二氧化碳診斷/測定試劑盒及二氧化碳濃度測定方法
2023-09-20 17:40:25
專利名稱：二氧化碳診斷/測定試劑盒及二氧化碳濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定二氧化 碳濃度的方法，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
血液內二氧化碳的含量對人體內酸鹼平衡的調節起著重要的作用。血液pH 的恆定是維持生命活動必不可少的條件，血漿中的多種緩衝系統中以碳酸氫鹽 緩衝系統最為重要，直接影響血液的pH。
血液內二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸鹼平衡紊亂。單純代謝性酸 或鹼中毒時，血液碳酸氫根[HC(V]下降或升高，總二氧化碳也隨之下降或升高。 而單純呼吸性酸或鹼中毒時，血液碳酸氫根升高或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測定方法較可分為直接測定和間接推算兩類。直
接測定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴散法、流動注 射氣體擴散法等。間接推算是利用血氣分析儀測得的PH與PC02,根據H-H方程 的變換形式
HC03— (m mol /L) =0. 03XPC02(mm Hg) Xantilog(PH-p ka)或 HC0「(m mol/L)=0. 225XPC02(k Pa) Xantilog(PH-p Ka) 計算獲得。
式中PH為37。 C時測得值，pka在37。 C為6. 10。
目前，以間接推算法應用較普遍，由血液分析儀的微處理計算機並與血氣分 析結果一起報告，準確性基本可以符合臨床要求。
直接測定法以滴定法應用最廣泛，但由於受多種因素影響，測定誤差較大。 酶法測定適合自動化分析，結果可靠，應當是很有前途的測定方法，但目 前尚有待深入研究。檢索中國專利發現，申請號為96190276.0、申請日為1996. 02. 06的發明
專利申請公開了一種用來導出病人血液中氣體含量的非侵入性的系統和方法。 該系統相應於體積測量呼氣中的二氧化碳濃度。然後處理該數據導出動脈血中 二氧化碳氣體水平。若數據為時間域，處理可將時間域數據轉換成體積域。該 方法也經迭代評估了多個變量的顯著性，所得的關係可供快速和準確地對健康 人和患肺病病人進行血中氣體含量的測定。近年來，申請號為02282386. 7、申 請日為2002. 10. 29的實用新型專利公開了一種醫用的血液碳酸氫根測定儀，主 要由操作面板、進樣檢測機構、定滴加液機構、攪拌機構和以單片機為主控元 件的電器控制部分組成。其操作面板包括有手動按鍵、輸入鍵盤和顯示屏；進 樣檢測機構由沿圓周均布樣本孔且在孔內放置樣本瓶的樣本轉盤和豎直裝配在 轉盤下面的驅動電機及對應於檢測位樣本孔設置的光電檢測器組成；定滴加液 機構由配置電機的微量泵和設置於樣本孔上方的定滴頭及配置在定滴頭滴液口 處的計滴器組成；攪拌機構由設置在樣本轉盤下方相應位置的攪拌電機和裝配 在攪拌電機軸上的磁碟及放置於樣本瓶內的攪拌棒組成。
以上專利均與酶法測定無關，這從一個側面說明，國內此方面的實驗研究 十分缺乏。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯 法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在340nm 波長處吸光度的變化，得以測定二氧化碳濃度的方法，同時，本發明還將給出 用以實現該方法的二氧化碳診斷/測定試劑盒，採用該試劑不僅可以在紫外/可見 光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行二氧化碳濃度測定，而且測定速度快、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明二氧化碳濃度測定方法原理如下二氧化碳+過氧化氫+乙醯輔酶A 丙酮酸氧化酶 丙酮酸+
輔酶A+氧
丙酮酸+高鐵細胞色素bl +水丙酮酸脫氫酶 乙酸+ 二氧化碳
+亞鐵細胞色素bl
乙酸+還原型輔酶 醛脫氫酶 乙醛+輔酶+水
這種方法應用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase (CoA-acetylating); EC 1.2,3.6) 酶(偶)聯丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.2.2)、醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase; EC 1.2.1.3; EC 1.2.1.4; EC 1.2.1.5)酶促反應連續監測法。丙 酮酸氧化酶作為作用酶，功能為將二氧化碳酶解產生丙酮酸。丙酮酸脫氫酶作
為循環酶丙酮酸脫氫酶再將丙酮酸再次變回二氧化碳，使二氧化碳不斷地被 重複循環利用，同時不斷的循環產生乙酸。醛脫氫酶作為顯色酶，在乙酸存在
下將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒 有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測 量340nm處吸光度下降的速度，可以測算二氧化碳的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明二氧化碳診斷/測定試劑盒較為
理想
緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
丙酮酸脫氫酶 8000 U/L
醛脫氫酶 10000 U/L過氧化氫 12 mmol/L
乙醯輔酶A 7 mmol/L
高鐵細胞色素bl 7 mmol/L
本發明的二氧化碳診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括-
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫 酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色 素bl。 試劑2
緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶。 還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶、過氧化氫、乙醯輔 酶A、高鐵細胞色素bl在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是幹 粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色 素bl。 試劑2
緩衝液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶。試劑3
緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶。 還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶、過氧化氫、乙醯輔
酶A、高鐵細胞色素M在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒 可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使 用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定二氧化碳濃度的方法，其還原型輔 酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
丙酮酸氧化酶 6000 U/L
丙酮酸脫氫酶 8000 U/L
醛脫氫酶 10000 U/L
過氧化氫 12 mmol/L
乙醯輔酶A 7mmol/L 高鐵細胞色素bl 7mmol/L 試劑全 溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍千燥，製成乾粉試劑；使用前， 加入純淨水，復溶後使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑的體 積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢 測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。 實施例二
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑 還原型輔酶 過氧化氫 乙醯輔酶A 高鐵細胞色素bl 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑 過氧化氫 乙醯輔酶A 高鐵細胞色素bl
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8
100醒ol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 12 mmol/L 7 mmol/L 7 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12 mmol/L 7 mmol/L 7 mmol/L±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測二氧化碳樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約l 分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。 實施例三
本實施例的二氧化碳診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液
穩定劑
還原型輔酶
過氧化氫
乙醯輔酶A
高鐵細胞色素bl
100 mmol/L 50 mmol/E 0.25 mmol/L 12 mmol/L 7 mmol/L 7 mmol/L
試劑2
二 ^給
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸脫氫酶
500 mmol/L 8000 U/L 10000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸氧化酶
500 mmol/L 6000 U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定二氧化碳濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間
IO分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測 二氧化碳樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負 反應(下降反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到 本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器 得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.003;吸光度時 間反應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形範圍可達 5Ommol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的精密 度(重複性)的變異係數(CV)《3%;試劑的靈敏度可達0.12 ± 0.06 AA/ mmol /L;試劑在2—8"C下保存，活性可以穩定一年；——本發明靈敏度高、 精確度好，線形範圍寬廣，穩定期長，足以便於推廣應用。
ii
權利要求
1.一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的二氧化碳濃度測定方法，其方法原理如下二氧化碳+過氧化氫+乙醯輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧丙酮酸+高鐵細胞色素b1+水丙酮酸脫氫酶乙酸+二氧化碳 +亞鐵細胞色素b1乙酸+還原型輔酶醛脫氫酶乙醛+輔酶+水將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出二氧化碳的濃度大小測定結果。
2.其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶、 過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶、 過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl組成雙劑試劑；試劑l，由緩衝 液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl組成； 試劑2，由緩衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶組成。 還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl組成多劑試劑；試劑l，由緩衝 液、穩定劑、還原型輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl組成； 試劑2，由緩衝液、穩定劑、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶組成；試劑3，由緩 衝液、穩定劑、丙酮酸氧化酶組成。還原型輔酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素bl在試劑1、試 劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述二氧化碳診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括穩定劑14000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的二氧化碳診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定二氧化碳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、還原型輔酶、過氧化氫、乙醯輔酶A、高鐵細胞色素b1、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出二氧化碳的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101620171SQ20081012424
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司