27日；
保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0025]

【具體實施方式】
為進一步說明本發明，結合以下實施例具體說明。
[0026]實施例1 微生物菌種鑑定
1、基因組DNA提取
(1)用接種環挑取一環斜面菌種，懸浮於Iml0.85% NaCl溶液中，10000r/min離心2min,棄上清；
(2)沉澱重懸於550ulIXTE中，沸水浴1min ；
(3)加3ul 蛋白酶 K (20ug/ml), 37°C溫育 30min ；
(4)加30ul 10% SDS，37。。溫育 30min ；
(5)加10ul5M NaCl溶液充分混勻，再加80ul CTAB/NaCl混勻，65°C水浴1min ； (6)加等體積氯仿/異戍醇(24:1),輕輕震蕩混勻，10000r/min離心8min；
(7)取上清液,加等體積酹/氯仿/異戍醇(25:24:1),輕輕震蕩搖勻；13000r/min離心8min ；
(8)重複步驟6；
(9)取上清，加0.6-0.8倍體積異丙醇，輕輕混勻後室溫靜置30min ；
(10)10000r/min離心8min,棄上清,加500ul 70%乙醇,顛倒數次洗鹽，棄上清；重複洗鹽兩次；
(11)倒置離心管，至DNA沉澱乾燥；沉澱溶於50-100uldd H2O,-20°C保存備用。
[0027]2、26S rDNA 擴增
PCR 反應體系 50ul:DNA 模版 0.5ul(約 10ng)，1XTaq DNA 聚合酶 Buffer 5ul, 1pmol/ul dNTP lul，10pmol/ul 正反向引物各 Iul (正向引物 NLl 5 『一GCA TAT CAA TAA GCGGAG GAA AAG— 3』和反向引物 NL4 5 『一GGT CCG TGT TTC AAG ACG G—3』)，2.5u/ul TaqDNA 聚合酶 0.5ul，添加 ddH20 至 SOult5PCR擴增反應程序:94°C 5min ；94°C 30s ;50。。30s ；72°C Imin 30s ；35 cycles ；72°C 1min ;4°C保存。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物用ABI3700基因測序儀測序。
[0028]3、序列比對鑑定
微生物菌種26S rDNA序列於NCBI資料庫比對與模式株 Clavispora IusitaniaeCBS 4413τ (ΑΥ190538), Clavispora lusitaniae CBS 6936T (U44817)，相似性最高，分別為100.0%、93.4%。菌株鑑定命名為葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 (Clavispora lusitaniaeCICC 33054)。
[0029]實施例2
斜面培養基(g/L):麥芽浸粉90.0、瓊脂15.0、pH值6.0。
[0030]種子培養基(g/L):葡萄糖40.0，酵母粉3.0，硫酸銨4.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.2，調節pH6.0。
[0031]發酵培養基(g/L):葡萄糖70.0，酵母粉6.0，硫酸銨6.0，磷酸二氫鉀2.0，七水硫酸鎂0.2，調節pH6.0。
[0032]取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種一環接種到裝有30mL種子培養基的三角瓶中，搖床200rpm，29°C培養18h得接種液。取3mL接種液，接種到裝有300mL發酵培養基的三角瓶中，200rpm培養28h，獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發酵液，發酵液5000rpm離心1min得酵母細胞，加入300mL的139g/L的富馬酸溶液(氫氧化鈉調節pH值為6.0)，再加入0.2mL甲苯，30°C生物轉化31h生成L-蘋果酸。加入富馬酸鈣置換，過濾得L-蘋果酸鈣沉澱，再經硫酸酸解後過濾得L-蘋果酸溶液，80°C濃縮，冷卻結晶、乾燥後得L-蘋果酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合併到下一批L-蘋果酸溶液中。
[0033]實施案例3
斜面培養基(g/L):麥芽浸粉150.0、瓊脂15.0、pH值7.0。
[0034]種子培養基(g/L):葡萄糖70.0，酵母粉8.0，硫酸銨8.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調節pH值7.0。
[0035]發酵培養基(g/L):葡萄糖120.0，酵母粉15.0，硫酸銨12.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調節pH值為7.0。
[0036]取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種一環接種到裝有300mL種子培養基的IL三角瓶中，搖床200rpm，33°C培養24h得接種液，合併得發酵液600mL。取600mL接種液，接種到裝有30L發酵培養基的50L發酵罐，330C，通氣量lv/v.min, 500rpm培養24h，獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發酵液，發酵液5000rpm離心1min得酵母細胞，加入60L的139g/L的富馬酸溶液(氫氧化鈉調節pH值為6.0)，再加入300ml甲苯，40°C生物轉化28h生成L-蘋果酸。加入富馬酸鈣置換，過濾得L-蘋果酸鈣沉澱，再經硫酸酸解後過濾得L-蘋果酸溶液，80°C濃縮，冷卻結晶乾燥後得L-蘋果酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合併到下一批L-蘋果酸溶液中。加入富馬酸鈣置換過濾得L-蘋果酸鈣沉澱後的過濾液可再用於轉化生產L-蘋果酸。
[0037]實施案例4
斜面培養基(g/L):麥芽浸粉150.0、瓊脂15.0、pH值7.0。
[0038]種子培養基(g/L):葡萄糖70.0，酵母粉8.0，硫酸銨8.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調節pH值7.0。
[0039]發酵培養基(g/L):葡萄糖120.0，酵母粉15.0，硫酸銨12.0，磷酸二氫鉀5.0，七水硫酸鎂0.6，調節pH值為7.0。
[0040]取葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種一環接種到裝有300mL種子培養基的IL三角瓶中，搖床200rpm，33°C培養24h得接種液，合併得發酵液600mL。取600mL接種液，接種到裝有30L種子培養基的50L發酵罐，330C，通氣量lv/v.min, 500rpm培養20h，獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 二級種子液。取300L 二級種子液接入裝有15m3發酵培養基的20m3發酵罐，33°C,通氣量0.5v/v.min,200rpm培養20h。發酵液離心1min得酵母細胞,加入30 m3的139g/L的富馬酸溶液(氫氧化鈉調節pH值為6.0)，再加入400L甲苯，40°C生物轉化30h生成L-蘋果酸。加入富馬酸鈣置換，過濾得L-蘋果酸鈣沉澱，再經硫酸酸解後過濾得L-蘋果酸溶液，80°C濃縮，冷卻結晶乾燥後得L-蘋果酸成品，純度達到99.8%。濃縮母液可合併到下一批L-蘋果酸溶液中。加入富馬酸鈣置換過濾得L-蘋果酸鈣沉澱後的過濾液可再用於轉化生產L-蘋果酸。
[0041]以上所述的實施案例僅僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明的設計精神的前提下，本領域普通工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變形和改進，均應落入本發明的權利要求書確定的保護範圍內。
[0042]序列表
中國食品發酵工業研究院
〈120〉一種生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸的方法
〈160〉 I
PatentIn vers1n 3.3
〈210〉 I
482
DNA
〈213〉葡萄牙棒孢酵母 CICC 33054 (Clavispora lusitaniae CICC 33054)
1
gctcaaattt gaaatcctgc gggaattgta atttgaaggt ttcgtggtct gagtcggccg60cgcccaagtc cattggaaca tggcgcctgg gagggtgaga gccccgtatg gcgcacgccg120
actctttgca ccgcggctcc gacgagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg180
gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg240
gaaagatgaa aagcactttg aaaagagagt gaaacagcac gtgaaattgt tgaaagggaa300
gggcttgcaa gcagacacgg ttttaccggg ccagcgtcga aaagggggga ggaacaagaa360
ctcgagaatg tggcgcgcac cttcgggcgc gcgtgttata gctcgtgttg acgcctccat420
cccttttcga ggcctgcgat tctaggacgc tggcgtaatg gttgcaagcc gcccgtcttg480aa
【權利要求】
1.一株葡萄牙棒抱酵母 CICC 33054 (Clavispora lusitaniae CICC 33054),保藏編號為 CGMCC N0.9848。
2.如權利要求1所述的葡萄牙棒抱酵母CICC33054 (Clavispora lusitaniae CICC33054)用於生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸。
3.如權利要求2所述的生物轉化富馬酸生產L-蘋果酸的方法，其特徵在於將權利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母CICC 33054發酵培養，離心得酵母細胞，酵母細胞加入富馬酸鈉溶液進行生物轉化，經富馬酸鈣置換沉澱、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結晶、乾燥得L-蘋果Ife成品。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於包括以下步驟: (O葡萄牙棒孢酵母CICC 33054斜面菌種接種種子培養基發酵培養18?24h，得接種液； (2)接種液接入發酵培養基,發酵2(T30h得發酵液,發酵液離心獲得葡萄牙棒孢酵母CICC 33054 細胞； (3)葡萄牙棒孢酵母CICC33054細胞加入富馬酸鈉溶液，生物轉化生成L-蘋果酸，經富馬酸鈣置換沉澱、過濾、硫酸酸解、過濾、濃縮、結晶、乾燥得L-蘋果酸成品。
5.如權利要求4所訴的方法，其特徵在於步驟(I)和(2)葡萄牙棒孢酵母CICC33054培養溫度為25-35°C。
6.如權利要求4所訴的方法，其特徵在於步驟(2)發酵培養基組成(g/L)為:葡萄糖50.(Γ120.0,酵母粉2.(Γ8.0,硫酸銨3.(Γ8.0,磷酸二氫鉀1.(Γ5.0,七水硫酸鎂0.Γο.6，調節 pH 值 6.0?7.0。
7.如權利要求4所訴的方法，其特徵在於步驟(3)富馬酸鈉溶液pH值為6.(Γ8.0。
8.如權利要求4所訴的方法，其特診在於步驟(3)生物轉化溫度3(T45°C。
【文檔編號】C12N1/16GK104357340SQ201410648894
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】程池, 黃玲, 裴疆森, 劉勇, 張京濤, 徐友強, 王哲 申請人:中國食品發酵工業研究院