一種數字全息顯微及成像技術用途及檢測已標記細胞樣本的方法
2023-09-20 23:41:15 4
專利名稱：一種數字全息顯微及成像技術用途及檢測已標記細胞樣本的方法
技術領域：
本發明涉及一種數字全息顯微及成像技術的用途及方法，所述數字全息顯微及成像技術用於檢測細胞的已標記或已著色的分子或構造，或者檢測已綴合抗體的所述細胞的分子或構造的方法，所述抗體直接附著在所述細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述細胞上。
背景技術：
人們對生物研究對象信息的更豐富更精確的需求永遠都不會停止，比如人體、動物體、植物體以及其它生物體中的細胞。細胞非常細小並且只有極少的部分構造可以通過光學顯微鏡輕易辨識。現在已經開發了很多可以將細胞及細胞構造看得更清楚的不同方法。這些方法中有很多都會包括將整個細胞或者部分細胞構造著色的著色步驟。所著的顏 色可以是螢光的或者非螢光的。比如臺盼藍就是廣為使用的對整個細胞著色的非螢光著色齊U。臺盼藍只能用在死細胞上。由於不同的著色劑的屬性不同，給細胞著色的具體方法也隨之變化。比較新穎的一種標記方法是激發細胞自身產生螢光物質，比如產生綠色螢光蛋白(GFP)。這種標記可以是選擇性的，只顯示特定細胞構造，或者是非選擇性的，顯示整個細胞。另一種廣泛使用的方法叫做免疫標記，該方法使用抗體來標記細胞。抗體是脊椎動物體液中的一種蛋白質。抗體會附著到某些物質或者分子上去，比如細菌或病毒，這些東西隨後就被當做外來對象，抗體針對非常特殊的結構。這一特性對生物學或者醫學研究是非常有用的，因為抗體可以用於辨識細胞或者細胞的部分結構中非常特別的微小構造。抗體非常難於檢測，但是他們可以跟很多種不同的分子或者構造相綴合使他們清晰可見。不同的抗體綴合物適合不同的檢測方法，比如光學顯微、電子顯微、光譜測定或者放射性測定。綴合後的抗體可以用於直接附著目標。如果需要更強的標記，則可以通過先用未標記抗體附著目標然後用第二波的綴合後的抗體附著第一波的未綴合的抗體來對標記做放大。第一波抗體叫做主抗體而第二波叫做二級抗體。進一步地，如果標記還需要更強的話還可以使用更多層次的抗體。不同的著色劑、標記物以及抗體綴合物有不同的光學特性，比如對幾種或者許多種不同波長的光的吸收能力，釋放特定波長的光的能力，散射光或者偏振光的能力。這些不同的特性使得著色劑在使用光學顯微鏡、相差顯微鏡、螢光顯微鏡或流式細胞儀的時候顯示出不同顏色或者有螢光效果。也可以使用譬如分光光度計或者螢光分析儀測量這些著色劑、標記物或綴合物。可以提供不同吸光率的抗體綴合物有量子點、塑料球、玻璃珠以及半導體。可以散射光或偏振光的抗體綴合物有磁性微球、金顆粒、納米晶體或磁珠。數字全息顯微使得對活細胞的研究不再需要標記。在W02009/154558中描述了一個數字全息顯微所使用的觀測器皿以及使用所述器皿進行數字全息顯微的方法，其中披露了數字全息顯微技術使得對活細胞的研究不再需要標記或著色。事實是數字全息顯微及成像提供了單色圖像，這意味著直到現在人們還沒有關注把這樣的技術用於分析標記或著色的細胞樣本。標記的使用越來越多，對這些標記的興趣以及將這些標記運用到不同的樣本分析中去的興趣也不斷增加。W02007/073345披露了一種使用數字全息顯微技術研究細胞的方法，其中披露了分析細胞生長階段的方法以及實現分析的設備。如前所述，W02009/154558披露了另外一種使用數字全息顯微技術研究細胞的方法。如前述所言，數字全息顯微及成像技術提供的是單色光圖像。這意味著就像發明W02007/073345以及發明W02009/154558定義的那樣，該技術尚未在使用已標記以及已著色的細胞樣本方面引起關注
發明內容
本發明提供一種數字全息顯微及成像技術檢測至少一個細胞的已標記或已著色的分子或構造，或者檢測已綴合抗體的所述細胞的分子或構造的用途，所述抗體直接附著在所述細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述細胞上。而且，本發明還提供一個檢測該分子或構造的方法，所述方法對細胞樣品進行數字全息顯微並成像的步驟，包括
a)生成至少一束物光以及至少一束參考光，並且所述至少一束物光以及所述至少一束參考光為相干光；
b)將所述細胞樣本置於所述至少一束物光照射之下；
c)將穿過所述細胞樣本的所述至少一束物光與所述至少一束參考光疊加從而生成幹涉 d)檢測所述幹涉圖，即全息 e)重建所述幹涉圖的物光波前的相位和/或振幅信息；
f)構建至少一個細胞分析圖像來檢測至少一個細胞的已標記或已著色的分子或構造，或者檢測所述至少一個細胞的已綴合抗體的分子或構造，所述抗體直接附著在所述至少一個細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述至少一個細胞上。
具體實施例方式在數字全息顯微技術中，不需要依據不同的焦平面機械地調整顯微鏡就可以研究多個焦平面。只需要通過處理收集到的數據就可以對不同的焦平面進行研究了。所以，可以得到三維圖像。尤其是該方法的不良幹擾較少，噪音水平較低，細胞樣本的相位以及振幅信息精準並且細胞樣本的全息圖像解析度高。在一個本發明的方法的實施例之中，相干的至少一束物光以及至少一束參考光是通過將來自一個相干光源的一束光分成兩束得到的，比如使用分光器。來自相干光源的光束可以是雷射束。所述雷射束可以來自任何雷射源，比如氦氖雷射器或者二極體雷射器。優選為使用二極體雷射器。雷射源可以線性偏振。物光以及參考光是相干光，這意味著它們有共同的波長並且在時序中會表現出恆定的相位關係。
物光穿過細胞樣本。由於參考光被導向不同於物光的路徑，比如使用分光器、鏡子和/或光纖，所以參考光不受細胞樣本影響。物光在穿過細胞樣本之前有已知的波前。當物光通過該至少一個細胞樣本的時候，該細胞樣本實質上不會吸收任何光線，但是穿過細胞樣本的光線較之穿過周圍媒介其光程會不同。從細胞樣本出來的波前，即物光波前，會發生相移。當然參考光也有已知的波前。用物理的或幾何的厚度乘以折光率就是光程。在本發明的方法的一個實施例中，穿過細胞樣本的至少一束物光與至少一束參考光的疊加是通過將兩束光集合在一起實現的，比如使用另一個分光器。這種疊加會生成幹涉圖樣，它包括被所述至少一個細胞樣本影響過的物光波前的信息。在本發明的方法的一個實施例中，使用數字傳感器檢測所述幹涉圖樣，比如CCD或CMOS。檢測到的幹涉圖樣叫做全息圖。為了將所述通過細胞樣本的至少一束物光與至少一束參考光進行疊加並由此生成幹涉圖樣並檢測幹涉圖樣，就要用到傅立葉法或菲涅耳法。優選為使用菲涅耳法。傅立葉 法和菲涅爾法的差別在於光學構造，不同的光學構造意味著在滿足某種條件的時候得到不同的近似值，例如一個菲涅爾近似值，用於重建算法。這個近似值簡化了圖像重建的過程。在菲涅爾法中，所述條件是指物體與傳感器之間的距離比物體以及傳感器的尺寸要大。該條件是通過使用一個顯微鏡物鏡收集物體散射的光並以幾乎平行的光束的形式將散射的光導給傳感器來實現的。這樣就生成了一個遠離傳感器的虛擬對象。通過檢測到的幹涉圖樣，物光波前的相位和/或振幅信息得以重建。所述重建可以通過任何常見的數值重建進行，比如傅立葉變換重建或者積分重建。振幅信息可以用於設置想要的焦平面。重建的信息可以用於獲得所研究的細胞樣本的二維或三維圖像。作為生成一束物光和一束參考光的替代方案，還可以使用同軸數字全息技術。本技術領域人員顯然很容易根據本說明書的描述知道如何修改本發明的方法從而使用同軸數字全息術。取得的一個圖像可以進一步用於計算機圖形處理以認定所研究的對象的有用信息，比如形狀、容量以及光密度。取得的多個圖像也可以進一步用於圖形處理以認定所研究的對象的其它有用信息，比如形狀、容量以及光密度的變化。本發明的具體的實施例
在某些實施例中，分子或者構造或者抗體是附著在所述至少一個細胞的細胞表面的。這進一步改進了本發明的友好性，因為傷害細胞的風險降低了。在使用本發明的數字全息顯微以及成像系統的某些實施例中，分子或構造在特定波長範圍內具有一個吸光峰值和/或偏移該數字全息顯微及成像技術所用的光的偏振方向的能力。利用在特定波長範圍內具有吸光峰值的特點的分子或構造就可以對這些分子或構造進行檢測。利用在具有偏移光束的偏振方向的特點的分子或構造就可以對分子或構造進行檢測。根據本發明的數字全息顯微及成像技術的應用的一個具體實施例，對至少一個細胞上的一處或多處的不止一種類型的分子或構造進行著色或標記，或者與同一類型的抗體相綴合，所述抗體可以是直接附著也可以間接通過另一抗體或一條鏈上的多個抗體附著到所述至少一個細胞上，並且其中至少一種分子或構造在特定波長範圍內有吸光峰值且至少一種分子或構造會偏移該數字全息顯微及成像技術中使用的光束的偏振方向。根據這一實施例，在特定波長範圍有吸光峰值的分子或構造以及可以偏移偏振方向的分子或構造是一起使用的，即使用兩種不同的分子或構造。通過將這些特性綴合起來，就有可能取得由不同波長的光所生成的圖像以及由不同偏振方向所生成的圖像這兩種圖像。當同時取得這兩種圖像時，對細胞以及附著在其上的分子或構造的檢測的可靠性就增加了。根據本發明的數字全息顯微及成像技術的應用的一些實施例，使用的具體分子或構造在特定波長範圍內具有一個吸光峰值並且能偏移數字全息顯微及成像技術所使用的光的偏振方向。在這些實施例中，分子或構造既可以在特定波長範圍內高峰吸光也可以偏移偏振方向，也就是只使用一種分子或構造。如前所述，通過綴合這些特性，既可以取得由不同波長的光所生成的圖像也可以取得由不同偏振方向所生成的圖像。當同時取得這兩種圖像的時候，對分子或構造的檢測就更可靠了，從而對這些分子或構造所附著的細胞的檢測也更可靠了。 根據本發明的數字全息顯微及成像技術的應用的一些實施例，用來照射所述分子或構造的數字全息顯微以及成像技術所使用的光至少有兩種彼此不相同的波長。通過用至少有兩種不同波長的光來照射分子或構造，檢測分子或構造的可靠性提高了。根據本發明的數字全息顯微及成像技術的應用的一些實施例，數字顯微成像系統會偏移其使用的至少一束物光和/或至少一束參考光的偏振方向。通過偏移物光和/或參考光的偏振方向，檢測分子或構造的可靠性提高了。優選地，所述至少一束物光以及至少一束參考光的偏振方向偏移以後得到的偏振方向彼此垂直或大體上相互垂直。開始的時候所述至少一束參考光以及所述至少一束物光的偏振方向通常是一樣的。然而，為了檢測能夠隨機改變光束偏振方向的分子或構造，與所述至少一束參考光相關的所述至少一束物光的偏振方向應當偏移到使彼此垂直的方向。根據本發明的這一實施例，沒有必要使所述至少一束參考光與所述至少一束物光之間的角度精確到90或270度才能用來檢測能偏移光束偏振方向或能隨機改變偏振方向的分子或構造。然而，隨著所述至少一束物光的偏振方向與所述至少一束參考光的偏振方向的角度偏移成直角，要檢測分子及構造會更容易。根據本發明，小於或大於90度的角也可以，比如75-89度的角或91-105度的角或者是255-269度或271-285度的角。但是，在角度為90度或270度的時候，可以檢測的幹涉圖樣只會來自於本身可以隨機改變偏振方向的分子或構造。根據本發明的一個具體實施例的有關方法，其中使用了兩個或以上的波長的光，其中所使用的具體的分子或構造在一個波長範圍內有一個吸光峰值，所述波長範圍包含所使用的兩個或以上的波長中的一個但不是全部，並且其中針對所使用的每個波長都進行了步驟a)到f)的操作，從而使得可以將在步驟f)中由不同波長生成的，一個所述細胞的圖像以及另一相同所述細胞的圖像進行比較。通過使用兩個或以上的波長光束，是可以提高本發明的方法的可靠性的。如果使用的分子或構造在特定波長範圍內有吸光峰值，那就可以使用至少一個波長在該範圍內的光束以及一個波長不在該範圍內的光束。如此一來，對該分子或構造的實際檢測就可以確定了。此外，通過使用至少兩個波長的光並各自產生一個圖像，就可以將取得的圖像進行對比。由於在特定波長範圍具有吸光峰值的分子或構造的波長範圍至少覆蓋了所使用的波長中的一個而不覆蓋另一個，所以所述分子或構造至少會影響圖像中的一個而不影響另一個。通過比較被影響的圖像和未被影響的圖像就可以檢測分子或構造了。實施這種涉及兩個或以上波長的方法的一種方式是針對所使用的波長之一進行步驟a)到步驟f)然後再針對所使用的另一波長進行步驟a)到f)，如果使用的波長在兩個以上，則對剩餘的波長一一進行步驟a)到f)。一種替代的方式是先對所使用的一個波長進行步驟a)到d)再對使用的另一波長進行步驟a)到d)，如果使用了兩個以上波長則對剩餘的波長一一進行步驟a)到d)。之後可以對所有使用的波長同時進行步驟e)到f)。這一替代方式提高了實施該方法的速度減少了實施本方法的時間。 在本發明的方法的一些實施例中，使用的是兩種波長，一種包含在所使用的具體的分子或構造的吸光峰值所在的波長範圍內，另一種則不在該範圍內，這樣的實施例中會生成兩個細胞分析圖像來進行對比。—般說來，實施該方法使用兩種不同波長就足夠了，因為可以得到一張被分子或構造影響的圖以及一張未被分子或構造影響的圖。這樣，就能夠比較兩張不同的圖並檢測分子或構造。通過僅使用兩個波長，本方法的效率較使用兩個以上的波長也會提高。但是使用兩個以上波長的話精確度會提高。根據本發明的方法的另一具體實施方式
，所使用的特定的分子或構造會偏移光束的偏振方向，並且該實施例中步驟a)到f)的進行的次數中，至少有一次在步驟a)中不會包括偏移物光和/或參考光的偏振方向的步驟，並且至少有一次在步驟a)中會包括偏移物光和/或參考光的偏振方向的步驟，從而能夠將一個所述細胞以及另一相同所述細胞在步驟f)中由不同偏振方向生成的圖像中進行比較。在這一實施例中，至少生成一個被所使用的分子或構造偏移了偏振方向的圖。當物光或參考光的偏振方向被偏移以後，會隨機偏移偏振方向的分子或構造就可以被看見了。對所述至少一個物光和/或至少一個參考光的其中之一進行偏移從而讓它們彼此呈垂直或幾乎垂直，並且不引入任何自身能夠偏移偏振方向的分子或構造，這樣就會得到一個不會顯示任何東西的「零圖樣」。但是根據本發明的這一實施例，如果使用了分子或構造，則所述分子或構造會偏移偏振方向，則所述偏移會在圖樣中顯示。這也是一種消除相關不確定性的方式——如果你實際上觀察的是至少一個已標記或已著色細胞的分子或構造，或者檢測已綴合抗體的所述至少一個細胞的分子或構造，並且所述抗體直接附著在所述至少一個細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述至少一個細胞上。必須認識到的一點是「偏移所述至少一束物光和/或至少一束參考光的偏振方向」並不包括同時偏移所述至少一束物光以及至少一束參考光，因為同時偏移生成的圖像會與不偏移物光和/或參考光的彼此相對的偏振方向生成圖像等效，即回到初始的位置或偏移到與進行偏移之前等效的位置。根據本發明的方法的一個具體實施例，使用的具體分子或構造會偏移光束的偏振方向，並且其中步驟a)到f )實施的次數中至少一次包括且至少一次不包括在步驟a)中對物光和/或參考光的偏振方向進行偏移，所述偏移是使二者的偏振方向垂直或幾乎垂直，由此使得可以將一個所述細胞以及另一相同所述細胞在步驟f)中由不同偏振方向生成的圖像中進行比較。讓物光與相關的參考光的光束偏振方向垂直的益處之前已經做過進一步的描述。這種涉及步驟a)到f )的執行並且在步驟a)中包括或不包括物光和/或參考光的偏移的方法的實施方式之一是在執行步驟a)到步驟f)的時候在步驟a)中不進行物光和/或參考光的偏移，然後再次執行步驟a)到f)的時候進行物光和/或參考光的偏移。一個替代的方式是先執行a)到d) —次並且在步驟a)中不進行所述偏振，然後再執行a)到d) —次並且在步驟a)中進行所述偏振。然後，步驟e)到f)可以接著之前執行過的步驟繼續執行。這一替代方式提高了該方法的執行速度，也就是降低了執行該方法的時間。在根據本發明的某些實施例，使用了一種以上的分子或者構造，並且其中至少有 一種分子或者構造在特定波長範圍內有吸光峰值並且至少還有一種分子或構造會偏移所述至少一束物光和/或至少一束參考光的偏振方向。在這些實施例中，在特定波長範圍內有吸光峰值的以及具有偏移所述物光和/或參考光的偏振方向能力的分子或構造是一起使用的，也就是說，有用到兩種不同類型的分子或構造。通過綴合這些特性，就有可能同時取得不同波長的光生成的圖像以及不同偏振方向的光生成的圖像。當同時取得這兩種圖像的時候，對分子或構造所附著的細胞的檢測的可靠性就提高了。在本發明的方法的某些實施例中，所使用的具體的分子或構造在在特定波長範圍內有吸光峰值並且能夠偏移至少一束物光和/或至少一束參考光的偏振方向。在這些實施例中，使用了同時具有吸光峰值以及偏移能力的分子或構造，也就是使用了一種類型的分子或構造。如前所述，通過綴合這些特性，我們有可能同時取得不同吸光峰值以及不同偏振方向產生的圖像，那麼對分子或構造的檢測的可靠性就增加了，所以對分子或構造所附著的細胞的檢測的可靠性也提高了。在本發明的方法的某些實施例中使用了兩種以上的波長，並且其中所使用的分子或構造中至少有一種的吸光峰值的波長範圍至少覆蓋了一個所使用的所述波長，但是沒有覆蓋所使用的所有波長，其中針對所使用的每一個波長都進行一次步驟a)到步驟f)的操作，並且其中所使用的分子或構造中至少有一種類型能夠偏移光線的偏振方向，其中步驟a)到步驟f)的過程中在步驟a)至少有一次會對至少一束物光和/或至少一束參考光進行偏移並且至少有一次不對至少一束物光和/或至少一束參考光進行偏移，從而可以對所述一個細胞及至少另一個相同細胞在不同波長以及不同偏振方向產生的圖像中進行對比。在這些實施例中會取得由不同波長的光束所產生的圖像以及由不同偏振方向所產生的圖像。所以，能夠同時分析這兩種因素，從而使得對分子或構造的檢測的可靠性以及對分子或構造所附著的細胞的檢測的可靠性都提高了。該方法的這些實施例中至少產生三個圖像。這些圖像其中之一可以是使用第一波長並且在步驟a)中不做額外處理(偏移)得到的參考圖。這些圖像其中之一還可以是使用第二波長並且在步驟a)中不做額外處理(偏移)得到的圖像。這些圖像其中之一還可以是使用第一波長但是在步驟a)中作額外處理(偏移)的來的圖形。但是，為了增加該方法的精確度，不同波長的光束得到的圖像的數量以及不同偏振方向的光得到的圖像的數量都可以增加。而且，同樣在這一案子中，所述至少一束物光和 /或至少一束參考光的偏振方向可以進行偏移從而使得所述物光和參考光的偏振方向呈垂直或幾乎垂直的狀態。
權利要求
1.一種數字全息顯微及成像技術的應用，用於檢測至少一個細胞的已標記或已著色的分子或構造，或者檢測已綴合抗體的所述細胞的分子或構造，所述抗體直接附著在所述細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述細胞上。
2.根據權利要求I所述的應用，其特徵在於，所述分子或構造或抗體附著於所述至少一個細胞的表面。
3.根據權利要求I或2所述的應用，其特徵在於，所述分子或構造在特定波長範圍內具有吸光峰值和/或能夠偏移所述數字全息顯微及成像技術中所使用的光束的偏振方向。
4.根據權利要求I到3任意一項所述的應用，其特徵在於，至少一個細胞上的同一位置或多個位置的至少兩種以上類型的分子或構造進行了標記或者著色或者與同一種抗體進行了綴合，所述抗體直接附著到所述至少一個細胞或者間接通過另一個抗體或者一條鏈上的多個抗體附著到所述至少一個細胞上，並且其中至少一種分子或構造在特定波長範圍內具有吸光峰值並且其中至少一種分子或構造會偏移所述數字全息顯微及成像技術中所用的光束的偏振方向。
5.根據權利要求1-3任意一項所述的應用，其特徵在於，所使用的分子或構造在特定波長範圍內具有吸光峰值並且能夠偏移所述數字全息顯微及成像技術中所使用的光束的偏振方向。
6.根據權利要求1-5任意一項所述的應用，其特徵在於，所述數字全息顯微及成像技術使用具有兩種波長彼此不同的光束照射所述分子或構造。
7.根據權利要求1-6任意一項所述的應用，其特徵在於，所述數字全息顯微及成像技術用於偏移所述數字全息顯微及成像技術中使用的至少一束物光和/或至少一束參考光的 偏振方向。
8.根據權利要求1-7任意一項所述的應用，其特徵在於，所述數字全息顯微及成像技術用於偏移所述數字全息顯微及成像技術中使用的至少一束物光和/或至少一束參考光的偏振方向，從而使得所述至少一束物光以及所述至少一束參考光彼此的偏振方向相互垂直或幾乎垂直。
9.一種檢測至少一個細胞的已標記或已著色的分子或構造，或者檢測已綴合抗體的所述細胞的分子或構造的方法，所述抗體直接附著在所述細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述細胞上，所述方法包括針對細胞樣品執行數字全息顯微和成像的步驟，執行執行數字全息顯微和成像是通過下列步驟實現的 a)生成至少一束物光以及至少一束參考光，並且所述至少一束物光以及所述至少一束參考光為相干光； b)將所述細胞樣本置於所述至少一束物光照射之下； c)將穿過所述細胞樣本的所述至少一束物光與所述至少一束參考光疊加從而生成幹涉圖； d)檢測所述幹涉圖，即全息圖； e)重建所述幹涉圖的物光波前的相位和/或振幅信息； f)構建至少一個細胞分析圖像來檢測至少一個細胞的已標記或已著色的分子或構造，或者檢測所述至少一個細胞的已綴合抗體的分子或構造，所述抗體直接附著在所述至少一個細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述至少一個細胞上。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，使用兩種以上的波長的光束，其中所使用的分子或構造在特定波長範圍內具有吸光峰值，所述特定波長範圍覆蓋至少一種光束，但是不覆蓋所有的所述的兩種以上的波長的光束，並且其中針對所用的每一種波長都進行一次步驟a)到f)，使得能夠將一個所述細胞以及另一相同所述細胞在步驟f)中由不同波長所生成的圖像中進行比較。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，使用了兩種波長的光束，其中一種處於所述分子或構造的吸光峰值所要求的特定波長範圍內，另一種不處於所述特定波長範圍內，並且其中構建兩種細胞分析圖像進行比較。
12.如權利要求9-11中任意一項所述的方法，其特徵在於，所使用的分子或構造能夠偏移光束的偏振方向，並且其中步驟a)到f)的執行中，在步驟a)中至少有一次包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，使得能夠將一個所述細胞以及另一相同所述細胞在步驟f)中由不同偏振方向所生成的圖像中進行比較。
13.如權利要求9-12中任意一項所述的方法，其特徵在於，所使用的分子或構造能夠偏移光束的偏振方向，並且其中步驟a)到f)的執行中，在步驟a)中至少有一次包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，從而使得所述至少一束物光以及所述至少一束參考光彼此的偏振方向垂直或幾乎垂直，使得能夠將一個所述細胞以及另一相同所述細胞在步驟f)中由不同偏振方向所生成的圖像中進行比較。
14.如權利要求9-13中任意一項所述的方法，其特徵在於，使用了不止一種分子或構造並且其中至少一種分子或構造在特定波長範圍內有吸光峰值並且至少一種分子或構造能夠偏移所述至少一束物光和/或至少一束參考光的偏振方向。
15.如權利要求9-13中任意一項所述的方法，其特徵在於，所使用的分子或構造在特定波長範圍內具有吸光峰值並且能夠偏移所述至少一束物光和/或至少一束參考光的偏振方向。
16.如權利要求14或15所述的方法，其特徵在於，使用了至少兩種波長的光束，其中所使用的分子或構造中至少有一種在特定波長範圍內有吸光峰值，所述波長範圍覆蓋至少一種所述波長的光束，但是不覆蓋所用的全部兩種以上所述波長的光束，其中步驟a)到f)針對每種所述波長的光束均執行一次，並且其中所用的分子或構造至少有一種能夠偏移光束的偏振方向，其中步驟a)到f)的執行中，在步驟a)中至少有一次包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，使得能夠將一個所述細胞以及另一相同所述細胞在由不同波長及偏振方向生成的圖像中進行比較。
17.如權利要求14-16中任意一項所述的方法，其特徵在於，使用了至少兩種波長的光束，其中所使用的分子或構造中至少有一種在特定波長範圍內有吸光峰值，所述波長範圍覆蓋至少一種所述波長的光束，但是不覆蓋所用的全部兩種以上波長的光束，其中步驟a)到f)針對每種所述波長的光束均執行一次，並且其中所用的分子或構造至少有一種能夠偏移光束的偏振方向，其中步驟a)到f)的執行中，在步驟a)中至少有一次包偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，也至少有一次不包括偏移所述至少一束物光和/或所述至少一束參考光的偏振方向，使得所述至少一束物光和/或至少一束參考光彼此的偏振方向垂直或 幾乎垂直，從而能夠將一個所述細胞以及另一相同所述細胞在由不同波長及偏振方向生成的圖像中進行比較。
全文摘要
本發明涉及一種數字全息顯微及成像技術的用途及方法，所述數字全息顯微及成像技術用於檢測細胞的已標記或已著色的分子或構造，或者檢測已綴合抗體的所述細胞的分子或構造的方法，所述抗體直接附著在所述細胞上或者通過另外一個抗體或者另外一個鏈上的多個抗體附著在所述細胞上。
文檔編號G01N21/64GK102812404SQ201180008601
公開日2012年12月5日 申請日期2011年2月7日 優先權日2010年2月9日
發明者M·西貝斯塔, 柯爾斯基·阿爾姆, 安德斯·朗貝格, 安娜·莫爾德, 約翰·佩爾松, 倫納特·吉塞爾森 申請人:相位全息成像Phi有限公司