番茄紅素在製備防治老年痴呆藥物中的應用的製作方法

2023-09-20 07:11:25 6

番茄紅素在製備防治老年痴呆藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種防治老年痴呆的藥物，該藥物是番茄紅素(Lycopene)。本發明揭示，番茄紅素(Lycopene)能減少老年性痴呆大鼠大腦皮質和海馬區骨架蛋白tau的異常過度磷酸化並改善動物學習、記憶障礙，能用於老年性痴呆的預防和治療。
【專利說明】番茄紅素在製備防治老年痴呆藥物中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於醫藥領域，涉及防治老年痴呆的藥物。

【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer Disease,AD)是一種典型的神經退行性疾病，是最常見 的痴呆形式，其主要臨床症狀為近記憶力損害，認知能力下降和思維障礙，且進行性加重， 最後因生活不能自理而死亡，病程一般8?10年。隨著社會老齡化進程的加快，AD的患病 人數急劇上升，已成為威脅老齡特別是高齡人群身心健康的頭號疾病，並給社會和家庭帶 來了嚴重的負擔。
[0003] AD病人大腦的主要病理改變是大量神經纖維纏結（neurofibrillary tangles, NFTs)和老年斑（senile plaque, SP)的形成，其分子標誌物分別是異常磷酸化的tau蛋白 和β_澱粉樣蛋白（Αβ)。國外學者已採用轉基因技術，在小鼠成功地複製出β-澱粉樣蛋 白沉積形成的老年斑樣病變，從而使得未來AD治療將減少Α β沉積作為藥物幹預的靶標成 為可能。NFTs的數量與AD臨床痴呆程度正相關。因此，幹預NFTs對AD的防治尤為重要。 自從發現NFTs的主要成分是異常高度磷酸化的tau蛋白聚集形成的雙螺旋絲以來，國內外 學者普遍認為，骨架蛋白tau的異常高度磷酸化是NFTs形成的關鍵步驟。高度磷酸化tau 蛋白的聚集不僅以神經纏結的形式存在，它也是神經氈纖絲和老年斑中的營養不良突起的 主要成分。
[0004] 目前尚沒有針對老年性痴呆病理特徵的特效治療藥物和方法，常用的減緩老年痴 呆發作藥物有：（1)改善膽鹼神經傳遞藥物：老年痴呆的一個主要原因是膽鹼不足導致記 憶衰退。因此乙醯膽鹼酯酶（AchE)抑制劑通過增強膽鹼能作用在老年痴呆治療方面發揮 了重要作用；（2)改善腦血液循環和腦細胞代謝的藥物：此類藥物可以擴張腦血管以改善 老年痴呆患者的糖、蛋白、核酸、脂質等代謝障礙；（3)鈣拮抗劑：此類藥物易於通過血腦屏 障，選擇性擴張腦血管，從而改善記憶和認知功能；(4)激素類藥物：主要緩解女性患者的 症狀。然而，這些藥物僅對中晚期老年性痴呆患者的痴呆症狀有所輕度改善或延緩痴呆進 展。因此研發新的針對老年性痴呆病理學特徵的藥物，成為全球的期待。
[0005] 番茄紅素是一種類胡蘿蔔素烴，屬於天然的紅色色素，大量存在於紅色的水果和 蔬菜中，如西紅柿，木瓜，粉紅葡萄柚，番石榴和西瓜。番茄紅素天然且有益健康，有"植物黃 金"之稱，是很好地抗氧化劑。除清除自由基作用外，番茄紅素還能夠抑制基因的誘變，並可 以通過影響細胞間縫隙連接調節生長代謝。並且先前的一些在體和離體實驗均表明，
[0006] 番茄紅素對慢性疾病如心血管疾病，動脈粥樣硬化，癌症（特別是前列腺癌）和神 經退行性疾病具有保護作用。目前美國、法國、日本、澳大利亞均已相繼出品相關的藥物或 保健品。


【發明內容】

[0007] 本發明的任務是提供一種用於預防和治療老年性痴呆藥物。
[0008] 實現本發明的具體方案是：
[0009] 本發明提供的用於預防和/或治療老年性痴呆藥物的藥物是番茄紅素 (Lycopene)。本發明揭示，番爺紅素（Lycopene)能減少老年性痴呆大鼠大腦皮質和海馬區 骨架蛋白tau的異常過度磷酸化並改善動物學習、記憶障礙。番茄紅素（Lycopene)能用於 老年性痴呆的預防和/或治療。
[0010] 實驗資料：
[0011] 本發明通過給大鼠灌服番茄紅素（Lycopene)，發現其可以改善AD樣動物模型的 tau蛋白過度磷酸化與學習、記憶障礙。
[0012] 具體操作步驟如下：
[0013] 1.實驗對象
[0014] 雄性Wistar大鼠（華中科技大學同濟醫學院實驗動物實驗中心提供），SPF級，體 重250?300克，45隻，常規環境飼養。隨機分為三組：①正常組（con);②造模組（hey); ③治療組（hcy+lyco);
[0015] 2.實驗模型製備
[0016] ①正常組：尾靜脈注射生理鹽水，lml/kg。
[0017] ②造模組：通過尾靜脈注射給予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次， 持續14天，劑量為400 μ g/kg，構建早老性痴呆動物模型。
[0018] ③治療組：通過尾靜脈注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，劑量為400 μ g/ kg，每天1次，持續14天；然後大鼠灌胃給予番爺紅素（Lycopene)，每天一次，持續14天， 劑量為40mg/kg。
[0019] 3.研究方法
[0020] 大鼠學習記憶的能力：Morris水迷宮訓練及測試；離體腦片LTP技術；高爾基染 色海馬磷酸化tau陽性細胞的顯示：免疫印跡
[0021] 4.實驗結果
[0022] *Ρ〈0· 05,與正常組比較
[0023] **Ρ〈0. 01，與正常組比較
[0024] *#Ρ〈0. 001，與正常組比較
[0025] #Ρ〈0· 05，與造模組比較
[0026] ##Ρ〈0. 01，與造模組比較
[0027] ###Ρ〈0· 001，與造模組比較
[0028] (DMorris水迷宮訓練及測試結果：造模組與正常組相比出現明顯學習記憶障礙 (圖1)，統計結果表明水迷宮測試的潛伏期明顯延長，學習的時間延長，見圖1。造模組在目 標象限停留時間和距離以及穿越平臺的次數明顯減少，見圖2,說明記憶能力的減退。治療 組與造模組相比潛伏期時間變短，目標象限停留次數和穿越平臺次數增加，其學習和記憶 能力都得到了良好的改善。
[0029] (2)腦片LTP結果（見圖3):造模組與治療組的興奮性突觸後電位（fEPSP)的斜 率分別增加了約1. 2倍和1. 6倍，說明Hey破壞了突觸的功能，而同時補充番茄紅素能夠使 EPSP的斜率得到有效的恢復，從而改善學習記憶能力。
[0030] (3)高爾基染色結果（見圖4) :Hcy處理組的大鼠腦片中，CA1區神經元樹突棘密 度和成熟的蘑菇型樹突棘均出現了明顯的減少，而同時補充番茄紅素能夠有效的挽救這種 改變。
[0031] (4) Tau磷酸化免疫印跡結果（見圖5)
[0032] 與正常組相比較，造模組大鼠的大腦海馬內tau蛋白在絲氨酸198/199/202,蘇氨 酸205,絲氨酸212,絲氨酸214,絲氨酸262,絲氨酸396,絲氨酸404位點，磷酸化水平明顯 增高，番爺紅素（Lycopene)治療後，tau磷酸化水平明顯下降。
[0033] 5.結論及用法建議：
[0034] 以上結果顯示給予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)尾靜脈注射的老鼠水迷宮 訓練及檢測過程中平臺的潛伏期增加，穿越平臺次數明顯減少說明大鼠的學習和記憶能力 損傷，檢測早老性痴呆相關指標tau蛋白磷酸化，tau蛋白的磷酸化水平顯著上升，說明大 鼠早老性痴呆造模成功。
[0035] 跟造模組相比較，在給與了番茄紅素（Lycopene)處理後，檢測老鼠水迷宮行為 學，其學習和記憶能力得到了有效的改善；同時，早老性痴呆相關指標tau蛋白磷酸化明顯 降低以及記憶相關的突觸功能明顯改善，說明番茄紅素（Lycopene)能緩減老年性痴呆大 鼠大腦皮質和海馬區骨架蛋白tau的異常過度磷酸化並改善動物學習、記憶障礙。番茄紅 素（Lycopene)能用於老年性痴呆的預防和治療。番茄紅素作為一種天然且含量豐富的物 質，
[0036] 是安全也無不良作用的。
[0037] 參考徐舒雲教授主編的《藥理實驗方法學，》在其附錄中有一個表，列出了人和動 物按體表面積折算的等效劑量比值。我們可以算出大鼠劑量與人的比值：
[0038] 大鼠體型係數：0· 09標準體重：200g = 0· 2kg
[0039] 大鼠的折算係數=(體型係數大鼠*W大鼠2/3 V (體型係數人*W人2/3)
[0040] =(0· 09*0. 22/3)/0· 1*702/3)*70Χ/0·4
[0041] =0.018
[0042] 我們理想的認為，對任何藥物，大鼠和人的敏感程度是完全一樣的，經換算後人的 臨床劑量約為〇· 72mg/d。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1為水迷宮測試大鼠鼠遊泳學習軌跡圖和潛伏期統計結果。圖中：*P〈0. 01， 與正常組比較；***P〈〇. 01，與造模組比較。正常組：尾靜脈注射生理鹽水，lml/kg。造 模組：通過尾靜脈注射給予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持續14天， 劑量為400 μ g/kg，構建早老性痴呆動物模型。治療組：通過尾靜脈注射同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hey)，劑量為400 μ g/kg，每天1次，持續14天；然後大鼠灌胃給予番爺紅 素（Lycopene),每天一次，持續14天，劑量為40mg/kg。
[0044] 雄性Wistar大鼠隨機分為三組①正常組：尾靜脈注射生理鹽水，lml/kg。②造 模組：通過尾靜脈注射給予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持續14天， 劑量為400 μ g/kg，構建早老性痴呆動物模型。③治療組：通過尾靜脈注射同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hcy)，劑量為400μ g/kg，每天1次，持續14天；然後大鼠灌胃給予番爺紅 素（Lycopene),每天一次，持續14天，劑量為40mg/kg。
[0045] 實驗所採用Morris水迷宮測試系統包括圓形水池直徑120cm，高60cm ;圓柱形有 機玻璃平臺直徑l〇cm，高40cm。水池中水面高約45cm，室溫及水溫均保持在26± 2°C，平臺 放置於某一象限的中心位置，並沒於水面下約2cm。訓練時將大鼠從任一象限1/2弧度處頭 面向池壁輕放於水中，檢測其潛伏期（即大鼠從入水點起到找到平臺所用的時間）、遊泳路 徑作為衡量大鼠學習記憶和測試成績的指標。每隻大鼠每天在3個象限訓練1次，每次遊 泳時限為60s，即在60s內未找到平臺者系統自動停止記錄，潛伏期記60s，由測試者引導 其上臺，適應30s後進行下一次訓練。首先進行為期6天的訓練，然後讓大鼠休息1天，第 8天，撤去平臺進行測試，記錄大鼠找到平臺的潛伏期，目標象限停留時間及目 [0046] 標平臺穿越次數。
[0047] 結果顯示跟正常組相比造模組大鼠遊泳軌跡混亂，找到平臺所需潛伏期時間最 長，說明大鼠學習能力受到損傷，在給予番茄紅素（Lycopene)後，治療組大鼠跟造模組相 比軌跡重新恢復簡單，潛伏期變短，學習能力得到明顯改善。
[0048] 圖2為水迷宮測試老鼠穿越平臺次數及時間和距離統計結果。圖中：*p〈0. 05， **p〈0. 01，與正常組比較；#p〈0. 05與造模組比較。正常組：尾靜脈注射生理鹽水，lml/ kg。造模組：通過尾靜脈注射給予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持續14 天，劑量為400 μ g/kg，構建早老性痴呆動物模型。治療組：通過尾靜脈注射同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hey)，劑量為400 μ g/kg，每天1次，持續14天；然後大鼠灌胃給予番爺紅 素（Lycopene)，每天一次，持續14天，劑量為40mg/kg。
[0049] Morris水迷宮測試系統經過6天訓練，大鼠學會如何尋找平臺後。休息一天，去平 臺，計算3分鐘內大鼠在目標象限的停留時間並分析其在平臺所在位置的穿越次數，以評 價其記憶能力。
[0050] 結果表明造模組大鼠穿越平臺的時間和距離最短，次數最少，說明造模組老鼠的 記憶能力受到損害，不記得平臺的位置；治療組大鼠跟造模組相比穿越平臺的時間和距離 恢復到正常一致，穿越平臺次數也相應增加，其記憶能力在給予番茄紅素（Lycopene)後得 到明顯恢復。
[0051] 圖3為腦片LTP結果。圖中：#P〈0. 01，與造模組比較。造模組：通過尾靜脈注射 給予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持續14天，劑量為400 μ g/kg，建立早 老性痴呆動物模型。治療組：通過尾靜脈注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，劑量為 400 μ g/kg，每天1次，持續14天；然後大鼠灌胃給予番爺紅素（Lycopene)，每天一次，持續 14天,劑量為40mg/kg。
[0052] 大鼠斷頭後，立即將腦組織取出，並浸入連續通入95% 02和5% C02的冰冷的人 工腦脊液（ACSF ;125mM NaCl, 2. OmM KC1, 1. 2mM MgS04, 2. 5mM CaC12, 1. 2mM KH2P04, llmM glucose and26mM NaHC03)。用振動切片機進行旁矢狀面切片。切好的腦片應在通 氧的ACSF(34±1°C )中進行預培養至少1小時。隨後，將腦片轉移至不斷循環灌注 ACSF(1. 0-1. 3ml/min)的浸沒式記錄腔（溫度保持在34土 1°C )。用平面多電極記錄設置 (MED64系統，Alpha Med Sciences)記錄局部的興奮性突觸後電位（fEPSP)。
[0053] 結果顯示fEPSP的斜率分別增加了約1. 2倍和1. 6倍，說明Hey破壞了突觸的功 能，並且同時補充番茄紅素後，EPSP的斜率得到了有效的恢復。這些數據表明，番茄紅素能 有
[0054] 效地逆轉Hey誘導的突觸傳遞缺陷。
[0055] 圖4為高爾基染色結果。圖中：*P〈0. 05，#P〈0. 01，與正常組比較；#P〈0. 05,與治 療組比較。正常組：尾靜脈注射生理鹽水，lml/kg。造模組：通過尾靜脈注射給予同型半胱 氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持續14天，劑量為400 μ g/kg，構建早老性痴呆動物 模型。治療組：通過尾靜脈注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，劑量為400 μ g/kg，每 天1次，持續14天；然後大鼠灌胃給予番茄紅素（Lycopene)，每天一次，持續14天，劑量為 40mg/kg〇
[0056] 為了進一步驗證番茄紅素對突觸功能的改善作用，我們還進行了重要的突觸後成 分-樹突棘的形態觀察與分析。動物行為學檢測完畢後，用6%水合氯醛（0.6ml/kg)將大 鼠麻醉，先經心臟快速灌注500ml含0. 5%的亞硝酸鈉的生理鹽水進行循環衝洗，然後用 500ml4%的甲醛生理鹽水溶液灌注，待大鼠肢體抽搐後改為慢滴，經充分固定後，等待兩個 小時，然後在避光條件下用500ml Golgi媒染液（5%水合氯醛，5%的重鉻酸鉀，4%甲醛） 行灌注染色，灌注完成後，靜置2個小時。將腦組織取出，切成厚5-10_的腦片，室溫避光條 件下置於媒染液中繼續染色3天，注意每天更換新染液，保證染色完全。染色完成後，先用 1 %的硝酸銀溶液漂洗，然後再將腦片置於1 %的硝酸銀溶液中進行鍍銀還原3天，注意全 程避光，且每天更換新溶液，使鍍銀充分。上述各項完成後，振蕩切片機切片，厚度約35um， 將切好的腦片置於2%重鉻酸鉀溶液中漂洗，約0. 5h後，將腦片置於雙蒸水中貼片，然後常 規脫水，透明，封片後觀察。
[0057] 運用高爾基染色方法，我們發現，Hey處理組的大鼠腦片中，CA1區神經元樹突棘 密度和成熟的蘑菇型樹突棘均出現了減少，而補充番茄紅素能夠恢復這種改變。以上數據 均表明，番茄紅素可能降低了 Hey引起的突觸損傷，從而減輕甚至挽救了記憶損害。
[0058] 圖5為大鼠海馬內tau蛋白磷酸化位點磷酸化水平免疫印跡結果。圖中： *卩〈0.05，*撲〈0.01，#撲〈0.001，與正常組比較 ；#?〈0.05，###?〈0.001，與治療組比較。正 常組：尾靜脈注射生理鹽水，lml/kg。造模組：通過尾靜脈注射同型胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持續14天，劑量為400 μ g/kg，構建早老性痴呆動物模型。治療組：通過尾 靜脈注射同型半胱氨酸（Homocysteine，Hey)，劑量為400 μ g/kg，每天1次，持續14天；然 後大鼠灌胃給予番爺紅素（Lycopene),每天一次，持續14天，劑量為40mg/kg。
[0059] 6%水合氯醒麻醉（0.61111/1^)處死大鼠,迅速取出大腦腦組織置於0-4°(：0.05皿 Tris緩衝鹽溶液（TB，pH7.0)內，快速分離雙側海馬，製成10 %的蛋白勻漿，12000g離心15 分鐘，取上清，測定蛋白含量後備用。
[0060] 分別檢測tau蛋白不同位點的磷酸化水平，包括Ser214的（PS214)， Thr231(PT231),
[0061] Ser262(PS262)和Ser396(PS396)檢測非磷酸化位點taul的水平以及總tau5的 水平變化。β-actin為內參條帶，證明蛋白上樣量的一致性。通過與總tau5比較，造模組 非磷酸化位點taul磷酸化水平明顯減少，磷酸化位點PS396, PS404, PS212, PS205磷酸化 水平明顯增加，tau發生過度磷酸化；治療組給予番茄紅素（Lycopene)後，tau的過度磷酸 化得到降低，恢復到和正常組相近水平。

【具體實施方式】
[0062] 實施例1
[0063] 通過給大鼠灌服番爺紅素（Lycopene)，發現其可以改善AD樣動物模型的tau蛋白 過度磷酸化與學習、記憶障礙。
[0064] 1.實驗對象：雄性Wistar大鼠（華中科技大學同濟醫學院實驗動物實驗中心提 供），SPF級，體重250?300克，45隻，常規環境飼養。隨機分為三組：①正常組（con);② 造模組（hey);③治療組（hcy+lyco);
[0065] 2.實驗模型製備及實驗給藥：
[0066] ①正常組：尾靜脈注射生理鹽水，lml/kg。②造模組：通過尾靜脈注射給予同型半 胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持續14天，劑量為400 μ g/kg，構建早老性痴呆動 物模型。③治療組：通過尾靜脈注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，劑量為400 μ g/ kg，每天1次，持續14天；然後大鼠灌胃給予番爺紅素（Lycopene)，每天一次，持續14天， 劑量為40mg/kg。
[0067] 3.研究方法：
[0068] 大鼠學習記憶的能力：Morris水迷宮訓練及測試；離體腦片LTP技術；高爾基染 色海馬磷酸化tau陽性細胞的顯示：免疫印跡。
[0069] 4.實驗結果：參見附圖，附圖中符號標識表示：*P〈0. 05,與正常組比較； **P〈0. 01，與正常組比較；*#P〈0. 001，與正常組比較；#P〈0. 05,與造模組比較；##P〈0. 01， 與造模組比較；###P〈〇. 001，與造模組比較。
[0070] (DMorris水迷宮訓練及測試結果：造模組與正常組相比出現明顯學習記憶障礙 (圖1)，統計結果表明水迷宮測試的潛伏期明顯延長，學習的時間延長，見圖1。造模組在目 標象限停留時間和距離以及穿越平臺的次數明顯減少，見圖2,說明記憶能力的減退。治療 組與造模組相比潛伏期時間變短，目標象限停留次數和穿越平臺次數增加，其學習和記憶 能力都得到了良好的改善。
[0071] (2)腦片LTP結果（見圖3):造模組與治療組的興奮性突觸後電位（fEPSP)的斜 率
[0072] 分別增加了約1. 2倍和1. 6倍，說明Hey破壞了突觸的功能，而同時補充番茄紅素 能夠使EPSP的斜率得到有效的恢復，從而改善學習記憶能力。
[0073] (3)高爾基染色結果（見圖4) :Hcy處理組的大鼠腦片中，CA1區神經元樹突棘密 度和成熟的蘑菇型樹突棘均出現了明顯的減少，而同時補充番茄紅素能夠有效的挽救這種 改變。
[0074] (4)Tau磷酸化免疫印跡結果（見圖5):與正常組相比較，造模組大鼠的大腦海馬 內tau蛋白在絲氨酸198/199/202,蘇氨酸205,絲氨酸212,絲氨酸214,絲氨酸262,絲氨 酸396,絲氨酸404位點，磷酸化水平明顯增高，番爺紅素（Lycopene)治療後，tau磷酸化 水平明顯下降。
[0075] 5.結論：以上結果顯示給予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)尾靜脈注射的老 鼠水迷宮訓練及檢測過程中平臺的潛伏期增加，穿越平臺次數明顯減少說明大鼠的學習和 記憶能力損傷，檢測早老性痴呆相關指標tau蛋白磷酸化，tau蛋白的磷酸化水平顯著上 升，說明大鼠早老性痴呆造模成功。
[0076] 跟造模組相比較，在給與了番茄紅素（Lycopene)處理後，檢測老鼠水迷宮行為 學，其學習和記憶能力得到了有效的改善；同時，早老性痴呆相關指標tau蛋白磷酸化明顯 降低以及記憶相關的突觸功能明顯改善，說明番茄紅素（Lycopene)能緩減老年性痴呆大 鼠大腦皮質和海馬區骨架蛋白tau的異常過度磷酸化並改善動物學習、記憶障礙。番茄紅 素（Lycopene)能用於老年性痴呆的預防和治療。
【權利要求】
1. 番爺紅素（Lycopene)在製備用於預防和/或治療老年性痴呆藥物中的應用。
2. -種用於預防和/或治療老年性痴呆藥物，其特徵在於含有活性成分番茄紅素 (Lycopene)〇
3. -種用於預防和/或治療老年性痴呆的藥物製劑，其特徵在於，它由作為活性成分 的番茄紅素（Lycopene)和藥學上可接受的載體和/或添加劑組成。
【文檔編號】A61P25/28GK104083345SQ201410263970
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】朱鈴強, 高鑫雅, 劉丹, 王志昊, 馬禹佳, 毛璐 申請人:華中科技大學