與高尿酸血症密切相關的新的人urat1基因snp位點的製作方法

2023-09-20 21:30:20 1

專利名稱：：與高尿酸血症密切相關的新的人urat1基因snp位點的製作方法
技術領域：
：本發明為與血液中尿酸水平密切相關的hURATl基因第三內含子SNP位點+11G〉A，涉及生物醫學高技術中新基因的開發與應用領域。
背景技術：
：尿酸是人體嘌呤代謝的終末產物，腎臟是尿酸排洩的主要途徑。腎臟對尿酸的排洩主要取決於腎小管腔和基底膜側尿酸重吸收、分泌轉運體的數目和活性。有關資料顯示，腎小管對尿酸的重吸收增加是人類高尿酸血症的主要原因，而hURATl作為最重要的尿酸鹽重吸收轉運體，被認為是調節血尿酸水平的關鍵蛋白。hURATl基因屬於有機離子轉運家族SLC22，該基因位於11ql3，含有10個外顯子和9個內含子。hURATl為陰離子交換通道，通過與乳酸等有機陰離子及氯等無機陰離子交換，將腎小管管腔內的尿酸轉運到腎小管上皮細胞內。臨床資料顯示，hURATl基因多態性與原發性高尿酸血症密切相關。GraesslerJ等研究發現，hURATl基因第二外顯子C426T多態性與德國人群腎尿酸排洩減少和高尿酸血症顯著相關，相對於CC基因型，CT和TT基因型個體腎臟尿酸排洩分數(FEUA)明顯降低，血尿酸水平明顯升高；YukioShima等研究發現，日本男性受試者中hURATl第四內含子G/T多態不同基因型者(GGGT和TT)血尿酸水平明顯不同，GG基因型者血尿酸水平最高，GT基因型者次之，TT基因型者最低，提出在日本人群中，該SNP位點可作為獨立的高尿酸血症預測標記。Vdzquez-Mellado等對69名墨西哥原發性痛風患者及其29名一級家屬和120名健康個體的hURATl基因進行序列分析，結果顯示69名痛風患者中16名患者存在hURATl基因突變，佔患者的23%，其中5種突變位於第5外顯子，l種突變位於第4外顯子，16名突變患者中有11名為第5外顯子的C850G錯義突變，提出上述突變可能與原發性痛風有關。單核苷酸多態性是人類遺傳變異的主要來源，眾多研究證明單核苷酸多態性影響多基因遺傳病個體的易感性。高尿酸血症是一種多基因遺傳病，hURATl作為高尿酸血症的候選基因，其單核苷酸多態性在導致高尿酸血症中發揮重要的作用。單核苷酸多態性在不同人群中分布不同，在中國人群中沒有高尿酸血症和hURATl基因單核苷酸多態性的相關性報導。本研究中，我們選擇568名中國北方漢族人群hURATl基因10個外顯子和9個內含子進行測序，以期發現中國北方漢族人群中與高尿酸血症相關的hURATl基因單核苷酸多態性。發明目的選擇原發性高尿酸血症病人227例，對照組341例。取所有研究對象外周抗凝血，提取基因組DNA。設計特異性引物，採用PCR方法分別擴增hURATl基因啟動子、10個外顯子及外顯子和內含子交界處,進行正向和反向測序，應用Genestar軟體尋找SNP及突變位點；應用haploview軟體檢驗研究對象SNPHardy-Weinberg平衡，確認研究對象選取的隨機性及兩兩SNP位點之間的連鎖關係；應用乂2檢驗比較不同組別基因型及等位基因頻率，確定與原發性高尿酸血症相關的SNP及突變位點;應用Phase軟體進行與原發性高尿酸血症相關的SNP位點所組成的單倍型分析，確定原發性高尿酸血症易感單倍型；應用Logistic回歸分析和不同組別間生化指標的比較，確認原發性高尿酸血症的致病位點,從而為高尿酸血症的基因治療以及新藥篩選等提供可能的理論指導和依據。內容與要求-研究對象中高尿酸血症組患者的收入標準普通飲食並排除心、肝、腎以及全身性疾病的基礎上，連續三次測定男性及絕經後女性血清中尿酸含量超過416umol/L,絕經前女性超過357umol/L。正常對照組收入標準血脂、腎功能、肝功能、尿酸值(各項生化指標)均在正常範圍內的無高尿酸血症家族史正常人。利用常規方法提取患者外周血的基因組DNA，結合PCR方法獲得目的片段，純化後測序，與正常人相比較，尋找SNP位點。該基因/蛋白達到的技術指標為1、hURATl基因中我們共發現了13個SNP位點，其中12個與已知報導相符，但我們發現的第3內含子+11G>A位點在國內、國際上均未見有相關報導，因此，該位點是hURATl基因的一個新的SNP位點(測序圖見圖l)。2、13個SNPsHardy-Weinberg平衡檢驗顯示所有實驗樣本均符合隨機性原則(見表l)。3、SNPs等位基因及基因型頻率進行比較結果顯示，高尿酸血症患者中第三內含子+llG〉ASNP,A等位基因頻率為6.28。/。，在正常對照者中僅為1.7%，差異具有極顯著性(A5.94X10—5)。高尿酸血症患者AG+AA突變基因型頻率顯著高於正常對照組(12.11%VS3.40%，/^8.21X10—5)(見表2)。4、單倍型Ht4(包含所有突變型等位基因)在高尿酸血症組中的頻率顯著高於正常對照組，與原發性高尿酸血症發病危險性密切相關(5.73%VS1.74%,屍=5.93X10,。單倍型Ht4是4種單倍型中唯一包含第三內含子+3，11G〉ASNPA突變型等位基因的單倍型，並是唯一與高尿酸血症密切相關的單倍型93X10—5)(見表3)。5、連鎖分析結果顯示，第三內含子+3，11G〉A不位於任何一個周圍高度連鎖的hURATl基因BLOCK中，在基因連鎖圖中呈現斷開現象(見圖2)。6、對發現的13個hURATl基因SNP位點進行Logistic回歸分析結果顯示，如果固定SNP11(+3，11G〉A)，其它任何SNP位點都不能改變它的屍值，相反SNPll(+3，11G〉A)可以改變其它任何一個SNP位點的屍值(見表4)。圖1.hURATl基因第三內含子+3，11G>A三種基因型GG，GA，M圖2.hURATl基因SNP位點連鎖分析結果1-13代表hURATl基因上13個SNP位點l(SNPl):Promotor，-454A/T;2(SNP2):Promotor，-434T/C;3(SNP3):Promotor,—382C/T;4(SNP4):Promotor,-87C/T;5(SNP5):Promotor,+118G/A;6(SNP6):Exon1,C258T;7(SNP7):Exon2，C426T;8(SNP8):Intron2，+271A/G;9(SNP9):Intron2，+277C/T;10(SNP10):Intron2，十278A/G;11(SNP11):Intron3,+11G/A;12(SNP12):Intro8，-103G/A;13(SNP13):Exon8,T1309C.具體實施方式-1、研究對象的分組與收集(1)原發性高尿酸血症組收入標準普通飲食並排除心、肝、腎以及全身性疾病的基礎上，連續三次測定男性及絕經後女性血清中尿酸含量超過416umol/L，絕經前女性超過357umol/L。227例原發性高尿酸血症患者來自青島大學附屬醫院內分泌門診、內分泌病房及健康體檢中心。其中，男性193例，平均年齡49.58±14.33歲；女性34例，平均年齡54.2±12.0歲。(2)正常對照組收入標準血脂、腎功能、肝功能、尿酸值(各項生化指標)均在正常範圍內的無高尿酸血症家族史正常人。共收集750例自青島大學附屬醫院健康體檢中心正常對照者，從中選取341例與原發性高尿酸血症組性別匹配個體收入正常對照組，男性206例，平均年齡48.32土13.39歲；女性135例，平均年齡40.9±13.1歲。(3)採集血樣採集每個研究對象的血樣。每個個體採外周血5ml，加lmlACD抗凝劑，混勻。2、外周血DNA的抽提(1)裂解紅細胞抗凝血6ml(5ml血，lml抗凝劑)加入15ml塑料離心管中，加入9ml預冷的溶血試劑，上下顛倒10次左右，冰浴10分鐘，4。C下4000卬m離心5分鐘，棄上清。重複上述步驟1次。(2)裂解白細胞加入3ml核懸液，輕輕混勻，加入50ul50。C預熱的10%SDS,再加入40ul預冷的蛋白酶K(20mg/ml)，45°C消化過夜，100次/分輕搖。3、抽提DNA:在上述離心管中加入等體積(約3ml)的新鮮配置的苯酚一氯仿一異戊醇(25:24:1)混合液，震蕩10分鐘至乳白色。4。C下4000rpm離心5分鐘，將上清液移入另一15ml離心管中。4、向該上清中加入等體積(約3ml)的氯仿，震蕩10分鐘至乳白色，4'C下4000rpm離心5分鐘，將上清液移入另一15ml離心管中。5、向該上清中加入1/10體積(一般約0.3ml)的3M醋酸鈉溶液(0。C預冷)及一倍體積(一般約3ml)的異丙醇(-20'C預冷)，上下輕輕顛倒至析出絮狀沉澱。6、析出絮狀沉澱後，用tip挑出沉澱，放入事先加入70%乙醇的lmlEp管中，在離心機上13000rpm離心3分鐘，棄乙醇，讓沉澱自然千燥，然後加入200ulTE溶解。7、DNA濃度的測定吸取DNA原液lul，加入雙蒸水稀釋至100ul，以雙蒸水作為0管，用紫外分光光度儀分別檢測260nm和280nm的吸光度，計算OD比值和DNA濃度。〔OD比值二260nmOD值/280nmOD值，DNA濃度(ng/ul)二OD260nm值X稀釋倍數X50)8、稀釋DNA:按已測的DNA濃度，把所有樣本的DNA稀釋成50ng/ul的濃度，-20度保存，以備下一步PCR反應使用。9、聚合酶鏈式反應(PCR):應用引物設計軟體primerexperss2.0，遵循引物設計原則設計10對引物(表1)，擴增hURATl基因5'側翼區、IO個外顯子、外顯子和內含子交界處。(1)PCR反應體系(20ul):ddH2014(卩L)10*buffer2dNTP(10mM)1上遊引物0.5下遊引物0.5DNA(50ng/ul-100ng/ul)1Taq酶(5units/ul)0.5Total+)20u(2)PCR反應條件PCR反應用96孔PCR反應板，在MJPCR熱循環儀上進行:95°C,5min94°C,40s退火溫度見表5，lrain72°C,35sec—72°C，10min30cycles(3)1.5%agarose凝膠電泳。(4)PCR產物純化用ExonucleaseI(ExoI)和蟲下鹼性磷酸酶(ShrimpAlkalinePhosphatase,SAP)純化PCR產物。當PCR擴增完成後，任何存在於PCR產物混合物中未被消耗的dNTPs和引物將影響測序或SNP分析。外切酶I可去除剩餘的單鏈引物和任何在PCR中產生的外來單鏈DNA。SAP去除DNA片段5'端磷酸，增強隨後的標記。反應體系7|li1含SAP(lU/ul)0.5ul，ExoI0.25ul(終濃度為20U/ul)，PCR產物5ul。循環參數37°C60分鐘，80°C15分鐘。純化後取2ul跑1。/。agarose凝膠電泳定量，以備測序。(採用ABB730自動測序儀測序)10、目的片段DNA測序產物純化後應用美國ABIPRISM3730DNA自動測序儀進行測序，以PCR時的引物為測序引物，用BigDyeTerminator測序試劑盒(AppliedBiosystems)進行PCRCycleSequencing反應。11、序列比對分析利用Autoassembler2.0軟體將測序結果與UCSC資料庫下載的基因組序列進行比較、分析，找出突變位點。12、統計處理應用haploview軟體檢驗研究對象SNPHardy-Weinberg平衡，確認研究對象選取的隨機性及兩兩SNP位點之間的連鎖關係；應用X2檢驗比較不同組別基因型及等位基因頻率，確定與原發性高尿酸血症相關的SNP及突變位點；應用Phase軟體進行與原發性高尿酸血症相關的SNP位點所組成的單倍型分析，確定原發性高尿酸血症易感單倍型；應用Logistic回歸分析和不同組別間生化指標的比較，確認原發性高尿酸血症的致病位點。表l中國漢族人群中hURATl基因SNP位點NucleotideSNPMAF0bsHETPredHET冊PdescriptionPromotorrsll602903-454A〉T0.2560.390.380.7806rs524023-434T〉C0.2540.3870.3790.8388rs97334313-382C〉T0.2560.390.380.7806rs559946-87C〉T0.2530.3920.3780.6539rs3825018+118G〉A0.2530.3920.3780.6539Exon1rs3825016C258T0.2370.3960.3620.1204Exon2rsll231825C426T0.2410.3730.3660.8471Intron2,rs576076+271A〉G0.4940.,430.50.0154rsl0792441+277C〉T0.2570.,390.3820.8395rs537246+278A〉G0.2570..390.3820.8395Intron3+11G〉A0.0160.0330.0321Intron8rs7929627-103G〉A0.4250.5240.4890.2368Exon8rs7932775T1309C0.4250.5240.4890.2368MAF:最小等位基因頻率；0bsHET:觀測雜合度；PredHET:預測雜合度;HWpvalue:Hardy-Weinberg平衡檢驗屍值表2hURATl基因等位基因頻率、基因型頻率比較SNP等位基因等位基因頻率P-valueOR基因型基因型頻率P-valueOR對照組病人組controlcase-454A>T74.17%80.56%1,63X1021.44AA+AT94.95.83%0.361.47-434T〉C74.17%&0.56%1.63X10'1.44TT+CT94.00%95.83%0.361.47-382C>T74,17%SO.56%1.63X10—2L44CC十CT94.00%95.83%0.361.47—87C〉T74.17%80.32%2.09XL(T1.42CC+CT94.00%96.30%C.241.66-118G>A74.17%SO.32%2.09X10—21.42GG+GA94.00%96.30%0.241.66C258TC426T+2，271A/G+2，277C/T+2，278A/G+3，11G〉A-8，103G/ATl，C76.57%79,0276.87%80.45%50.00%54.52%7153%79.09%74.53%79.09%0.680.87CCiCT95.60%93.75%(!5S1.70%0.181.24TT+TC94.78%95,00%0.910.190.83GG-GA71.16%75.11%0.330.090.77CC+CT93.26%93.64%0.870.090.77AA+AG93.26%93.64%0.871,45.040,820.940.946,28%5.94X1053.88AA+GA3.40%12.11%8.21X10—。3.9242.49%51.34%4.13X10—11.43GG+GA68.37%79.02%6.25X10—31.7442.49%51.34%4.13X10-31.43CC+CT6S.37%79.02%6.25X10-31.74表3hURATl基因SNP位點單倍型分析tableseeoriginaldocumentpage10注0:野生型等位基因；1:突變型等位基因.S1:Promotor,-454A/T;S2:P謂otor，-434T/CS3:Promoter,-382C/T;S4:Promotor，-87C/T;S5:Promoter,+118G/A;S6:Intron3,+11G/A;S7:Intro8，-103G/A;S8:Exon8，T1309C.表4hURATl基因SNP位點Logistic回歸分析TOSNP1TOSNP2TOSNP3P-valueP-v3lueP—valueP-valueP-valueP-valueSNP1TOSNP2TOSNP3TOSNP60.0269SNP70.0411SNP60.0269SNP7O.(MllSNP60.0269SNP70.0411SNP80.0443S，80.0141SNP80.0443S鄉0.0141SNP80.0443SNP80.0141SNP110.0024SNP110.0024SNP110.0024TOSNP4TOSNP5TOSNP6P-valueP—valueP-valueP-velueP-valueP-valueSNP4TOSNP5TOSNP6TOSNP60.0473SNP80.0183SNP60.0473SNP80.0183SNP110搬9SNP110.0020SNP110.0020TOSNP7TOSNP8TOSNP9P-valueP—vaiusP-valueP-valueP-valueP-valueSNP7TOSNP8TOSNP9TOSNP10.0411SNP10.0141SNP10.0443SNP110細2SNP80.0474SNP20.04USNP20.0141SNP30.0411SNP300141SNP110.0108SNP40扁3SNP50扁3SNP90.0474SNP100.0474SNP110.0117TOSNP10TOSNP11TOSNP12P-valueP-valueP-valueP-valueP-vslueP-valueSNP10TOSNP11TOSNP12TOSNPil0細2SNP80.0474SNP10.0024SNP110.0097SNP20.0024SNP30-0024SNP40.0020SNP50.0020SNP60.0029SNP70.0簡SNP80.0117SNP90,0082SNP100.0082SNP120.0097SNP130.0097TOSNP13P-valueSNP13TOP—valueSNP110,0097^主SNP1:Promotor,-454A/T;SNP2:Promotor,-434T/C;SNP3:Promotor,-382C/T;SNP4:Promotor,-87C/T;SNP5:Promotor,+118G/A;SNP6:Exon1,C258T;SNP7:Exon2,C426T;SNP8:Intron2,+271A/G;SNP9:Intron2，+277C/T;SNP10:Intron2,+278A/G;SNP11:Intron3，+11G/A;SNP12:Intro8，-103G/A;SNP13:Exon8,T1309C.表5用於擴増hURATl基因外顯於的PCR引物及退火溫度tableseeoriginaldocumentpage13其中啟動子分為三段進行擴增，引物分別為Promoter-1、Promoter-2、Promoter-3。引物1:擴增外顯子12:擴增外顯子23+4:擴增外顯子3，內含子3及外顯子45+6:擴增外顯子5，內含子5及外顯子67:擴增外顯子78+9:擴增外顯子8，內含子8及外顯子910:擴增外顯子10權利要求1.本發明涉及維持血尿酸水平的關鍵基因——hURAT1，發現該基因第三內含子的SNP位點+11G>A，其特徵在於首次在中國漢族人群中發現。2.根據權利要求1所述之hURATl第三內含子多態性，其特徵在於SNPS等位基因及基因型頻率進行比較結果顯示，高尿酸血症患者中第三內含子+llG〉ASNP，A等位基因頻率為6.28%,在正常對照者中僅為1.7%,差異具有極顯著性(P二5.94X10-5)。高尿酸血症患者AG+AA突變基因型頻率顯著高於正常對照組(12.11%VS3.40%,P=8.21X10-5)3.根據權利要求1、2所述之hURATl第三內含子多態性，其特徵在於單倍型Ht4(包含所有突變型等位基因)在高尿酸血症組中的頻率顯著高於正常對照組，與原發性高尿酸血症發病危險性密切相關(5.73%VS1.74%，P-5.93X10-5)。單倍型Ht4是4種單倍型中唯一包含第三內含子+3，11G>ASNPA突變型等位基因的單倍型，並是唯一與高尿酸血症密切相關的單倍型(P=5.93X10-5)4.根據權利要求l、2、3所述之hURATl第三內含子多態性，其特徵在於連鎖分析結果顯示，第三內含子+3，11G>A不位於任何一個周圍高度連鎖的hURATl基因BLOCK中，在基因連鎖圖中呈現斷開現象5.根據權利要求l、2、3、4所述之hURATl第三內含子多態性，其特徵在於hURATl第三內含子的SNP位點+11G〉A與高尿酸血症易感性的提高顯著相關全文摘要本發明涉及維持血尿酸水平的關鍵基因-hURAT1第三內含子SNP位點+11G＞A的發現。內容包括原發性高尿酸血症患者以及正常人群的收集；常規方法提取外周血；根據目的基因設計特異性的引物，PCR擴增獲得目的基因；將PCR產物純化後測序；應用haploview軟體檢驗研究對象SNPHardy-Weinberg平衡，確認研究對象選取的隨機性及兩兩SNP位點之間的連鎖關係；應用X2檢驗比較不同組別基因型及等位基因頻率，確定與原發性高尿酸血症相關的SNP及突變位點；應用Phase軟體進行與原發性高尿酸血症相關的SNP位點所組成的單倍型分析，確定原發性高尿酸血症易感單倍型；應用Logistic回歸分析和不同組別間生化指標的比較，確認原發性高尿酸血症的致病位點。結果顯示我們在漢族人群中新發現的hURAT1第三內含子的SNP位點+11G＞A與高尿酸血症易感性的提高顯著相關。文檔編號C12N15/12GK101418296SQ200810170488公開日2009年4月29日申請日期2008年11月5日優先權日2008年11月5日發明者孟冬梅,李長貴,王雲龍,苗志敏,閆勝利,琳韓申請人:李長貴;苗志敏;閆勝利