一種融合蛋白及其用於檢測莢膜組織胞漿菌的用途的製作方法

2023-09-20 06:25:55 1

專利名稱：一種融合蛋白及其用於檢測莢膜組織胞漿菌的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及融合蛋白及莢膜組織胞漿菌的檢測，特別涉及用酶聯免疫吸附 試驗檢測莢膜組織胞漿菌的方法。
背景技術：
莢膜組織胞漿菌病(Histoplasmosis, HP)由雙相型真菌莢膜組織胞漿菌 (Histoplasma capsulatum, HC)引起。我國自1958年報導首例HP以來，陸續有 該病的臨床報導。但由於莢膜組織胞漿菌病的臨床症狀與肺結核、黑熱病相似； 病理形態又極易與馬爾尼菲青酶菌、杜氏利什曼原蟲、弓形蟲、新型隱球菌等 相混淆，而國內臨床醫務工作者又對該病的認識普遍不足，故存在高漏診率和 高誤診率現象，播散型HP常因未得到及時正確的治療而死亡。因此加強對HP
快速診斷的研究成為必要，以期能儘量減少國內較高的漏診誤診現狀，降低該 病的病死率。
目前，國內外對於HP的診斷有如下幾種方法
1. 真菌培養取臨床標本接種固體或液體培養基，觀察菌落特徵與鏡下形 態、黴菌相與酵母相的轉化；尿素酶反應等。該方法特異性好，為判斷HP的金 標準，但耗時長，操作繁瑣，不便於早期快速篩査。
2. 病理學檢査取病變組織塗片、固定、染色，鏡下觀察莢膜組織胞漿菌 形態特徵。但由於組織胞漿菌病理形態與杜氏利什曼原蟲等相似，故該方法難 以大規模推廣。
3. 變態反應接種莢膜組織胞漿菌於葡萄糖瓊脂斜面培養基，培養一段時 間後，轉接至液體培養基繼續培養，收集培養上清，經純化處理後，製得莢膜 組織胞漿菌素。使用時，疑似患者前臂屈肌表麵皮內注射該莢膜組織胞漿菌素， 注射後48小時觀察紅腫及結塊大小，以5毫米作為陽性片段標準。皮試陽性揭示 曾受過或正在受莢膜組織胞漿菌感染，有一定的診斷價值。但由於莢膜組織胞 漿菌素組成成份複雜，與其它病菌的組成成份相互交叉，所以可能存在一定程 度上的假陽性。
4. 血清學診斷以往莢膜組織胞漿菌血清學檢査常用到的方法有免疫雙擴
法、補體結合實驗等。近年來血清學診斷有所發展，通過檢測血液、腦脊液和 尿液中的莢膜組織胞漿菌抗原成份以判斷感染莢膜組織胞漿菌與否。此方法靈 敏度高、操作簡便，可提供早期診斷依據。必須指出的是，血清學診斷的敏感 性和特異性與用於檢測的抗原/抗體的活性及其特異性密切相關。目前用於檢測莢膜組織胞漿菌抗體的抗原來源於莢膜組織胞漿菌蛋白提取物，其製備工藝復 雜，並且耗時、耗力，更為嚴重的是其成份複雜，導致檢測結果靈敏度高但特 異性差。
5.基因診斷:通過PCR方法擴增莢膜組織胞漿菌的特異性基因片段以用於該 菌的鑑定、分型及流行病學調查。該方法敏感性好、特異性高，但由於儀器的 限制，該方法無法在基層醫療機構大規模推廣。
因此，建立一種快速、簡單，特異性好的莢膜組織胞漿菌的檢測方法，將 對莢膜組織胞漿菌病的大規模臨床鑑別診斷及快速診斷具有重要意義。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一種莢膜組織胞槳菌融合蛋白M-GH17及編碼 該融合蛋白的DNA，以及該融合蛋白在檢測莢膜組織胞漿菌中的應用。
本發明的另一目的在於提供一種將莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17基因 轉化宿主細胞並通過載體特異性表達莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17的方法。
本發明的又一目的在於提供一種包含莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17的 ELISA試劑盒及其用於檢測莢膜組織胞漿菌的用途。
為實現上述發明目的，發明人以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板， 通過PCR方法擴增得到M基因(GenBank登錄號為AF026268)的特異性片段 和GH17基因(GenBank登錄號為ACU27588)的特異性片段；所說的M基因 片段和GH17基因片段的核苷酸序列分別如序列表SEQIDNo: 1和SEQIDNo: 2所示。在原核表達載體中定向插入莢膜組織胞漿菌M基因片段，構建得到M 基因片段的重組原核表達載體；在該重組原核表達載體中再定向插入莢膜組織 胞漿菌GH17基因片段，構建得到M-GH17基因片段重組原核表達載體；將 M-GH17重組原核表達載體轉化宿主細胞，篩選重組單克隆，誘導後特異性表達， 得到融合蛋白M-GH17。
本發明中，原核表達載體最好選用PET-28a(+)。 M-GH17重組原核表達載體 轉化宿主細胞時，宿主細胞選用大腸桿菌。採用卡那青黴素抗性篩選重組菌單 克隆，以丙基硫代-P-D-半乳糖苷誘導後特異性表達，分離純化後得到。
本發明製備融合蛋白M-GH17的更進一步的詳細步驟為
1) 以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過PCR方法擴增得到 莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段。
2) 在原核表達載體PET-28a(+)的多克隆位點Ndel和BamHI之間定向插 入莢膜組織胞漿菌M基因片段，構建得到重組原核表達載體PET-28a(+)-M。
3) 在重組原核表達載體PET-28a(+)-M的多克隆位點EcoRI和Xhol之間
4定向插入莢膜組織胞漿菌GH17基因片段，構建得到重組原核表達載體 PET-28a(+)-M-GH17。
4)重組原核表達載體PET-28a(+)-M-GH17轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態 細胞，用卡那青黴素抗性篩選重組菌單克隆，重組表達菌株接種LB液體培養基 培養，異丙基硫代-P-D-半乳糖苷誘導，Western-blot實驗證實該重組表達菌株能 夠特異性表達莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17，以包涵體形式存在，分離純化 得到融合蛋白M-GH17。
利用上述製得的融合蛋白M-GH17，發明人還製備出用於莢膜組織胞漿菌鑑 別診斷的酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒將純化得到的M-GH17融合蛋白、 莢膜組織胞漿菌感染標準陽性血清、標準陰性血清、包被液、封閉液、洗滌液、 顯色液A、顯色液B、終止液組裝成莢膜組織胞漿菌鑑別診斷試劑盒。具體溶液 配方如下
包被液Na2C031.5g， NaHC032.9g,加雙蒸水定容至1000mL(pH9.6)。 封閉液Na2HP04.12H20 2.68g， NaH2P04.2H20 0.39g, NaCl 8.5g， 20g牛血
清白蛋白，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。 洗滌液Na2HPO4.12H2O2.68g，NaH2PO4.2H2O0.39g,NaCl 8.5g， Tween-20
0.5mL，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。 顯色液A: 200mgTMB溶於100mL無水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。 顯色液B:檸檬酸2.1g，Na2HP04.12H20 71g，加雙蒸水定容至1000mL。使用
時lmL顯色液A+ lmL顯色液B+0.4pL 30%H2O2 終止液2M H2S04， 21.7mL濃H2S04加雙蒸水定容至lOOOmL。 用本發明的包含融合蛋白M-GH17的ELISA試劑盒，按照普通ELISA方法檢 測待測血清，根據終止後的吸光值確定陽性、陰性、可疑的判斷臨界值，即可 對待測血清樣本進行莢膜組織胞漿菌檢測。
相對於現有的莢膜組織胞漿菌檢測方法，本發明具有以下的優點和有益效 果本發明通過查找目前已知的莢膜組織胞漿菌基因序列，比對其它病原微生 物相關序列，計算機模擬該抗原優勢表位，兼顧敏感性和特異性，最終確定選 取莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段作為目的序列，並採用分子生物 學技術創造性的將此兩個基因片段融合表達，得到莢膜組織胞漿菌融合蛋白 M-GH17，並利用此融合蛋白建立酶聯免疫吸附實驗(ELISA)方法，用於莢膜組 織胞漿菌的血清學診斷。本發明與現有血清學方法檢測莢膜組織胞槳菌相比， 由於抗原特異性得到了極大提高，所以檢測結果更加準確，極大程度得降低了 誤診率；同時由於抗原是由莢膜組織胞漿菌優勢抗原表位融合表達製得，所以其檢測敏感性並沒有降低。此外，該融合抗原製備方法簡單易行，純化工藝成
熟，適合工業化大量生產。利用該融合蛋白作為包被抗原組裝成ELISA試劑盒， 操作簡單易行，使用準確、快速，相對於目前培養增殖莢膜組織胞漿菌，以莢 膜組織胞漿菌素為檢測試劑的檢測方法，本檢測方法生產工藝簡單實用、生產 成本低，適合大規模生產和大規模臨床診斷所需，本發明的ELISA試劑盒將為莢 膜組織胞漿菌的防治提供強有力的工具。
本發明所涉及到的原核表達載體PET-28a(+)是基因工程領域最常用的原核 表達載體之一，沒有生物危險性。在此基礎上構建得到的重組原核表達載體 PET-28a(+)-M-GH17也不具有任何生物危險性。構建融合蛋白M-GH17所用的大 腸桿菌菌株為BL21(DE3)，該菌株為分子生物學領域最常用的表達菌株之一，也 不具有生物危險性。整個製備過程安全性高，不存在莢膜組織胞槳菌汙染、擴 散的潛在風險。


圖1顯示的是原核表達載體PET-28a(+)-M-GH17構建流程圖； 圖2顯示的是誘導表達並純化後的融合蛋白M-GH17的SDS-PAGE電泳圖； 圖3顯示的是融合蛋白M-GH17的Western-blot檢測結果。
具體實施例方式
以下用具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
一、 莢膜組織胞漿菌M基因片段的克隆
如附圖1所示，將莢膜組織胞漿菌接種於葡萄糖瓊脂斜面培養基上，25。C培 養3周後收集並提取其基因組DNA。以所提取的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模 板，通過PCR方法得到莢膜組織胞漿菌M基因片段，引物序列如下 Fl: 5' GCCATATGCCTCTAAACACGGCCGC 3'(上遊引物) Rl: 5'GCGGATCCTTTGTTGTTGGCGCTGTTAA 3'(下遊引物) PCR反應條件為9《C變性1分鐘，55。C退火15秒，72"C延伸40秒，總共30個 循環，最後再72'C延伸5分鐘。PCR產物行1X瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收並連接 pMD19-T載體(命名為T-M)，轉化DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，提取質粒， 經酶切及測序得到M基因片段的序列(如序列表SEQIDNo: l所示)。
二、 莢膜組織胞漿菌GH17基因片段的克隆
將莢膜組織胞漿菌接種於葡萄糖瓊脂斜面培養基上，25。C培養3周後收集並 提取其基因組DNA。以所提取的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過PCR 方法得到莢膜組織胞漿菌GH17基因片段，引物序列如下
Fl:5' GCGAATTCGGCCAGGTTTGGGCG 3'(上遊引物)formula see original document page 7
PCR反應條件為94'C變性1分鐘，55'C退火15秒，72。C延伸30秒，總共30個 循環，最後再72'C延伸5分鐘。PCR產物行1X瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收並連接 pMD19-T載體(命名為T-GH17)，轉化DH5a感受態細胞，篩選陽性克隆，提取質 粒，經酶切及測序得到GH17基因片段的序列(如序列表SEQIDNo:2所示)。
三、 重組原核表達載體PET-28a(+)-M的構建
用限制性內切酶Ndel和BamHI於37'C分別雙酶切T-M載體和PET-28a(+) 載體12小時，酶切產物分別行1%瓊脂糖凝膠電泳，並切膠回收M基因片段和 PET-28a(+)載體。使用T4連接酶將回收的M基因片段和PET-28a(+)載體於4°C 過夜連接後，連接產物轉化DH5a感受態細胞，並塗布於含卡那青黴素抗性(50 ug/mL)的LB平板，於37。C過夜培養。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡 那青黴素抗性(50ug/mL)的LB液體培養基，37"C恆溫搖床培養12小時後，鹼 裂解糹去提取質粒，經Ndel和BamHI雙酶切鑑定後得到陽性重組質粒，命名為 PET-28a(+)-M。
四、 重組原核表達載體PET-28a(+)-M-GH17的構建
用限制性內切酶EcoRI和Xhol於37t:分別雙分別酶切T-GH17載體和 PET-28a(+)-M載體12小時，酶切產物分別行1%瓊脂糖凝膠電泳，並切膠回收 GH17基因片段和PET-28a(+)-M載體。使用T4連接酶將回收的GH17基因片段 和PET-28a(+)-M載體於4'C過夜連接後，連接產物轉化DH5 a感受態細胞，並 塗布於含卡那青黴素抗性(50ug/mL)的LB平板，於37"C過夜培養。第二日，挑 取平板上單克隆菌株至含卡那青黴素抗性(50 u g/mL)的LB液體培養基，37'C恆 溫搖床培養12小時後，鹼裂解法提取質粒，經EcoRI和Xhol雙酶切鑑定後得 到陽'性重組質粒，命名為PET-28a(+)-M-GH17。
五、 融合蛋白M-GH17表達菌株的構建
將構建好的重組表達載體PET-28a(+)-M-GH17轉化BL21(DE3)感受態細胞， 並塗布於含卡那青黴素抗性(50yg/mL)的LB平板，於37。C過夜培養。第二曰， 挑取數個平板上單克隆菌株至含卡那青黴素抗性(50 u g/mL)的LB液體培養基， 37'Ct亙 顯搖床培養12小時後，分別取部分菌液保存並製備蛋白電泳樣品，剩餘 菌液i勾加誘導劑異丙基硫代-e-D-半乳糖苷誘導表達4個小時後製備蛋白電泳 樣品。糹各誘導前和誘導後的蛋白電泳樣品於12%聚丙烯醯胺凝膠電泳，並使用 考馬斯亮藍溶液染色。染色結果發現，誘導前樣品無融合蛋白M-GH17表達， 而誘導後樣品明顯表達融合蛋白M-GH17。以上結果說明製備得到融合蛋白
7M-GH17表達菌株。
六、 最佳誘導物濃度的確定
將融合蛋白M-GH17表達菌株在LB平板上劃線，37'C過夜培養後挑取挑取 單個菌落接種於5mL LB液體培養基，加卡那青黴素至終濃度為50pg/mL， 37°C 搖床培養12小時後，用卡那青黴素濃度為50pg/mL的LB液體培養基將該菌液 按l:100稀釋，分裝至5支試管(每管5mL),置37°。直溫搖床培養至00600=0.7， 分別加入誘導劑異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0丄Ommol/L、 0.2mmol/L、 0.5mmol/L、 0.8mmol/L、 1.0mmol/L、 1.5mmol/L,繼續培養3小時 後取等量菌液進行聚丙稀醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據融合蛋白M-GH17 表達量確定最佳異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)誘導濃度為1.0mmol/L。
七、 最佳誘導時間的確定
將融合蛋白M-GH17表達菌株在LB平板上劃線，37。C過夜培養後挑取挑取 單個菌落接種於5mL LB液體培養基，加卡那青黴素至終濃度為50|ig/mL, 37°C 搖床培養12小時後，用卡那青黴素濃度為50pg/mL的LB液體培養基將該菌液 按1:100稀釋，分裝至5支試管(每管5mL)，置37"C恆溫搖床培養至OD600=0.7， 加入誘導劑異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為最佳誘導濃度 1.0mmol/L，分別誘導培養3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時後取等 量菌液進行聚丙稀醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)， SDS-PAGE電泳圖參見附圖2， 圖中1、 2為純化M-GH17融合蛋白，3為蛋白Marker。根據融合蛋白M-GH17 表達量確定最佳異丙基硫代-卩-D-半乳糖苷(IPTG)誘導時間為4小時。
八、 莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17的大量表達及純化 從含卡那青黴素抗性的LB平板上挑取PET-28a(+)-M-GH17重組菌單克隆至
LB液體培養基，加卡那青黴素至終濃度為50ug/mL， 37。C恆溫搖床培養12小 時後，用含50ug/mL卡那青黴素的LB液體培養基將該菌按1: 100比例稀釋 後，分裝至細菌培養瓶中，置37。C恆溫搖床培養至OD600=0.7，加誘導劑異丙 基硫代-P-D-半乳糖苷至終濃度為1.0mmol/L，繼續培養誘導4小時。離心收集 菌體後，用細菌裂解液重懸，-7(TC冷凍30分鐘，超聲破碎3分鐘，4'C離心取 沉澱，棄上清。取10mL包涵體變性溶液攪拌溶解沉澱，4'C離心後，取上清加 PEG4000至0.2%(W/V)、氧化型穀胱苷肽至lmmol/L、還原型穀胱苷肽至 2mmol/L， 4。C靜置30分鐘後轉至截留分子量為10kD-12kD的透析袋中，於PBS (10mmol/L，pH7.4)中過夜透析。透析後立即取出並分裝，於-7(TC保存備用。 細菌裂解液配方Tris-Cl 50mmol/L， pH8.0 EDTA lmmol/L
8NaCl 100mmol/L 包涵體變性溶液細菌裂解液+SKL0.3。/。(W/V) 九、Western Blot檢測
純化後的融合蛋白M-GH17行12%聚丙烯醯胺凝膠電泳，電轉移到PVDF 膜， 一抗分別為人莢膜組織胞漿菌陰性血清和人莢膜組織胞漿菌陽性性血清， 二抗為HRP標記的羊抗人IgG抗體，底物為Western Blot常用的魯咪諾螢光底 物。X光底片曝光、顯影、定影。免疫印跡檢測的結果參見附圖3，圖中l為莢 膜組織胞漿菌陰性血清，2、 3是莢膜組織胞漿菌陽性血清。
相關溶液配方
1. 電泳緩衝液
Glyl 8.8g,Tris3.03g，SDS lg，加雙蒸水定容至lOOOml。
2. 轉膜緩衝液
Gly2,9g， Tris5.8g， SDS 0.37g，甲醇200ml，加雙蒸水定容至 1000ml。
3. 洗滌液
Tris 3g， NaCl 8g， KC1 0.2g， Tween-20 lml，定容至1000ml (pH7.8)。
4. 螢光底物
Pierce公司產品(貨號Prod#34075)。
十、莢膜組織胞漿菌診斷試劑盒的製備
1. 試劑盒組成抗原包被酶標板1塊、洗滌液50mL、陰性對照樣品 500|iL、陽性對照樣品50(VL、顯色液A、 B各50mL、終止液25mL、 二抗工作 液50mL。
2. 相關溶液配方
包被液Na2C031.5g， NaHC032.9g，加雙蒸水定容至1000mL(pH9.6)。 封閉液Na2HP04.12H20 2.68g, NaH2P04.2H20 0.39g, NaCl 8.5g， 20g
牛血清白蛋白，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗滌液Na2HP04.12H20 2.68g, NaH2P04.2H20 0.39g， NaCl 8.5g，
Tween-20 0.5mL，加雙蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
顯色液A:200mgTMB溶於lOOmL無水乙醇，加雙蒸水定容至1000mL。 顯色液B:檸檬酸2.1g,Na2HP04.12H20 71g,加雙蒸水定容至1000mL。使
用時lmL顯色液A+ lmL顯色液B+0.4|iL 30%H2O2
終止液2M H2S04， 21.7mL濃&804加雙蒸水定容至1000mL。
3. 抗原包被酶標板的製備將上述實施例8中製備得到的莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17用包被液 稀釋至終濃度l|ig/mL，按100(iL/孔加入到酶標板中，37。C靜置2小時後於4。C 過夜。棄包被液，加封閉液200nL/孔，37°C1小時後棄封閉液，於37"烘乾。 將酶標板放入專用錫箔袋，加一小袋乾燥劑，抽真空，封口。
十一、莢膜組織胞漿菌診斷試劑盒操作步驟及片段標準
莢膜組織胞漿菌診斷試劑盒中的各個組成成份平衡至室溫後，將待測血清、 陰性對照血清和陽性對照血清加入到酶標板中(100mL/孔)，37'c溫育1小時， 甩幹，洗滌液洗滌5次，拍幹。每孔加酶標二抗(羊抗人IgG)100[iL， 37'C溫育 30分鐘，甩幹，洗滌液洗滌5次，拍幹。每孔加入已混好的顯色液100pL， 37°C 溫育IO分鐘。沒孔加入終止液50pL，輕輕振蕩後置於酶標儀，OD450測吸光 值。判斷標準OD45020.2為陽性，疑為莢膜組織胞漿菌感染；0D450O.2為 陰性，未感染莢膜組織胞漿菌。
實驗結果顯示，本發明利用莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段 所製備得到的融合蛋白M-GH17，並用其所建立的ELISA方法可快速有效鑑別 診斷莢膜組織胞漿菌感染。
10SEQIDNOl:莢膜組織胞漿菌M基因片段的核苷酸序列；
SEQ ID N02:莢膜組織胞漿菌H17基因片段的核苷酸序列; SEQIDN03:莢膜組織胞漿菌M蛋白的胺基酸序列； SEQIDN04:莢膜組織胞漿菌H17蛋白的胺基酸序列。
SEQUENCE LISTING
中南大學
—種融合蛋白及其用於檢測莢膜組織胞漿菌的用途
0
2
Patentln version 3.3
1
510
DNA
<213〉 Histoplasma capsulatum
1
cctctaaacacggccgcatata^C2LCCC犯Ctcaatgagcaacggattccc3ceLac3agcc60
aaccggacccattcttcaccgcacctgggcgta/tggta犯tggaccacta120
gtgcgcgagctcagcccgagcttcaacgacgtctggtcccaaccgcgtctcttctacaac180
tcactcacggtcttcgagaagcaattcctcgtcaacgccatgcgcttcga240
gtgcgg3gtg犯accgtgcgtaagaacgtcatcatccagctgaaccgcgtcgac犯cgeic300
ctcgcccgccgcgtcgcgctagctatcggcgtcgaacccccatccccggacccaaccttc360
taccacaacaaggcaaccgtccccatcggcaccttcggcacgaatctcctgcggctcgac420
gggctg犯aatcgccctcctgac^ga^cgacggtagcttcacgatcgc卿gcagctc480
cgggccgcgtttaacagcgccaacaacaaa510
2 300 DNA
Histoplasma capsulatum 2ggccaggttt gggcgcaaat agaggagatt gatcctgaaccatattatgtt,tgggtc60cctgatccaa cgtttgccac gcctgttgta ctgcacaataacacagatcttgtcttcatg120gatggaagca aatcttttta tctcaacttc gataacagcacctctgacacgggtatttat180tttgtgaacc ttaactccaa cgctggtatt agtcaactctataaggatagtgacascaag240ttgctctggg gtggagctca acaagagcgg gatggctggatgtggtgcttcatggtcgat300 3 170 PRT<213〉 Histoplasma capsulatum 3Pro Leu Asn Thr Ala Ala Tyr Thr Pro Asn SerMet Ser AsnGly Phe1 5 1015Pro Gin Gin Ala Asn Arg Thr His Asn Arg GlyPhe Phe ThrAla Pro20 2530Gly Arg Met Val Asn Gly Pro Leu Val Arg GluLeu Ser ProSer Phe35 4045Asn Asp Val Trp Ser Gin Pro Arg Leu Phe TyrAsn Ser LeuThr Val50 5560Phe Glu Lys Gin Phe Leu Val Asn Ala Met ArgPhe Glu AsnSer His65 70 7580Val Arg Ser Glu Thr Val Arg Lys Asn Val lielie Gin LeuAsn Arg85 9095Val Asp Asn Asp Leu Ala Arg Arg Val Ala LeuAla lie GlyVal Glu100 105110Pro Pro Ser Pro Asp Pro Thr Phe Tyr His AsnLys Ala ThrVal Pro115 120125lie Gly Thr Phe Gly Thr Asn Leu Leu Arg LeuAsp Gly LeuLys lie130 135140Ala Leu Leu Thr Arg Asp Asp Gly Ser Phe Thr.lie Ala GluGin Leu一145 150 15516012Arg Ala Ala Phe Asn Ser Ala Asn Asn Lys 165 170 4 100 PRT Histoplasma capsulatum 4Gly Gin Val Trp Ala Gin lie Glu Glu lie Asp Pro Glu Pro Tyr Tyr15 10 15Val Arg Trp Val Pro Asp Pro Thr Phe Ala Thr Pro Val Val Leu His20 25 30Asn Asn Thr Asp Leu Val Phe Met Asp Gly Ser Lys Ser Phe Tyr Leu35 40 45Asn Phe Asp Asn Ser Thr Ser Asp Thr Gly lie Tyr Phe Val Asn Leu50 55 60Asn Ser Asn Ala Gly lie Ser Gin Leu Tyr Lys Asp Ser Asp Asn Lys 65 70 75 80Leu Leu Trp Gly Gly Ala Gin Gin Glu Arg Asp Gly Trp Met Trp Cys 85 90 95Phe Met Val Asp 100
權利要求
1. 一種莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17，其特徵在於該融合蛋白是由如序列表SEQ ID No3的胺基酸序列和SEQ ID No4的胺基酸序列連接形成的多肽。
2. —種編碼如權利要求1所述的融合蛋白M-GH17的DNA，其特徵在於該DNA 包含莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段，所述莢膜組織胞漿菌M 基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo: 1所示，所述GH17基因片段如SEQ ID No: 2所示。
3. —種包含莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段並能融合表達如權利 要求1所述蛋白M-GH17的重組大腸桿菌菌株。
4. 如權利要求1所述的融合蛋白M-GH17的製備方法，其特徵在於包含以下步 驟以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過PCR方法擴增得到 M基因的特異性片段和GH17基因的特異性片段；在原核表達載體中定向插 入莢膜組織胞漿菌M基因片段，構建得到M基因片段的重組原核表達載體； 在該重組原核表達載體中再定向插入莢膜組織胞漿菌GH17基因片段，構建 得到M-GH17基因片段重組原核表達載體；將M-GH17重組原核表達載體轉 化宿主細胞，篩選重組單克隆，誘導後特異性表達，得到融合蛋白M-GH17。
5. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述原核表達載體為PET-28a(+); M-GH17重組原核表達載體轉化宿主細胞時，所述宿主細胞為大腸桿菌 BL21(DE3)感受態細胞。
6. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於從所述莢膜組織胞漿菌PCR擴增M 基因片段所用的上遊引物為5'GCCATATGCCTCTAAACACGGCCGC 3'; 下遊引物為5' GCGGATCCTTTGTTGTTGGCGCTGTTAA3'。
7. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於從所述莢膜組織胞漿菌PCR擴增 GH17基因片段所用上遊引物為5' GCGAATTCGGCCAGGTTTGGGCG 3'; 下遊引物為5' GCCTCGAGTTAATCGACCATGAAGCACCAC 3'。
8. —種用於莢膜組織胞漿菌鑑別診斷的ELISA試劑盒，包含常規ELISA試劑 盒所用的包被液、封閉液、洗滌液、，顯色液A、顯色液B、終止液，其特徵 在於還包含如權利要求1所述的莢膜組織胞漿菌融合蛋白M-GH17，以及 莢膜組織胞漿菌感染標準陽性血清和標準陰性血清。
9. 如權利要求1所述的融合蛋白M-GH17在檢測莢膜組織胞漿菌中的應用。
10. 如權利要求3所述的重組大腸桿菌菌株在檢測莢膜組織胞漿菌中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種融合蛋白、包含該蛋白的ELISA試劑盒及其用於檢測莢膜組織胞漿菌的用途，以分離的莢膜組織胞漿菌基因組DNA為模板，通過PCR方法擴增得到M基因片段和GH17基因片段；在原核表達載體中定向插入莢膜組織胞漿菌M基因片段和GH17基因片段，構建得到M-GH17基因片段重組原核表達載體；將M-GH17重組原核表達載體轉化宿主細胞，篩選重組單克隆，誘導後特異性表達，得到融合蛋白M-GH17；用該融合蛋白再進一步製備用於的檢測莢膜組織胞漿菌的ELISA試劑盒。用本發明的包含融合蛋白M-GH17的ELISA試劑盒，按照普通ELISA方法檢測待測血清，根據終止後的吸光值確定陽性、陰性、可疑的判斷臨界值，即可對待測血清樣本進行莢膜組織胞漿菌檢測。
文檔編號C12R1/19GK101519450SQ20091004286
公開日2009年9月2日 申請日期2009年3月13日 優先權日2009年3月13日
發明者餘銘恩, 馮俊濤, 李曉照, 胡成平, 顧其華 申請人:中南大學