用於快速競爭性同質性分析的裝置、組合物和方法

2023-09-13 03:17:50

專利名稱：用於快速競爭性同質性分析的裝置、組合物和方法
用於快速競爭性同質性分析的裝置、組合物和方法相關申請本申請要求2007年9月10日提交的序號為60/993，034和2007年9月25日提交的序號為60/995，186的美國臨時專利申請的權益，其通過引用整體併入本文。領域本文實施方案一般涉及用於快速檢測和/或確定樣品中靶分子的濃度和/或存在 的裝置、方法和/或組合物。某些實施方案涉及使用本文公開的裝置和系統檢測和確定靶 分子的濃度和/或存在。方法、組合物和/或裝置對於寬濃度範圍的靶分子的檢測和/或 濃度測量有效。背景檢測低濃度蛋白在醫藥、食品檢驗、生物研究和生物戰劑檢測領域是至關重要的。 測量蛋白質的最常用工具之一是抗體，例如免疫分析。對於使用完整抗體分子的一種常用 替代方法是只使用抗體的結合區。例如，多種抗原結合抗體片段是已知的，例如Fab片段、 Fab'片段、F(ab)2片段、F(ab' )2片段或scFv片段。對於測量靶分子的抗體的另一近期替代物是適體。適體是能夠被獲得用於測量靶 分子的核酸分子。適體提供一些優點在相對短的時間內體外生成、具有長的貯存期限、易 於化學修飾以及可能表現出比抗體更好的結合特徵，但適體生成的成本高並且通常在一些 生物流體中穩定性低。用於檢測和/或確定溶液中分子濃度的現有方法未能將短分析時間、高靈敏度和 檢測和/或定量非常低濃度存在的靶分子所需的分析較大樣品容量的能力結合起來。概述本文實施方案涉及用於檢測和/或確定靶分子的設備、方法和組合物。在某些實 施方案中，本文方法涉及檢測和/或確定寬濃度範圍的蛋白質或其它靶分子。根據這些實 施方案，組合物和方法可以涉及使用結合劑，例如抗體、適體、生物受體或設計的小分子結 合劑，用於使用本文公開的方法和設備來檢測和/或確定靶分子濃度。其他實施方案涉及通過未標記靶分子和可追蹤劑-靶分子複合物與軛合於捕獲 劑的溶液相劑(solution phase agent)競爭性結合來檢測樣品中的靶分子。在某些實施 方案中，溶液相劑可以是已經軛合於捕獲分子的抗體、抗體片段、生物受體、適體或特別選 擇的小分子結合劑。在某些實施方案中，捕獲分子可以是抗生物素蛋白，例如鏈黴抗生物素 蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、寡核苷酸引物或肽核酸(PNA)引物。根據這些實 施方案，溶液相劑可以結合與捕獲分子軛合物軛合的溶液相聚合物，並降低凝膠電泳中溶 液相劑的電泳遷移率。因此，結合的可追蹤劑-靶分子複合物在分子分離技術(例如電泳) 中容易與未結合的可追蹤劑-靶分子複合物分離，提供兩個群體的靶分子。此外，這兩個群 體可以被測量，提供與靶分子濃度成反比和成正比的信號。靶分子/溶液相劑/聚合物復 合物與未結合靶分子之間的電泳遷移率差異允許該過程既快速又有效。在某些實施方案中，特異性抗體可以結合與捕獲分子軛合的溶液相聚合物以降低 抗體的電泳遷移率。因此，結合的可追蹤劑-靶蛋白分子複合物可通過分離方法(例如電泳)與未結合的可追蹤劑-靶蛋白分子分離。然後，這兩個群體可使用特異性單克隆或多克隆抗體測量，提供與靶蛋白分子濃度成反比和成正比的信號。根據這些實施方案，靶/抗 體/聚合物複合物與未結合靶之間可以產生大的電泳遷移率差異，允許感興趣靶分子的分 離、快速檢測和確定。在某些實施方案中，所公開的方法將夾心免疫分析從異質性分析轉變為同質性分 析，從而消除了許多通常伴隨異質性分析(例如夾心ELISA分析)的勞動密集和高成本的 步驟。在其他實施方案中，所公開的方法獲得完全在溶液相中進行分析所具有的動力學優 點。本文實施方案可以允許夾心免疫分析在數分鐘而非數小時內進行並且具有降低的成 本。其他實施方案涉及用以評估、讀取和/或記錄本文公開方法所提供數據的系統。 在某些實施方案中，本文公開的設備提供對感興趣靶分子的存在或不存在和/或定量的實 時的視覺檢測和評估。本文涵蓋的一些實施方案允許靶分子在無凝膠系統中分離。根據 這些實施方案，本文涵蓋的裝置可以是反應室。在某些示例性反應室中，靶分子的存在或 不存在和/或濃度的評估可以在小於一小時或小於45分鐘或小於30分鐘或小於15分鐘 內評估。一個示例性反應室可以包括但不限於至少兩個電極(例如，陽極和陰極鉬電極) (901)、至少兩個電極端子(902)、至少兩個緩衝液貯器(903)、至少兩個橡膠墊片(例如， 矽)(904)、位於反應室上端和下端的透析膜(905)、至少一個石英反應通道(906)、至少兩 個通道託架(907)、以及位於至少兩個緩衝液貯器和至少一個反應通道之間的至少兩個電 壓傳送通道(908)。本文公開的其他實施方案包括作為系統的部分而涵蓋的裝置。根據這 些實施方案，系統可以包括裝置、電壓源(例如，提供約lOv/cm至約1，ΟΟΟν/cm的電壓源)、 雷射器(例如，連續波雷射器)(1001)、雷射束(1002)、整形稜鏡(例如，雷射線束整形稜 鏡)(1003)、反應室(900)、反應通道(906)、光發射(例如，發射的螢光)(1006)或顏色發 射、透鏡和過濾器(1007)、照相機(例如，電荷耦合器件照相機)(1008)和任選的、接收系統 數據的計算機。在某些實施方案中，系統還可以包括加載設備(例如自動化的)(1101)、滾 筒(1102)和用於分析多個分析(multiple assay)的多個反應室(1103)。在某些實施方案中，本文使用的涵蓋的膜(例如，透析膜)可以包括任何透析膜， 例如商業上可獲得的透析膜。根據這些實施方案，透析膜位於反應室的頂部並任選位於底 部。在某些實施方案中，透析膜與反應室的頂部和底部直接接觸。本文預期公開的反應室被布置為單通道分析或多通道分析。單通道反應室分析可 以是能夠位於工作檯上的獨立的反應室或手持式可移動反應室設備。預期單通道反應室允 許將受治療者的樣品放入無凝膠反應室，並且樣品的分離結果可以容易地在實驗室或實驗 室環境外分析。本文涵蓋的其他實施方案可以包括計算機和計算機軟體，用於接收、記錄、處理和 /或顯示從本文公開的組合物和方法獲得的數據。在某些實施方案(例如，

圖12所示的實 施方案)中，示例性軟體的截屏可以包括照相機(1008)捕獲的圖像。本文涵蓋的軟體程序 的進一步實施方案可以允許選擇待分析區域，例如用於條帶強度分析和/或評價靶分子復 合物濃度。根據這些實施方案，預期計算機軟體程序將允許評價和分析多個反應室實驗和 多種樣品中的靶分子分析。如圖12右窗口所示，每一分析運行的參數可以被設置，例如暴 露時間、暴露間隔時間、暴露次數，然後數據可以被顯示，允許在線分析數據。
在一個實施方案中，計算機軟體程序可以用於評估樣品中靶分子的存在或濃度。 在另一實施例中，可以評估多樣品中靶分子的存在或不存在。樣品的參數，例如與受治療者 有關的來源和從受治療者的取樣，可以用於確認每個樣品。此外，可以相對於其他樣品分析 樣品製備的相關參數和用於確認樣品的結合劑。可以從本文涵蓋的軟體程序獲得最佳條件 以增加樣品製備和分析中的重現性和一致性。此外，樣品分析獲得的數據可以用於評估獲 得樣品的受治療者中病況的存在、汙染物的存在、物質的存在，或者物質的存在或不同濃度 所代表的病況的進展。本文涵蓋的受治療者可以是人或動物。可選擇地，樣品可以獲自地 點或表面而非受治療者。分析本文公開的分析而獲得的數據可以用於評估受治療者施用至 少一種治療劑的治療的需要。如果靶分子的存在、不存在或濃度水平與受治療者的病況相 關，則這些分析可以在患者的整個治療性處理過程中使用，以連續分析治療進展。在另一實 施方案中，這些測試可以與其他測試一起使用，以獲得對受測試的受治療者的總體病況更 全面的理解。附圖簡述圖1表示可追蹤分子(101)(例如螢光素)與靶分子(102)連接形成可追蹤靶分 子(103)的示例性示意圖。圖2表示捕獲成分(104)(例如生物素)與結合劑(202)(例如抗體)連接形成捕 獲成分_結合劑複合物(203)的示例性示意圖。圖3表示可追蹤靶分子(103)、捕獲成分_結合劑(203)和游離靶分子(102)結合 形成複合物(301，302)和過量可追蹤劑-靶分子複合物(103)的示例性示意圖。圖4表示圖3所示反應的可追蹤產物與過量中性抗生物素蛋白(401)混合產生可 追蹤劑(403)或游離靶分子(402)與捕獲成分-結合劑和多價劑(例如，中性抗生物素蛋 白)(401)的複合物以及過量的可追蹤劑-靶分子複合物(103)和中性抗生物素蛋白的示 例性示意圖。圖5表示圖4所示反應產物與過量多價劑(例如，中性抗生物素蛋白)和過量基 本不帶電的可捕獲聚合物(例如，生物素軛合的聚合物)混合產生靶分子(502)或可追蹤 劑-靶分子複合物(503)與捕獲成分-結合劑和多價劑和可捕獲聚合物的複合物，以及過 量的可捕獲聚合物(501)和過量的可追蹤劑-靶分子複合物(103)的示例性示意圖。圖6A表示從頂部到底部三層的反應室初始狀態的示意圖分別是樣品層、捕獲層 和堆積層。樣品層可以包括圖3所示反應左側的任何或所有組分，反應緩衝液中含有過量 多價劑(例如，中性抗生物素蛋白)。捕獲層含有在反應緩衝液中基本不帶電的可捕獲聚合 物(例如，生物素軛合的聚合物)。堆積層含有基本不帶電的聚合物(例如，線性聚丙烯醯 胺)。每個圖中室左側顯示的灰色跡線表示在每個點可檢測量的信號生成抗體。圖6B表示能夠在示例性樣品層中自組裝的、示例性圖3和圖4所示反應所示複合 物的示意圖。圖6C表示垂直方向上的電壓應用示意圖，導致所有組分電泳進入捕獲層並形成 圖5所示反應所示的複合物。圖6D表示所有組分由於電壓進一步應用而遷移的示意圖，導致所有未結合基本 不帶電的可捕獲聚合物(例如，生物素軛合的聚合物)的複合物移動進入並通過堆積層，而 結合的複合物濃縮在捕獲層和堆積層的界面。
圖7A表示其中樣品中的未標記的運鐵蛋白(靶分子)與8nM FITC-標記的運鐵 蛋白(可追蹤靶分子)競爭的劑量-響應實驗的數據的示例性曲線圖。這些示例性曲線圖 代表從頂部到底部約30秒間隔的時間點。每個曲線圖左側最接近陰極，因此大多數物類向 右遷移。圖7B表示其中樣品中的未標記的運鐵蛋白(靶分子)與8nM FITC-標記的運鐵 蛋白(可追蹤靶分子)競爭的劑量-響應實驗的數據的示例性曲線圖。條件與圖7A相同， 除了將26nM未標記的運鐵蛋白與圖7A的所有組分一起混入樣品層。圖7C表示其中樣品中的未標記的運鐵蛋白(靶分子)與8nM FITC-標記的運鐵 蛋白(可追蹤靶分子)競爭的劑量-響應實驗的對照運行數據的示例性曲線圖。條件與圖 7A相同，除了抗體(結合劑)被置於樣品層之外。圖8表示圖7A-7C的示例性曲線圖以及介於0和102nM之間的其他未標記的運鐵蛋白(靶分子)濃度在各濃度10分鐘計算的峰面積的示例性圖。表示了典型的競爭曲線。圖9A-9C表示示例性反應室(900)。9A表示反應室的示例性俯視圖，包括但不限於 (901)鉬電極、(902)電極端子、(903)緩衝液貯器、(904)矽橡膠墊片、(905)透析膜、(906) 石英反應通道、(907)通道託架、(908)緩衝液貯器和反應通道之間的電壓傳送通道。9B表 示反應室的示例性前視圖，包括但不限於(906)石英反應通道和(904)矽橡膠墊片。9C表 示反應室的示例性側視圖，包括但不限於(907)通道託架、(903)緩衝液貯器、(902)電極端 子、(905)透析膜、(904)矽橡膠墊片、(908)緩衝液貯器和反應通道之間的電壓傳送通道。圖10表示本文涵蓋的裝置(1000)的示例性示意圖，包括但不限於(1001)473nm 連續波雷射器、(1002)雷射束、(1003)雷射線束整形稜鏡、(900)反應室、(901)鉬電極、 (906)石英反應通道、(1004)發射的螢光、(1005)透鏡和過濾器、和(1006)電荷耦合器件 (CCD)照相機。圖11表示本文涵蓋的具有多個反應室的系統(1100)的示例性示意圖，包括但不 限於(1001)473nm連續波雷射器、(1006)CCD照相機、(1101)自動加載設備、(1102)滾筒、 和(1103)反應室。圖12表示本文涵蓋的一些實施方案的軟體的示例性截屏。左窗口表示CXD照相 機(1102)捕獲的圖像，並允許選擇待分析區域。右窗口設置本文涵蓋的分析的參數(例如 暴露時間、暴露間隔時間、暴露次數)，顯示一個或多個分析的代表性數據，並允許在線分析 數據。圖13A-13B表示本文涵蓋的一些實施方案的示例性軟體截屏。圖14表示本文涵蓋的一些實施方案的示例性軟體截屏。圖15表示圖13的曲線圖以及介於0和102nM之間的其他未標記的運鐵蛋白濃度 在各濃度10分鐘計算的峰面積的示例性數據，描繪了得到的圖。圖16表示本文公開的示例性系統的視圖。該示例性圖表示反應室(900)、照相 機(1006)、雷射器(1001)、與雷射器可操作連接的光束定向器(例如，45度光束定向器) (1601)、和光束擴展器(例如，Galilean光束擴展器AR塗層350-650nm) (1602)的側視圖。 在一個示例性實施方案中，圖16所示系統可以是麵包盒尺寸，例如5-6英寸X16英寸，或 甚至小5倍或10倍，以便例如以實現便攜性。圖17表示本文公開的示例性系統的視圖。該示例性圖表示反應室(900)、照相機(1006)和光束擴展器(例如，Galilean光束擴展器AR塗層350-650nm) (1602)的俯視圖。圖18表示本文公開的示例性裝置的視圖。該示例性圖表示帶有室支架板(例如， Delrin室支架板)(1801)的反應室(900)、貯器(Delrin緩衝液貯器)(903)和基板(例如， Delrin基板)(1802)的俯視圖，A指示圖19放大視圖所表示的圖解圓圈。圖19表示本文公開的示例性裝置的視圖，還在圖18中以縮小尺寸表示為A。該示 例性圖表示反應室(900)的側視圖，其具有石英反應室(906)、室密封件(例如，矽反應室密 封件)(1901)、支架(例如，Delrin反應室支架)(1801)、窗(例如，尺寸調節窗)(1902)、膜 (例如，透析膜)(905)、墊片(例如，矽反應室墊片)(904)、與1902不同的窗(例如，藍寶 石窗)(1903)、窗密封件(例如，矽藍寶石窗密封件)(1904)和窗架(例如，Safire窗架) (1905)。圖20表示示例性計算設備。圖21表示用於評估樣品中靶分子存在或濃度的示例性方法的流程圖，具有用於 產生根據本文公開的一些實施方案的標準曲線的示例性操作。定義如本文使用，〃一個〃或〃一種〃可以表示一個或多於一個的項目。如本文使用，器皿(vessel)可包括但不限於管、通道或容器(container)。詳述在以下章節中，描述了各種示例性組合物和方法以詳細說明各種實施方案。對於 本領域技術人員明顯的是，實施各種實施方案不需要採用本文列出的具體細節的全部或甚 至某些，而是濃度、時間和其他具體細節可以通過常規實驗來修改。在一些情況下，公知的 方法或組分未包括在說明書中。本文實施方案涉及用於檢測和/或確定靶分子的設備、方法和組合物。在某些實 施方案中，本文方法涉及檢測和/或確定樣品中寬範圍濃度的蛋白質或其他靶分子。根據 這些實施方案，組合物和方法可以涉及使用結合劑例如抗體、抗體片段、適體、生物受體或 設計的小分子結合劑，用於使用本文公開的方法和設備來檢測和/或確定靶分子。分子運動的理論處理如本文涵蓋的，粒子(其可以是分子)經流體的運動經歷與其速度、其尺寸(由其 流體動力學半徑描述)和流體粘度成正比的摩擦力。方程1(參見示例性方程)所示的該 正式表達被稱為斯託克斯方程。稱為遷移率的量由方程1定義，以便粒子速度除以遷移率得到摩擦力。對於球形 分子，流體動力學半徑等於半徑。對於非球形分子，其可以定義為在蠕動流條件下有等效表 現的球形分子的半徑(如果分子形狀已知，則其可以被理論推導)。從方程1獲得的遷移率 在方程2a中表達。如果假定已知分子量的分子為球形，則半徑如方程2b所示計算。將方 程2b代入方程2a產生依照分子密度、分子量和流體粘度的遷移率的表達，如方程2c所示。粒子以恆定速度運動，此時歸因於該運動的摩擦力等於施加力(例如重力、電壓 梯度)。設置摩擦力等於施加力並求解速度，將粒子速度表示為施加力乘以遷移率，如方程 3所示。因此，遷移率提供計算粒子速度的方便的方式。分子在電場中經受的力與分子上的 電荷和電場強度成正比。因此，分子速度由方程4給出，其中"u 「表示的量稱為電泳遷移 率(單位為cm2/V sec)，由方程5定義。方程5中的因子107將電荷e伏特(其為m_kg-S單位)轉換成cm-g-s單位。注意，方程4暗示，帶負電的分子(負離子)以與正離子相反的方向運動。在方程4的更一般形式中，粒子速度和電場(其是電壓梯度)是向量並因此具有與其相伴的方向。遷移率還與斯韋柏係數s密切相關，斯韋柏係數s被定義為粒子在離心機中20°C 水中的沉降速度除以離心加速度。斯韋柏係數以10_13秒的單位表達。使用方程3的浮力 來發現速度，斯韋柏係數作為遷移率的函數由方程6a給出。因此，遷移率可以如方程6b所 示從斯韋柏係數導出。在一些實施方案中，可以使用與感興趣的靶分子特異性締合或結合的結合劑。在 一些更具體的實施方案中，可以使用結合感興趣的靶分子的抗體、適體或其他特別設計的 分子。在某些實施方案中，血清中發現的抗體的最常見類型之一可以被導向結合靶分子，例 如免疫球蛋白G(IgG或γ球蛋白)。IgG的分子量為大約150kDa(1320胺基酸殘基)。不 同IgG分子的等電點範圍從6至7. 5，暗示在中性pH下中等負電荷至輕微正電荷。IgG的 斯韋柏係數為大約7。假設密度約1. 2g/cm3，根據方程2b計算的遷移率為2. IX 107s/g，而 根據方程6b計算的遷移率為1. 7X10Ts/g。這兩種計算之間的差異來自至少三個原因(1) IgG不是完美球形分子，因此通過 沉降計算的遷移率應該較低；(2) IgG的密度不是精確已知的，並且這種不確定性在第二種 計算中被放大而在第一種計算中被縮小；和(3)第二種計算中使用的斯韋柏係數僅是大約 已知的。在某些實施方案中，IgG的遷移率可以估計為2X107s/g。可靠測量的蛋白質濃度已導致許多涉及抗體或抗體樣分子的分析的發展。多種多 樣的免疫分析是本領域已知的並且涵蓋在本文中。以下一些描述使用抗體作為結合劑，但 是許多其他物質涵蓋在本文中，例如適體、特別設計的結合劑以及抗體片段例如Fab片段 或適體。在某些實施方案中，選擇信號系統對於本文公開的方法而言是重要的但不一定是 核心的。螢光標籤可以軛合於本文公開的結合劑。例如，諸如FITC或若丹明的分子可以軛 合於抗體以提供螢光信號。在其他實施方案中，軛合的酶可以軛合於結合劑，例如鹼性磷酸 酶或辣根過氧化物酶(如果需要比色分析)，或者諸如碳酸酐酶或脲酶的酶(如果需要電導 率分析)。根據這些實施方案，酶分析通常需要添加適合的酶底物。免疫分析免疫分析可以被表徵為「異質性的」或「同質性的」。本領域技術人員對這些術語的 含義存在一些困惑。在一些情況下，術語「同質性的」可以暗示結合的複合物在檢測前與未 結合的分子分離(通過任何方式)，而術語「異質性的」暗示很少或沒有分離發生。可選地， 本文涵蓋的術語「異質性的」可以表示分析可以使用固相和溶液相兩者，其中複合物與固相 的連接允許未結合分子在檢測複合物之前被洗掉(或者結合的分子被洗掉，取決於相)。此 夕卜，如本文所涵蓋的，術語「同質性的」可以表示結合、分離(如果有)和檢測步驟發生在溶 液相。在許多情況下，這些不同的定義在分析如何分類中產生很少差異，因為大部分分離或 洗滌步驟涉及結合至固相支持體，因此涉及分離或洗滌的分析通過任一定義都將被分類為 異質性的。一個例外是通過電泳的分離，其中分析可能根據第一套定義而被分類為異質性 的，並根據第二套定義而被分類為同質性的。預期本公開的實施方案可能主要根據第二套 定義。因此，如在本文某些實施方案中公開的，異質性分析包括將抗體_靶分子複合物在測試過程中結合至表面，然後洗掉未結合的靶分子、樣品中的其他物質和未結合的抗體，然後測定樣品中靶分子的存在和/或測量其量。另一方面，異質性分析允許樣品和抗體混 合在一起並確定待確定樣品中靶分子的存在和/或測量其量，不需要結合至表面或洗滌。異質性分析可以具有高靈敏度和特異性，並且能以提供極高通量測試系統的形式 進行。這些形式還可適以測試大多數靶分子。一個限制包括緩慢的測試時間需要相對精密 的儀器以大量進行以及伴隨表面結合和洗滌步驟增加的成本。同質性分析可以是非常快的，可容易適用於新的蛋白質、肽或其他分子和平臺，並 且可以是非常具有成本效益的。限制可包括可能較低的特異性和靈敏度。此外，這些形式 可能局限於小的靶抗原。因此，同質性和異質性分析兩者在本文根據需要、被分析的樣品和 感興趣的靶分子而被考慮。定量競爭性免疫分析的一個實施方案可以包括與固相支持體結合的抗體以及溶 液中被允許結合至抗體的標記的和未標記的靶。標記的靶可以與未標記的靶競爭有限數目 的抗原結合位點。靶分子上的標記可以是放射性同位素、酶或螢光分子。使用該類型免疫 分析產生的信號與未標記的靶濃度成反比。本領域存在許多同質性競爭性免疫分析。一般，同質性免疫分析是有利的，因為結 合的和游離的配體的分離通常不是必要的，因此簡化了儀器。這裡，所有結合發生在溶液相 中，因此這些方法往往是快速的。這些技術的一般優點包括(1)由於僅需要單一結合劑(例如抗體)而簡化了分 析的開發，(2)通常比傳統的雙位點分析更快的分析時間，(3)跨寬分析範圍的定量測量， 和(4)有能力對太小以致於不允許同時結合兩個抗體的靶有效(例如，夾心分析)。同質性免疫分析提供與靶濃度成反比的一種或多種信號。該事實導致很難以該技 術測量小濃度，因為小信號中的小變化能夠比大信號中的小變化更可靠地測量。特異性僅 源自單一結合事件，而同質性分析的靈敏度可以使用高品質抗體來提高。下文是一些常用技術的一些描述。該列表不是窮盡性的，並且不意味著排除可能 在本領域已知的任何其他同質性競爭性分析。一些最早的同質性競爭性分析涉及監測不溶性抗原_抗體複合物的形成，例如使 用多克隆抗體。簡言之，因為靶特異性多克隆抗體可以識別靶上的多個表位並且是二價的， 靶和抗體的大型複合物可以在靶和抗體濃度大致相等時形成。這些複合物的尺寸可以長至 它們變成不溶性的點。這些不溶性複合物阻礙或散射穿過樣品基質的光。這些散射的光可 以通過濁度法測量，或者相反地，通過樣品的光衰減可以通過比濁法測量。產生的信號與樣 品中存在的靶的量成正比。該技術對於以相對高水平存在並且尺寸足以具有多個抗原結合 位點的分析物非常有效。注意，隨著靶濃度逐漸超過抗體結合位點，多個抗體同時結合同一 抗原的能力下降。因此，通過在分析混合物中加入已知濃度的純化抗原以使抗體_抗原復 合物形成最大化，可以使分析成為競爭性的；待分析樣品中添加抗原可以導致複合物形成 的減少。一些限制可能包括需要多個結合位點和低濃度測量的不適合性。該方法還可能受 到樣品基質改變和特異性缺乏的影響。另外的同質性競爭性免疫分析是螢光偏振免疫分析(FPIA)。FPIA取決於溶液中 分子或複合物的轉速。較大的分子或複合物比較小的分子或複合物旋轉更慢。當適合波長 的偏振光穿過樣品時，如果分子或複合物旋轉足夠慢，則螢光發射光的偏振被保持。如果未結合的螢光標記靶足夠小以致於其轉速足夠快，則發射光消偏振。如果螢光標記的靶結合至特異性IgG，則複合物的質量增加，減緩轉速並保持發射光的偏振。在某些系統中，FPIA分析系統包括靶特異性抗體、螢光標記的靶和待定量的未標 記的靶。標記的和未標記的靶競爭特異性IgG上有限數目的結合位點。偏振螢光信號與未 標記靶的濃度成反比。該方法因其簡單性和速度而受到關注。FPIA限於小分子靶並且因為 靈敏度而犧牲了分析範圍。有許多其他競爭性同質性分析，例如CEDIA ，EMIT 、輔基免疫分析 (prosthetic-group immunoassay) λf^^^^tiT (enzyme-channelingimmunoassay)禾口 底物標記的螢光免疫分析。這些方法是競爭性的，並且一般涉及抗體與靶結合後酶或酶復 合物的活化或失活。這些方法具有與FPIA相似的益處和限制。親和探針毛細管電泳(APCE)毛細管電泳涉及藉助帶正電和帶負電的電極在填充有離子緩衝液的長毛細管的 兩端施加電壓，從而導致帶電分子向一個電極或另一個電極遷移(Oda和Landers，1997)。 一個常見的伴隨現象被稱為「電滲流」。玻璃毛細管往往具有帶負電的表面，其與溶液中接 近表面的帶正電的離子結合。這些帶正電的離子向負電極(陰極)遷移，隨其拖帶主體溶 液。該電滲流導致所有離子向陰極遷移(儘管以不同速率)並通常被良好利用，因為單一 檢測器可以分析所有離子物類，而不論它們流過時的電荷。電滲流可以通過改變毛細管壁 的電特徵而被消除或甚至逆轉。對於APCE，靶分子與已經軛合至檢測分子(通常為螢光探針)的同源抗體一起孵 育。然後將混合物注射入毛細管並施加電壓，建立電滲流。游離靶、游離抗體和靶/抗體復 合物將以不同速率遷移，並可以因此通過螢光檢測器檢測為單獨的峰(游離靶不應該產生 信號)。電泳電泳是可以用於替代洗滌結合至固相支持體的複合物、從而將正常為異質性蛋白 質分析的分析轉化為同質性分析的技術。電泳通常用於根據分離尺寸和電荷來分離分子 (例如，諸如蛋白質或核酸的大分子)。正電極和負電極可以放入含有待分離分子的溶液 中，並在電極之間施加電壓降。一般，帶正電的分子會向帶負電的電極遷移，而帶負電的分 子會向帶正電的電極遷移。一般，分子遷移的速度與它們的電荷成正比並且與它們的尺寸 成反比。例如，小的高電荷分子比大的較少電荷分子移動快。然而，緻密分子比鬆散分子移 動快，使得具有相同質量和電荷的兩個分子可以不同速率遷移。較高的電壓降導致更快的 遷移，而溶液中其他帶電分子的較高濃度導致較慢的遷移。有許多本領域已知的電泳的改變。分子移動通過的溶液可以是通常在毛細管中自 由的，或者其可以嵌入基質中。常見基質包括聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂糖凝膠和濾紙。基質用 於根據尺寸篩分分子，導致更好的分離。溶液Ph(酸度)影響分子電荷，並且可以被改變 (甚至從基質一端至另一端)以影響分子的遷移速率。溶液可以包括引起蛋白質和核酸分 子解摺疊以使相同質量和電荷的分子的遷移率相同的變性劑，例如尿素。待電泳的樣品可 以用洗滌劑(例如SDS)預處理，所述洗滌劑包裹所有蛋白質以消除電荷差異，以便遷移速 率取決於質量而非電荷。然而，對於需要結合劑(例如抗體、抗體片段或適體)的大多數分 析而言，蛋白質和結合劑都可能需要保持為其天然狀態，以使改變PH或變性蛋白質的過程通常不是可行的選擇。蛋白質的檢測本文某些實施方案涉及將異質性競爭性分析轉化為同質性競爭性分析。在一個實施方案中，異質性競爭性免疫分析可以轉化為同質性競爭性免疫分析。在一些實施方案 中，這些轉化的某些優點包括減少了通常伴隨異質性競爭性免疫分析的勞動密集和高成本 步驟和限制。此外，這些轉化允許同質性免疫分析的幾種形式。在其他實施方案中，幾乎或 完全在溶液相中進行本文涵蓋的分析可以具有其他潛在的動力學優點。而在其他實施方案 中，涵蓋了同質性競爭性分析較大分子的組合物、方法和裝置。例如，這些分析可以是免疫 分析或使用其他結合劑的分析。在某些實施方案中，競爭性免疫分析可以在數分鐘而非數 小時內進行並且具有降低的成本和對靶分子提高的靈敏度。在示例性實施方案中，使用的物質可以包括下述的一種或多種aplidin、阿扎 立濱、阿那羅唑、氮胞苷、博來黴素、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑制素-1、白消安、刺孢 黴素、喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、卡莫司汀、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉬、伊立替康(CPT-Il)、 SN-38、卡鉬、克拉屈濱、環磷醯胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、多西他齊(docetaxel)、更生黴 素、葡糖苷酸道諾黴素、柔紅黴素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、2-吡咯啉並多柔比星 (2P-D0X)、氰基-嗎啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫 司汀、依託泊苷、葡糖苷酸依託泊苷、磷酸依託泊苷、氟尿苷(FUdR)、3' ,5' -0-二油醯 基-FudR(FUdR-dO)、氟達拉濱、氟他米特、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥 脲、伊達比星、異環磷醯胺、L-天冬醯胺酶、甲醯四氫葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲孕酮 (medroprogesterone acetate)、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、6_巰基嘌呤、氨甲蝶呤、 米託蒽醌、光輝黴素、絲裂黴素、米託坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴胼、紫杉醇、噴司他丁、 PSI-341、司莫司汀鏈脲菌素、三苯氧胺、紫杉烷類、紫杉酚、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、 塞替派、替尼泊苷、託泊替康、尿嘧啶氮芥、velcade、長春花鹼、長春瑞濱、長春新鹼、蓖麻毒 蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、onconase, rapLRU DNA酶I、葡萄球菌腸毒素_A、美洲商 陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單孢菌外毒素、假單胞菌內毒素、反義寡核苷酸、幹 擾RNA或其組合。適體在某些實施方案中，使用的結合劑可以是適體。構建和確定適體結合特徵的方法 是本領域公知的。例如，這樣的技術描述於美國專利第5，582，981、5，595，877和5，637，459 號，每一個通過引用併入本文。適體可以通過包括合成、重組和純化方法在內的任何已知方法製備，並且可以單 獨使用或者與特異性針對相同靶的其他配體組合使用。一般，最少約3個核苷酸、優選至少 5個核苷酸是實現特異性結合所必要的。比10個鹼基短的序列的適體可能是可行的，儘管 10,20,30或40個核苷酸的適體可能是優選的。適體需要含有賦予結合特異性的序列，但可以側翼區擴展和以其他方式衍生。在 進一步實施方案中，側翼序列可以包含優先識別或結合部分以增強適體固定於底物的特異 性序列。適體可以如常規DNA或RNA分子一樣被分離、測序和/或擴增或合成。可選地，感 興趣的適體可以包含修飾的寡聚體。通常存在於適體中的任何羥基可以被膦酸基團、磷酸基團替代，被標準保護基保護，或者被活化以製備與其他核苷酸的額外鍵合，或者可以軛合於固相支持體。一個或多個磷酸二酯鍵可以被可選的連接基團所替代，例如P(O)0被P(0) S、P(O)NR2, P(0)R、P(O)OR』、CO或CNR2替代，其中R是H或烷基(1-20C)並且R』是烷基 (1-20C)；此外，該基團可以通過0或S連接於相鄰核苷酸。並不是寡聚體中所有的鍵合都 需要相同。用作確定特異性結合序列的本發明方法中起始材料的適體可以是單鏈或雙鏈DNA 或RNA。在優選實施方案中，所述序列可以是單鏈DNA，其比RNA較不易受核酸酶降解。在 優選實施方案中，起始適體將含有隨機化的序列部分，一般包括約10至400個核苷酸、更優 選20至100個核苷酸。隨機化序列側翼為引物序列，所述引物序列允許擴增發現與靶結合 的適體。為了合成隨機化區，可以在合成過程中在希望隨機化的位置添加核苷酸混合物。與感興趣的特定靶分子結合的適體的製備和篩選方法是本領域公知的並涵蓋在 本文中。技術一般涉及從候選適體混合物選擇和分步重複結合、分離結合適體與未結合適 體以及擴增。因為混合物中僅存在少數對應於最高親和力適體的序列(可能僅一個適體分 子)，一般希望設置劃分標準以使混合物中顯著量的適體(大約5-50%)在分離過程中被 保留。每個循環導致對靶高親和力的適體的富集。三至六個選擇和擴增循環的重複可以用 於產生與感興趣的靶分子高親和力和特異性結合的適體。成像劑和放射性同位素在某些實施方案中，靶分子(例如肽或蛋白質)可以連接於用於成像和診斷各種 患病器官、組織或細胞類型的成像劑。許多適合的成像劑以及它們連接至蛋白質或肽的方 法是本領域已知的。某些連接方法可以涉及使用金屬螯合劑絡合物，採用例如有機螯合劑 例如DTPA與蛋白質或肽連接。靶分子也可在偶合劑(例如戊二醛或高碘酸鹽)存在下與 酶反應。與螢光素標誌物的軛合物在這些偶合劑存在下或通過與異硫氰酸鹽反應製備。可能用作成像劑的順磁離子的非限制性實例包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵 (II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、 鏑(III)、鈥(III)和鉺(III)，釓是特別優選的。用於其他環境例如X射線成像中的離子 包括但不限於鑭(III)、金(III)、鉛(II)和特別是鉍(III)。可能用作成像劑或治療劑的放射性同位素包括砹211、14碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、 銅 62、銅 64、銅 fV52EiU氟 18、鎵 67、鎵 68、3 氫、碘 123、碘 124、碘 125、碘 131、銦 m、52 鐵、59 鐵、32 磷、 33磷、錸186、錸188、Sc47、75硒、銀m、35硫、鎝-、鎝 、釔86和釔9°。125I通常優選用於某些實 施方案，並且鎝99m和銦111也由於其低能量和適合遠程檢測而通常是優選的。放射性標記的蛋白質或肽可以根據本領域公知的方法生成。例如，它們可以通過 與碘化鈉或碘化鉀以及化學氧化劑(例如次氯酸鈉)或酶氧化劑(例如乳過氧化物酶)接 觸而被碘化。蛋白質或肽可以通過配體交換過程或直接標記技術而被鎝"""標記，所述配體 交換過程例如通過用亞錫溶液還原高鎝酸鹽、將還原的鎝螯合至葡聚糖凝膠柱並將肽施加 於該柱，所述直接標記技術例如通過孵育高鎝酸鹽、還原劑(例如SNCl2)、緩衝溶液(例如 酞酸鈉_鉀溶液)和肽。通常用於將作為金屬離子存在的放射性同位素結合至肽的中間官 能團包括二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、D0TA、ΝΟΤΑ、卩卜啉螯合劑和乙二胺四乙酸(EDTA)。還 考慮使用的有螢光標記物，包括若丹明、異硫氰酸螢光素和腎造影劑。在某些實施方案中，要求保護的蛋白質或肽可以連接至第二結合配體或酶(酶標籤)，其在與生色底物接觸後會產生帶色產物。適合的酶的實例包括脲酶、鹼性磷酸酶、(辣根)氫過氧化物酶和葡萄糖氧化酶。優選的第二結合配體是生物素和抗生物素蛋白或鏈黴 抗生物素蛋白化合物。這種標記物的使用對於本領域技術人員而言是公知的。這些螢光標 記物對於體內使用而言是優選的，但也可以用於體外應用、特別是內窺鏡或血管內檢測程序。在可選實施方案中，靶分子可以用螢光標誌物標記。可光檢測標記物的非限制 性實例包括 Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨基吖啶、B0DIPY630/650、BODIPY 650/665、 B0DIPY-FL、B0DIPY-R6G、B0DIPY-TMR、B0DIPY-TRX、5-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二 甲氧基螢光素、5-羧基-2'，4'，5'，7' _四氯螢光素、5-羧基螢光素、5-羧基若丹明、 6_羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、級聯藍(Cascade Blue)、Cy2、Cy3、Cy5、6_FAM、丹磺 醯氯、螢光素、HEX、6-J0E、NBD (7-硝基苯_2_氧-1，3- 二唑)、俄勒R綠488、俄勒岡綠 500、俄勒網綠514、太平洋藍、酞酸、對酞酸、異酞酸、甲酚紫(cresyl fast violet)、甲 酚藍紫(cresyl blue violet)、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、藻紅、酞菁、偶氮甲鹼、花青、黃 嘌呤、琥珀醯螢光素、稀土金屬穴合物(rare earth metal cryptates)、銪三聯吡啶二胺 (europiumtrisbipyridine diamine)、銪穴合物或螯合物、二胺、雙花青苷、La Jolla藍染 料、別藻藍蛋白(allopycocyaninhallococyanin B、藻藍蛋白C、藻藍蛋白R、硫胺素、藻紅 藍蛋白、藻紅蛋白R、REG、若丹明綠、異硫氰酸若丹明、若丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四 甲基若丹明異硫醇)、四甲基若丹明和德克薩斯紅。這些和其他發光標記物可以獲自商業來 源例如 Molecular Probes (Eugene, OR)。使用的化學發光標記化合物可以包括魯米諾、異魯米諾、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶 鹽和草酸酯或生物發光化合物例如螢光素、螢光素酶和水母發光蛋白。可以例如在手術中、 內窺鏡或血管內腫瘤或疾病診斷中使用診斷免疫軛合物。在各種實施方案中，使用的標記物可以包含金屬納米粒子。製備納米粒子的方法 是已知的。納米粒子可以獲自商業來源(例如，Nanoprobeslnc.，Yaphank，NY)。修飾的納 米粒子可商業獲得，例如來自Nanoprobes，Inc. (Yaphank，NY)的Nanogold 納米粒子。用 於軛合蛋白質或肽的功能化納米粒子可以商業獲得。交聯劑在一些實施方案中，蛋白質或肽可以使用本領域已知的各種交聯試劑標記，所述 交聯試劑例如同-雙官能、異-雙官能和/或可光活化的交聯試劑。這樣的試劑的非限制 性實例包括雙醯亞胺酯；1，5-二氟-2，4-( 二硝基苯)；辛二酸的N-羥基琥珀醯亞胺酯；酒 石酸二琥珀醯亞胺酯；二甲基_3，3' - 二硫-雙丙亞氨酸酯；N-琥珀醯亞胺-3-(2-吡啶 基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯基疊氮基苯；和4-疊氮乙二醛。在示例性實 施方案中，碳二亞胺交聯劑(例如DCCD或EDC)可以用於交聯酸性殘基與氨基或其它基團。 這樣的試劑可以被修飾以連接各種類型的標記物，例如螢光標記物。雙官能交聯試劑已經廣泛用於各種目的。攜帶兩個相同官能團的同雙官能試劑證 明高效誘導相同和不同大分子或大分子亞基之間的交聯以及多肽配體與其特異性結合位 點的交聯。異雙官能試劑含有兩個不同的官能團。通過利用兩個不同官能團的差別的反應 性，交聯可以被選擇地並順序地控制。雙官能交聯試劑可以根據它們的官能團的特異性來 衍生，所述官能團例如氨基、巰基、胍基、吲哚、羧基特異性基團。這些中，針對游離氨基的試劑已經特別流行，因為它們的可商業獲得性、容易合成以及並且它們可以被應用的溫和反 應條件。大部分異雙官能交聯試劑含有伯胺_反應性基團和硫醇_反應性基團。在另一實例中，異雙官能交聯試劑和使用所述交聯試劑的方法被描述(美國專利 5，889，155，通過引用併入本文)。交聯試劑組合了親核醯胼殘基與親電馬來醯亞胺殘基，在 一個實例中允許乙醛偶聯至游離硫醇。交聯試劑可以被修飾以交聯各種官能團。如本領域已知，任何可區別的組分可以任何方式與樣品中待檢測的感興趣的靶分 子共價連接或結合。符號a =離心加速度[cm/s2]e=電子或質子的單位電荷[1.6X10-19C(庫倫)]f =施加力[g cm/s2]ff =摩擦力[g cm/s2]r =分子的流體動力學半徑[cm]m=遷移率[s/g]M=分子量[g/摩爾]N =阿伏加德羅常數(6. 023 X 1023/摩爾)s =斯韋柏係數[10-13s]u =電泳遷移率[cm2/s_V]v =粒子通過流體的速度[cm/s]z=分子上的淨電荷n =流體粘度[g/cm-s]p =分子密度[g/cm3]pf =流體密度[g/cm3]V=電場[伏/cm]ff = 6 3i r n v(方程 1)m = v/ff = 1/(6 3i rn) (方程 2a)formula see original document page 16formula see original document page 16formula see original document page 16formula see original document page 16
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formula see original document page 17formula see original document page 17計算機軟體在本文涵蓋的某些實施方案中，用於本文公開方法的有關反應室和具有一個或多 個反應室的系統的軟體應用(例如，EVEIA分析和EVEIA儀器)可以使用本領域已知用於 此類方法的任何軟體編寫。可以使用軟體開發程序，例如Java Developers Kit (例如JDK 1.5. 06)和Eclipse集成開發環境(例如版本3. 2)，包括與隨購買的硬體提供的驅動器連 接的一些適配軟體。本文使用的軟體是高度模塊化的，由超過一百個編寫的類(軟體模塊) 組成，其轉而取決於JDK中包含的數百個類。Eclipse IDE組合了先進的代碼編輯器與編譯 器和文件管理系統。軟體用戶將看到一套至少三個不同的應用。在一個應用中，軟體控制裝置，收集並 保存數據至文件，並提供運行中的實時顯示。在另一應用中，軟體提供運行中產生的數據顯 示。此外，第三個應用允許比較來自不同運行的數據。所有應用允許簡單的數據分析(峰 高和峰面積)。在其他實施方案中，控制器應用由兩個或更多個窗口組成。至少一個窗口顯示照 相機捕獲的圖像，並為用戶提供選擇感興趣區域進行圖像分析的工具。至少第二個窗口提 供對於分析數據獲得的控制，包括暴露時間、暴露間隔時間和運行總長。在這時，對儀器的 控制限於在規定時間打開雷射器並持續規定時長(或控制快門來實現相同結果)，請求照 相機捕獲規定暴露時間的圖像，並且請求圖像下載到計算機。基線數據也可被獲取或從之 前保存的運行載入。每次運行保存的文件包括順序保存的每個單獨時間點的原始數據。改 變數據顯示方式(下一段詳述)不改變保存的數據。在某些實施方案中，控制器應用的第二個窗口(參見圖13A-13B)也能實時顯示數 據，並且提供改變數據顯示方式的工具。數據可以顯示為每次暴露的感興趣區域的原始圖 像(例如參見圖12，左圖)，為強度跨感興趣區域與軸向位置放射狀平均的圖像曲線，或兩 者。每個曲線的高度(y_刻度)和相鄰曲線之間的y_重疊量(從無重疊到完全重疊)可 以全部通過圖形用戶界面實時改變。此外，曲線上的區域可以被用戶選擇進行簡單數據分 析(峰高和峰面積)，其被實時顯示。該數據顯示特徵對於程序組內所有應用是常見的，並 且是軟體模塊基礎的實例，因為相同的類用於所有情況。在其他實施方案中，第二個應用允許控制器應用中保存的任何運行的重放(參見 例如圖13B)。外觀上，這與控制應用的第二窗口基本相同；然而，必須處理運行控制的按鈕 和域被檢索保存的運行並控制其顯示方式所必需的按鈕和域替代。例如，通過將顯示的曲 線數目限制為一個並通過使一系列曲線(代表單個時間點)以200毫秒的間隔顯示，保存 的運行可以重新顯示為影片。而在其他實施方案中，第三個應用允許顯示和比較不同運行所保存的數據的曲線 (參見例如圖14)。目前，從大約十次不同運行保存的文件可以被選擇來顯示。來自每次運行的任何單曲線(代表單個時間點)可以與來自所有其他選擇的運行的單曲線一起顯示。 對於單獨運行或對於步調一致的所有運行，時間點可以正向或反向的順序顯示。系統本文公開的其他實施方案涉及到被設計來運行分析、收集分析數據並分析本文涵 蓋的分析信息的系統。其他實施方案涉及評估、讀取、記錄和/或處理本文公開方法所提供 數據的系統。根據這些實施方案，可以是本文公開的系統的部分的裝置可以是反應室。一 個示例性反應室可以包括但不限於至少兩個電極(例如鉬電極，陰極和陽極)(901)，每一 個可操作連接到至少一個電極端子(902)。此外，每個電極位於反應室一端(例如頂部和底 部)的至少一個緩衝液貯器(903)中，其中每個緩衝液貯器具有至少一個橡膠墊片(例如 矽)(904)。根據可構成反應室的這些組件，反應室可以還包括一個或多個透析膜(905)(例 如在反應室的頂部和底部)、至少一個石英反應通道(906)、至少一個通道託架(907)和位 於至少一個緩衝液貯器與至少一個反應通道之間的至少兩個電壓傳送通道(908)。本文公開的其他實施方案包括一種裝置，所述裝置包括作為系統的部分的反應 室。本文涵蓋的系統可以包括但不限於電壓源、定位成與反應室(900)相互作用的雷射器 (例如，連續波雷射器)(1001)、從雷射器發射的雷射束(1002)、能夠指導反應室(900)內可 追蹤劑_靶分子複合物的偏轉雷射束的光束髮射的整形稜鏡(例如，雷射線束整形稜鏡) (1003)、反應通道(906)、光發射(例如發射的螢光)(1006)、與照相機(例如，電荷耦合器 件照相機)(1008)可操作連接的透鏡和過濾器(1007)以及任選地從系統接收數據的計算 機。在某些實施方案中，系統還可包括用於將樣品加載入反應室的加載設備(例如自動化 的加載設備)(1101)、能夠從一個反應室旋轉至下一個反應室的滾筒(1102)和置於滾筒周 圍的多個反應室(1103)。該系統的一個特徵是有能力使用可追蹤劑和檢測系統測量靶分子 的存在或不存在，其中靶分子的檢測或濃度測量可以在一小時或更短時間、45分鐘或更短 時間、30分鐘或更短時間、或者15分鐘或更短時間內評估。本文涵蓋的其他實施方案可以包括用於記錄、處理和顯示從本文公開的組合物和 方法獲得的數據的計算機和計算機軟體。在某些實施方案中，例如圖12所示的實施方案 中，示例性軟體的截屏可以包括照相機(1008)捕獲的圖像。本文涵蓋的軟體程序的進一步 實施方案可以允許選擇待分析的區域，例如進行條帶強度分析和/或評估靶分子複合物濃 度。根據這些實施方案，預期計算機軟體程序將允許評估和分析多個反應室實驗和多種樣 品的靶分子分析。如圖12所示，每次分析運行的右窗口參數(例如暴露時間、暴露間隔時 間、暴露次數)可以被設置，然後數據可以被顯示，允許在線分析數據。光的軸向傳遞本文涵蓋的一些實施方案涉及其中激發光可以包括軸向傳遞至反應室並且經反 應室壁進行檢測的系統或裝置。該技術相對於光經圓柱體或器皿壁的傳遞的一個優點在 於原始光源的完全強度可以傳遞貫穿圓柱體的完整長度。在某些實施方案中，如果光經圓 柱體壁傳遞，則光可能需要散布以有效覆蓋圓柱體長度，從而降低其強度。在其他實施方 案中，待傳遞的光(例如，雷射或其他相當的光)可能需要根據貫穿圓柱體平均強度分布 來校準。光可以從光源直接軸向瞄準穿過圓柱體，或者光源可以通過鏡子或稜鏡來導向。 任選地，如果光經圓柱體底部傳遞，則任選地，透明窗(例如藍寶石、石英、玻璃或光學透明 塑料)或等價物可能需要置於圓柱體的底部以允許光進入。在其他實施方案中，如果光經圓柱體頂部傳遞，則可能需要額外步驟以處理圓柱體頂部流體組分形成的彎液面的透鏡效應。示例性計算機系統概述本發明實施方案包括各種元素，其中許多可以由硬體組件執行或者可以機器可執 行指令實現，所述計算機可執行指令可用於使得編有所述指令的通用或專用處理器實現所 述元素(參見例如圖21)。可選地，步驟可以通過硬體、軟體和/或穩固件的組合來執行。 因此，圖20是實施方案可以利用的計算機系統2000的實例。根據一個示例性方法，計算機 系統包括總線2001、至少一個處理器2002、至少一個通信埠 2003和主存儲器2004。系統 2000還可以包括可移動存儲介質(未顯示)、只讀存儲器2005和/或大容量儲存器組件/ 設備2007。處理器2002可以是任何已知的處理器，包括但不限於Intel Itanium 或 Itanium 2 處理器、或AMD Opteron .或 Athlon MP 處理器、或Motorola 行處理 器。通信埠 2003可以用於基於數據機的撥號連接的任何RS-232埠、10/100以太 網埠或使用銅或光纖的千兆埠。通信埠 2003可以根據網絡選擇，所述網絡例如局域 網(LAN)、廣域網(WAN)或計算機系統2000連接的任何網絡。主存儲器2004可以是隨機存取存儲器(RAM)或者本領域公知的任何其他動態存 儲設備。只讀存儲器2005可以是任何靜態存儲設備，例如用於存儲靜態信息(例如處理器 2002的指令)的可編程只讀存儲器(PR0M)晶片。大容量儲存器2006可用於存儲信息和指令。例如，可以使用硬碟(諸如 Adaptec 系列的SCSI設備)、光碟、磁碟陣列(諸如RAID，諸如Adaptec系列RAID設備) 或任何其他大容量存儲設備。總線2001將處理器2002與其他存儲器、儲存器和通信塊通信偶聯。根據使用的 存儲設備，總線2001可以是基於PCI/PCI-X或SCSI的系統總線。可移動存儲介質可以是任何類型的外部硬碟、軟盤、IOMEGA Zip驅動器、只 讀存儲光碟(CD-ROM)、可重寫光碟(CD-RW)、只讀存儲數字視頻光碟(DVD-ROM)。顯示器(未 顯示)可以是可操作來提供參數模型的視覺展示(例如分析的實時運行顯示)並允許用戶 觀看、改變和根據本文實施方案與參數模型互動的任何設備，包括但不限於圖形網絡界面 和計算機監視器。上文描述的組件意為示例一些類型的可能性。前述實例絕不應該限制本發明範 圍，因為它們僅是示例性實施方案。在其他實施方案中，在樣品(例如，可能具有感興趣的靶分子)被製備並載入示例 性反應室後，接收操作2101接收來自結合的可追蹤劑_靶分子複合物或未結合的可追蹤 劑-靶分子複合物的發射數據。另一個接收操作2103接收數據並可以計算感興趣靶分子的 對照濃度的標準曲線。在一些實施方案2100中，每個接收操作可以使用所公布的方程的一 個或多個來計算樣品中靶分子的濃度。每個系統可被配置以基於操作員輸入來分析一種或 多種感興趣的靶分子。本文預期某些公開的方法和或裝置可簡單測量結合的可追蹤劑-靶 分子複合物而不是未結合的可追蹤劑_靶分子複合物。產生操作2103或2105基於接收的數據產生標準曲線或遷移率曲線。另一個產生 操作2107產生感興趣的靶分子(如果存在)的濃度曲線。本領域技術人員將容易理解如何能在產生操作2103和2105中產生標準曲線。推導操作2107推導樣品中存在的靶分子的量。一般，推導操作2107基於操作員 選擇的數據點或選擇的發射值產生代表樣品的模型數據。免疫分析以可靠方式測量蛋白質濃度的重要性已經導致開發了許多涉及抗體或抗體樣分 子的分析。Gosling(1990)深入描述了目前使用的許多免疫分析，通過引用併入本文。以下 描述使用抗體作為結合劑，但在許多情況下，Fab片段或適體可以替代使用。然而，本文描 述的方法和組合物不受此限制，並且在其他實施方案中，結合劑可以是例如生物受體。許多 這樣的受體(例如胰島素受體、胰島素樣生長因子1受體、乙醯膽鹼受體、GABA受體、血管 緊張素(antiotensin)受體、胰高血糖素受體、趨化因子受體、細胞因子受體、等等)是本領 域公知的，並且任何此類已知受體或其配體結合片段可用於實施要求保護的方法。檢測和/或確定濃度通常如下提供用信號部分(signal moiety)標記抗體或其 它結合分子，所述信號部分例如螢光、化學發光、放射性或本領域已知的其他標籤；使結合 分子與靶結合；並檢測或測量與結合的抗體關聯的發射、放射性等的量。在大多數情況下， 信號系統的選擇對於方法而言不是核心的。為螢光信號與抗體軛合的分子(例如FITC或 若丹明)可通常被例如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶的酶替代(如果需要比色分析)或者 被諸如碳酸酐酶或脲酶的酶替代(電導率分析)。然而，酶分析需要添加適當的底物。針對將信號分子直接軛合於結合靶蛋白的抗體(一級抗體)所普遍採用的可選方 法是採用與信號分子軛合的二級抗體。二級抗體是被開發以結合來自某些物種的所有抗體 的抗體(並因此必然來自不同的物種)。例如，抗體可以從已經注射了兔抗體的山羊獲得。 如果這些二級抗體與信號分子軛合，則二級抗體與一級抗體的結合提供信號分子與一級抗 體的連接而無化學軛合。該二級抗體可以用於連接信號分子與衍生自相同物種的任何一級 抗體，從而為分析增加一定的模塊性。異質性免疫分析在沒有規定結合發生的固相支持體類型下被描述。然而，使用的 固相支持體的類型代表任何免疫分析過程的顯著差異，影響不同步驟所需程序和時間並且 有時影響將要使用的檢測類型。例如，在其最常見形式中，夾心ELISA涉及將複合物結合至 微量滴定板中孔的底表面，這實現了容易手工引入洗滌試劑並容易讀取螢光或比色信號。 然而，分析可能由於質量轉移的限制而進行幾個小時。蛋白質需要時間在主體溶液和表面 停滯層(stagnant layer)之間平衡，並且通常需要多次洗滌。這些問題可以通過使用微珠 作為結合表面而在一定程度上得到緩解，所述微珠使表面與主體溶液更加緊密接觸並顯著 增加了每單位體積溶液可用於結合的表面積。然後，固相(珠上)與溶液相在洗滌過程中 經過濾或離心分離。可以通過使用順磁珠而使該過程更適於自動化，所述順磁珠容易與溶 液相磁分離。幾乎所有異質性免疫分析可以被調整以利用這些不同的表面。有兩種常見類型的用於檢測和/或確定樣品中分子濃度的免疫分析，其在某種程 度上與本文描述的方法相似。首先，就特異性而言，夾心ELISA被認為是免疫分析的金標 準。該高度特異性通過要求兩個單獨抗體與感興趣靶同時結合來實現，一種還用於下述方 法的技術。其次是親和探針毛細管電泳分析(APCE)。該分析由以下組成感興趣的靶與單 一一級抗體結合，然後經毛細管電泳設備運行混合物，以分離結合抗體與未結合抗體。電泳 分離允許整個分析在溶液中進行，一種也在下述方法中使用的技術。
試劑盒本文涵蓋用於進行本文方法的試劑盒。試劑盒可以包括但不限於實現所公開方法的一個或多個反應室組合物和用於產生反應室的容器。可選地，試劑盒可以除了樣品外僅 包括用於進行所公開的分析的試劑。夾心ELISA夾心酶聯免疫吸附分析(ELISA)早先被開發並已被認為是蛋白質檢測的金標準，表現出非常高的特異性和精確性作為其主要優點。一些缺點是檢測蛋白所需時間和需要大 量步驟。根據洗滌的嚴格性和次數以及孵育步驟的時長，Elisa通常進行2至6小時。Elisa的第一步是使靶蛋白的一級抗體與孔底表面結合，所述表面已經被預處理 以增加蛋白質結合。所述表面然後用封閉劑例如牛血清白蛋白(BSA)處理以封閉任何剩餘 活性位點，從而防止任何其他蛋白質結合和影響測試的特異性。孔被洗滌多次以去除游離 抗體和封閉劑。推測含有靶蛋白的樣品被加入孔並孵育預定時間。理想地，僅該靶蛋白會結合至 表面抗體，並且沒有其他蛋白會結合至封閉表面或結合至表面抗體。進行多次洗滌以去除 任何非特異性結合的蛋白質。如果有任何非特異性蛋白質確實結合了，則下一步使它們的 作用最小化。與檢測分子軛合的靶蛋白的二級抗體被加入孔並允許結合。因為該抗體的特異 性，其很少結合與表面或第一抗體非特異性結合的任何蛋白。進行多次洗滌以去除任何未 結合的第二抗體。因為該第二抗體與檢測分子軛合，該第二抗體的濃度可以被確定並與原 始樣品中靶蛋白的濃度相關聯。親和探針毛細管電泳(APCE)毛細管電泳涉及藉助帶正電和帶負電的電極在填充有離子緩衝液的長毛細管的 兩端施加電壓，從而導致帶電分子向一個電極或另一個電極遷移。一個常見的伴隨現象被 稱為「電滲流」。玻璃毛細管往往具有帶負電的表面，其與溶液中接近表面的帶正電的離子 結合。這些帶正電的離子向負電極(陰極)遷移，隨其拖帶主體溶液。該電滲流導致所有 離子向陰極遷移(儘管以不同速率)，並且因為單一檢測器可以分析所有離子物類，而不論 它們流過時的電荷。電滲流可以通過改變毛細管壁的電特徵而被消除或甚至逆轉。對於APCE，靶分子與已經軛合至檢測分子(通常為螢光探針)的同源抗體一起孵 育。然後將混合物注射入毛細管並施加電壓，建立電滲流。游離靶、游離抗體和靶/抗體復 合物將以不同速率遷移(被電滲流放大)，並可以因此通過螢光檢測器檢測為單獨的峰(遊 離靶不應該產生信號)。儘管毛細管電泳比ELISA分析更快速，但可以分析的樣品的小體積 (由於毛細管的小尺寸)限制了該方法檢測樣品中極低濃度存在的蛋白質或其它靶分子的 靈敏度。用於靶分子檢測和定量的增強速度的電免疫分析(EVEIA)本文實施方案提供檢測和確定樣品中靶分子存在或不存在和/或濃度的快速、高 靈敏度方法，該方法涉及垂直堆積的電泳。因為EVEIA技術的電泳部分發生在體積和橫截 面積比毛細管大得多的容器中，這些實施方案已經實現樣品中低濃度存在的靶分子的檢測 方法。這裡，電泳可以發生在流體動力學半徑(橫截面積除以周長再乘以2)為0.5mm或更 大的管、通道或其他容器中。在一些實施方案中，示例性管內部體積為單位長度管2mm3或更大。在其他實施方案中，最小流體動力學半徑可以是橫截面積除以周長再乘以2，為0. 5mm 或更大。例如，約0.75mm的流體動力學半徑提供2mm3/mm長度。對於圓管，流體動力學半 徑可以與半徑相同。該實施方案可用於示例說明經不規則形狀通道的流動。在本文公開的其他實施方案中，基本不帶電的聚合物劑可以包括以下的一種或多 種線性聚丙烯醯胺、部分交聯的聚丙烯醯胺(例如，在組合物保持為流體或液體的固體 凝膠形成點之下交聯)葡聚糖或聚乙二醇或其他類似物質或物質組合。在其他實施方案 中，基本不帶電的聚合物劑在本文公開的條件下很少遷移，例如這些物質可以在施加電力 lOOv/cm下遷移約0. 1至約1. 0mm/seco在某些實施方案中，管、通道或容器內增加的密度 梯度可以是1. 0至1. lg/ml。在其他實施方案中，所述梯度可以包括但不限於密度1. 0至 1. 02g/ml的樣品層、密度1. 002至1. 05g/ml的捕獲層和密度1. 01至1. lg/ml的堆積層。 在本文涵蓋的所有實施方案中，堆積層具有比捕獲層更高的密度，並且捕獲層具有比樣品 層更高的密度。任選地，粘度也可以從頂部到底部增加，以在界面產生堆積效應。在某些實 施方案中，粘度可以是1釐泊但不超過1. 3。在其他實施方案中，2釐泊可以是底層粘度的 最大上限值。在本文某些方面中，質荷比在公開的複合物形成時增加，導致靶分子電泳遷移 率的降低。因為複合物含有非常高的質荷比，其在堆積層變得基本不動，而未結合組分遷移 經過堆積層並與複合物分離。這可以提供能夠短時間檢測非常低的靶分子濃度的非常快速 且靈敏的分析。在一些實施方案中，本文公開方法可以由以下組成1.獲得感興趣靶分子的第一結合劑並使可追蹤劑或可跟蹤劑與靶分子的一些以 不幹擾感興趣靶分子特異性結合的方式軛合(但不與其他靶分子軛合)。在某些實施方案 中，第一結合劑可以是單克隆抗體、抗體片段(例如Fab)、適體或表現出與感興趣靶特異性 結合的任何其他分子或分子複合物。感興趣的靶可以是蛋白質、肽、蛋白複合物或可溶於水 溶液的任何分子。可追蹤劑或可跟蹤劑可以是螢光分子、放射性標記物、產生比色產物的 酶、金屬離子、產生可電檢測產物的酶、或可容易直接或間接檢測和定量的任何分子或分子 複合物。2.獲得感興趣的靶分子的第二結合劑並使捕獲劑與其以不幹擾感興趣的靶的 特異性結合的方式軛合。該第二結合劑可以是單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如 Fab)、適體或表現出與感興趣靶特異性結合的任何其他分子或分子複合物。捕獲劑可以是 生物素、鏈黴抗生物素蛋白、單鏈核酸或能夠高特異性和親和力結合的任何其他分子或分 子複合物。在某些實施方案中，第二結合劑是多克隆抗體，捕獲劑是與中性抗生物素蛋白復 合的生物素。3.獲得推測含有一定量的所述感興趣的靶的樣品，所述量希望被確定。4.準備由導電水溶液堆積的層組成的垂直電泳室，一些層含有不帶電的聚合物， 這些層以從頂部到底部增加的密度或粘度布置以抑制混合。最頂層由待測量樣品組成(「 樣品層")。例如，頂層可以具有lg/ml的密度，這些層中每個隨後層的密度增加約0.2至 5%，並且進展為與樣品層的密度或粘度相比密度或粘度約0. 5%、或2%或10%的密度或 粘度增加。樣品層之下的層中的至少一個將含有與捕獲劑的同源結合劑軛合的聚合物(「 捕獲層")。任選地，捕獲層之下的層中的至少一個將含有相對高濃度的不帶電的聚合物， 該聚合物用於阻礙與聚合物結合的複合物的遷移率(「堆積層")。不帶電的聚合物的濃度可以是約0. 5%至20%重量/體積。5.將所述第一結合劑、所述第二結合劑和所述感興趣的靶一起混合併孵育以允許 形成三元複合物，該三元複合物由與信號劑(signalingagent)軛合的第一結合劑組成，所 述信號劑結合至感興趣的靶，所述感興趣的靶與第二結合劑結合，所述第二結合劑與捕獲 劑軛合。6.從一電源(例如，能夠產生10-1，OOOv/cm的電源)在含有混合物的電泳室的垂 直距離兩端施加電勢。因此，靶分子遷移進入捕獲層，其中複合物將結合與捕獲劑同源物軛 合的聚合物，顯著降低這些複合物的遷移率。7.持續施加電勢，從而實現與聚合物結合的低遷移率複合物與所有其他分子分 離，因此在時間和空間上從所有其他信號劑集中與感興趣的靶締合的信號劑。8.任選地，持續施加電勢，從而使所有靶分子遷移進入其中複合物的遷移率被進 一步降低的堆積層，導致含有這些複合物的條帶壓縮，並實現與聚合物結合的低遷移率復 合物與所有其他分子的進一步分離。9.測量這些所述化合物組的一個或多個中的信號劑，從而確定所述樣品中所述感 興趣的靶的量。
實施例下述實施例被包括以說明本文提出的某些實施方案。本領域技術人員應該理解， 隨後實施例中公開的技術代表在本文公開的實施中作用良好的公開的技術，並因此被認為 構成其實施的優選方式。然而，根據本公開內容，本領域技術人員應該理解，可以對公開的 具體實施方案進行許多改變並依然獲得類似或相似的結果而不背離本文精神和範圍。實施例1在某些實施方案中，本文的組合物和方法涉及測量推測含有靶分子的樣品中靶分 子濃度的組合物和方法。例如，下文可包括下述步驟的全部或一些獲得感興趣的靶分子並將可追蹤分子以不幹擾下述結合劑特異性結合的方式軛 合至所述靶分子。本文涵蓋的靶分子可以是蛋白質、肽、蛋白質複合物或水溶液中可溶的任 何其他分子。本文涵蓋的可追蹤分子可以是螢光分子、放射標記物、產生信號(例如比色產 物或發光產物)的酶、產生可電檢測產物的酶、或可容易直接或間接檢測和定量的任何分 子或分子複合物。一個示例性方法描述於示例性圖1，靶分子是運鐵蛋白，並且可追蹤分子 是螢光素。獲得能夠結合靶分子的結合劑，並將捕獲劑以不幹擾與靶分子特異性結合的方式 軛合至靶分子。在某些實施方案中，結合劑可以是抗體、抗體片段(例如Fab)、適體或能夠 特異性結合靶分子的任何其他分子或分子複合物。在各種實施方案中，捕獲劑可以是生物 素、寡核苷酸引物或表現出與同源分子穩定、高親和力結合的任何分子。一個示例性方法可 以描述於圖2，結合劑是抗體，並且捕獲劑是生物素-中性抗生物素蛋白複合物。獲得推測含有靶分子的樣品並確定靶分子的存在和/或濃度。在一個示例性方法 中，準備了垂直電泳室。根據該方法，室可以由導電水溶液的堆積的層組成。這些層中一些 含有不帶電的聚合物。在某些實施方案中，這些層可以布置為從頂部到底部具有增加的密 度或粘度以減少層的混合。在該實施例中，最頂層由待測量樣品組成(「樣品層")。樣品層以下的層中至少一個層可含有與捕獲劑的同源結合劑軛合的聚合物(「捕獲層")。任 選地，捕獲層以下的層中至少一個層將含有相對高濃度的不帶電的聚合物。在某些實施方 案中，不帶電的聚合物可以添加至一層或多層，實現不帶電的聚合物與靶分子或靶分子復 合物結合，與不帶電的聚合物的締合可用於阻礙與聚合物結合的複合物的遷移率(「堆積 層〃)。下述步驟代表用於製備可能含有靶分子的樣品並分析樣品中靶分子的存在和/ 或濃度的示例性方法和組合物。例如，第一步可包括將結合劑、可追蹤劑-靶分子和感興趣 的靶分子(作為待分析樣品的組分)一起混合併孵育以允許形成複合物。將這些組分混合 可產生包括結合劑的複合物，所述結合劑與樣品中可追蹤劑-靶分子或未標記的靶結合。 在其中結合劑是多價的情況下，結合劑可以結合至可追蹤劑-靶分子或未標記的靶之一或 兩者。這描述於圖3。在可選實施方案中，結合劑、可追蹤劑_靶分子、感興趣的靶分子(作為待分析樣 品的組分)與所述捕獲層的組分可以一起混合併孵育，以允許形成複合物，所述複合物由 與樣品中所述標記的靶或所述未標記的靶結合的所述結合劑組成，所述結合劑還經由聚合 物締合的捕獲劑的同源結合劑結合至所述聚合物。然後，可以在含有混合物的電泳室的兩端施加電勢以分離複合物與未結合的可追 蹤劑_靶分子，因此在時間和空間上集中這些不同的含有可追蹤劑的化合物組。在一個實 施方案中，複合物將集中在捕獲層和堆積層的界面。測量與一個或多個複合物締合的或未結合的可追蹤劑-靶分子。在某些實施方案 中，樣品中靶分子的存在和/或濃度可以通過應用標準競爭性分析動力學來測量。在一個 實施方案中，可以進行靶分子濃度的分析確定。例如，來自其中預期複合物佔優勢的電泳室 的一個或多個區域的總體信號可以與來自其中預期未結合可追蹤劑-靶分子佔優勢的電 泳室的區域的總體信號相比較。這樣的比較可以提供信號數據的標準化，因此導致對樣品 中靶分子濃度的更準確確定。實施例2:靶和IgG-靶_捕獲聚合物複合物的具體遷移率的計算在一個示例性方法中，在之前研究中發現示例性靶蛋白(運鐵蛋白)的電泳遷移 率為約9X10_5cm2/s V。根據方程3C和5並使用80千道爾頓的分子量，可以計算每個運鐵 蛋白分子的大約帶電荷為_3。IgG具有大約150千道爾頓的分子量。因為分子的可變區，電荷範圍可以是負至略正。該實施例中使用的電荷的一個估 計值為-5。在一個實施例中，線性聚丙烯醯胺(LPA)分子可以被使用並與多個生物素分 子軛合。在多價中性抗生物素蛋白存在下，聚合物網絡包括通過生物素_中性抗生物素蛋 白_生物素鍵合形式交聯結合的LPA分子，並且這些網絡的分子量可以達到數百萬道爾頓。 由此形成的網絡的分子量在本實施例中被認為是107道爾頓。根據方程2C，遷移率與分子 量的立方根成反比。根據方程5，電泳遷移率與電荷成正比。儘管忽略諸如蛋白質和LPA之間密度差 異和LPA水合狀態等事實，LPA網絡分子量的不確定性超過了這些其他影響，因此對於大致 估計的目的而言，這些影響在本示例性方法中將不被考慮。基於游離運鐵蛋白的電泳遷移 率，運鐵蛋白-抗體-LPA網絡複合物的電泳遷移率可由以下表示u= (9X10_5) ((-3+-5)/(-3)) (80/(80+150+10, 000)1/3 = 2Xl(T5cm2/sV。未結合的運鐵蛋白比運鐵蛋白-抗體-LPA網絡複合物移動快4至5倍。在某些 實施例中，該差異可以是比這大的數量級。在一個示例性實施方案中，使用毛細管電泳電壓可以高達500V/cm。一個限制是由 於熱產生，熱產生與施加電壓的平方成正比。根據該示例性方法，通過施加lOOV/cm，游離分 子以大約0. 5cm/min向陽極(正電極)遷移，而完整複合的運鐵蛋白以0. lcm/min沿相同 方向移動，允許游離靶分子與那些複合的靶分子明顯分離。實施例3 在一個示例性方法中，感興趣的靶分子是蛋白質運鐵蛋白。為了測試本文公開的 某些實施方案，特異性結合人運鐵蛋白的抗體被獲得並軛合至多價劑生物素。然後純化抗 運鐵蛋白抗體-生物素複合物。接下來，純化的人運鐵蛋白使用普遍可用的技術用螢光素 共價標記，所述技術還允許抗運鐵蛋白抗體(例如兔衍生抗體)的特異性結合。螢光素連接 的運鐵蛋白和生物素軛合的抗體與過量中性抗生物素蛋白和推測含有濃度約50pM的未標 記運鐵蛋白的樣品混合。最終混合物具有100pM與生物素軛合的抗運鐵蛋白抗體和100pM 螢光素連接的運鐵蛋白。該混合物在37°C下孵育5分鐘。樣品/抗體/標記的靶混合物被注射進入電泳池，施加lOOV/cm的電勢5分鐘。例 如，參見圖6A-6D。捕獲層中的螢光信號可以例如使用螢光檢測器測量。任選地，捕獲層外 區域的螢光信號可以被測量，代表部分由於樣品中存在未標記的運鐵蛋白而未與抗體結合 的螢光素連接的運鐵蛋白。這兩種信號的比較允許更準確估計樣品中的靶濃度。在另一實 施例中，這些步驟可以使用推測含有多種濃度的靶分子(例如100pM靶分子、200pM靶分子 或無靶分子)的樣品來重複。數據可以制表並繪圖，如示例性圖8所述利用與靶濃度成反 比的信號。此外，含有未知量的靶分子(例如運鐵蛋白)的樣品可以按照上述方案來分析。 使用該實施例，可以從已知運鐵蛋白濃度分析數據構建的圖(例如，圖8所示"標準濃度曲 線"圖)外推確認運鐵蛋白濃度。實施例4 在一個示例性方法中，來自概念驗證實驗的數據示於圖7A-7C。如圖7A-7C所示， 中性抗生物素蛋白用於說明三層設計如何起作用來捕獲希望的靶分子並將這些靶聚集成 條帶以檢測。準備該分析的電泳池，由三層組成底(〃堆積")層中是tris-乙酸緩衝液 和7. 5%甘油中的線性聚丙烯醯胺；中(〃捕獲")層中是tris-乙酸緩衝液和4%甘油中 的生物素化葡聚糖；和頂(「樣品")層中是tris-乙酸緩衝液中FITC-標記的中性抗生 物素蛋白。在對照運行中，捕獲層沒有生物素化的葡聚糖。樣品層在檢測窗口外集中，在這 些曲線的右側。當向池施加電壓時，中性抗生物素蛋白遷移(向左)入捕獲層，其在那裡結 合生物素化的聚合物，顯著降低其遷移率。當中性抗生物素蛋白-聚合物複合物到達堆積 層時，線性聚丙烯醯胺的存在將複合的中性抗生物素蛋白的前進速度變慢，幾乎到靜止，聚 集條帶。對照運行中的游離中性抗生物素蛋白自由移動通過捕獲層和堆積層。根據本公開內容可以製成並實施本文公開和要求保護的所有組合物和/或方法 和/或裝置，而無需過度實驗。雖然已經就優選實施方案描述了本發明的組合物和方法，但 對於本領域技術人員明顯的是可以對本文描述的組合物和/或方法和/或裝置以及方法 中的步驟或步驟的順序進行改變，而不背離本發明的概念、精神和範圍。更具體說，明顯的是，在化學上和生理上相關的某些物質可以替代本文描述的物質，同時獲得相同或類似的 結果。對於本領域技術人員明顯的所有這樣類似的替代物和修飾被認為在所附權利要求限 定的本發明精神、範圍和概念內。
權利要求
一種組合物，用於分離樣品中的靶分子，所述組合物包括從頂部到底部密度增加或粘度增加的垂直放置的兩個或更多個相，其中所述兩個或更多個相的一個或更多個相含有一種或更多種基本不帶電的聚合物劑，其中所述基本不帶電的聚合物劑能夠與經所述含有所述一種或更多種基本不帶電的聚合物劑的相電泳的結合劑締合，並且其中所述基本不帶電的聚合物劑能夠與捕獲分子締合。
2.如權利要求1所述的組合物，其中所述結合劑能夠與靶分子締合。
3.如權利要求1所述的組合物，其中所述結合劑與靶分子締合形成第一複合物，並且 所述基本不帶電的聚合物劑與所述第一複合物的結合劑締合形成第二複合物。
4.如權利要求1所述的組合物，其中一個或更多個相在靶分子向底部遷移時逐漸降低 所述靶分子的遷移率。
5.如權利要求1所述的組合物，其中一個或更多個相完全抑制靶分子或靶分子複合物 的遷移率。
6.如權利要求1所述的組合物，其中所述靶分子包括蛋白質或肽。
7.如權利要求1所述的組合物，其中所述基本不帶電的聚合物劑選自線性聚丙烯醯 胺、部分交聯聚丙烯醯胺、葡聚糖、聚乙二醇或其組合的一種或多種。
8.如權利要求1所述的組合物，其中所述相具有從頂部到底部粘度增加的梯度，並且 包括樣品層、捕獲層和堆積層。
9. 一種用於確定樣品中靶分子的方法，所述方法包括 獲得可能含有靶分子的第一樣品；使所述第一樣品暴露於結合劑，其中所述結合劑能夠結合所述靶分子而形成靶分 子_結合劑複合物；將所述靶分子_結合劑複合物與未結合的靶分子混合而製成混合物； 將所述混合物經受垂直堆積的電泳基質，其中所述基質由從頂部到底部密度增加或粘 度增加的兩個或更多個相組成，並且其中所述基質的一個或更多個相具有不帶電的聚合物 (P)，所述不帶電的聚合物(P)能夠與經含有所述聚合物的相電泳的結合劑締合；和 檢測所述靶分子-結合劑複合物的存在。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述垂直堆積的電泳基質包括器皿中垂直堆積的 電泳基質。
11.如權利要求9所述的方法，其中所述結合劑包括可捕獲結合劑。
12.如權利要求9所述的方法，其中所述結合劑包括下述一種或多種能夠結合所述靶 分子的可捕獲抗體、能夠結合所述靶分子的抗體的抗原結合片段、所述靶分子的生物受體、 所述靶分子的生物受體的片段、多價生物素結合劑、標記的結合劑或生物素連接的不帶電 的聚合物。
13.如權利要求9所述的方法，其中相對於未結合的靶分子測量與結合劑締合的靶分子。
14.如權利要求13所述的方法，其中與結合劑締合的靶分子與未結合的靶分子電泳分離。
15.如權利要求9所述的方法，其中所述靶分子是蛋白質或肽。
16.如權利要求9所述的方法，其中所述電泳在最小流體動力學半徑為0. 5mm的器皿中進行，所述流體動力學半徑等於橫截面積除以周長再乘以2。
17.如權利要求9所述的方法，其中所述樣品加載入管、通道或容器，並且所述電泳在 所述管、通道或容器中從頂部到底部密度增加和/或粘度增加的梯度中進行，所述梯度包 括密度或粘度增加的至少三個相。
18.如權利要求9所述的方法，其中測量與所述未結合的靶分子有關的可追蹤劑被用 來確定所述樣品中所述靶分子的濃度。
19.如權利要求9所述的方法，其中測量可追蹤劑-靶分子複合物和未結合的靶分子提 供與所述靶分子的濃度成正比和成反比的信號。
20.如權利要求9所述的方法，其中可追蹤劑是螢光的、發光的、化學發光的、放射性核 素、金屬離子或產生螢光產物、發光產物、化學發光產物或有色產物的酶。
21.一種用於檢測靶分子的裝置，所述裝置包括a)流體動力學半徑為至少0.5mm的垂直布置的器皿；b)所述器皿內從1.0至1. lg/ml密度增加的梯度，所述梯度包括密度1. 0至1. 02g/ml 的樣品層、密度1. 002至1. 05g/ml的捕獲層和密度1. 01至1. lg/ml的堆積層，其中所述堆 積層具有比所述捕獲層更高的密度，並且所述捕獲層具有比所述樣品層更高的密度。
22.如權利要求21所述的裝置，所述裝置還包括i)與可追蹤劑軛合的靶分子和未結合的靶分子； )與捕獲分子軛合的第二結合分子，其中所述靶分子、所述未結合的靶分子、第一和 第二結合分子能夠在所述樣品層形成複合物；和iii)在所述樣品層、所述堆積層和所述捕獲層的至少一層中基本不帶電的聚合物，其 中所述基本不帶電的聚合物能夠結合所述捕獲分子以變成所述複合物的部分。
23.一種計算機可讀介質，所述計算機可讀介質具有計算機可讀指令，所述計算機可讀 指令在被計算機執行時導致所述計算機運行包括下述的方法接收表示條帶的發射的第一數據，其中所述條帶包括樣品中的可追蹤劑-靶分子複合物；接收表示未結合靶分子水平的第二數據；以及比較所述第一數據與所述第二數據以評估所述樣品中所述靶分子的存在。
24.如權利要求23所述的計算機可讀介質，還包括評估所述樣品中所述靶分子存在的 濃度。
25.如權利要求23所述的計算機可讀介質，其中比較所述第一數據與所述第二數據包 括確定所述第一數據與所述第二數據的比率。
26.如權利要求23所述的計算機可讀介質，其中比較包括為樣品中可能感興趣的每種 靶分子產生標準曲線。
27.如權利要求26所述的計算機可讀介質，其中比較還包括比較由結合的靶分子提供 的直接發射強度，與未結合的靶分子濃度的反向比較。
28.如權利要求23所述的計算機可讀介質，其中比較所述第一數據與所述第二數據以 評估受治療者中靶分子的存在、不存在或濃度包括確定來自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發射開始的時間；確定來自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發射結束的時間；確定來自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發射開始的發射強度； 確定來自感興趣的靶分子的感興趣的條帶中發射結束的發射強度； 對於每種靶分子分析上述強度和時間的範圍；評估通過分析所述靶分子的強度和時間而提供的信息，並分析所述信息；和 基於所獲得的並經分析的數據提供的信息來評估受治療者的健康、物質的存在或樣品 的汙染。
29.如權利要求21所述的裝置，所述裝置還包括 分離樣品的工具，所述樣品包含可追蹤劑_靶分子複合物； 適於捕獲來自所述可追蹤劑_靶分子複合物的發射的讀取器； 適於記錄來自所述可追蹤劑_靶分子複合物的發射的照相機； 適於接收來自所述裝置的數據的計算機；和適於分析所述計算機從所述可追蹤劑_靶分子複合物接收的數據的電腦程式。
30.一種試劑盒，該試劑盒包括包括密度增加或粘度增加的至少三層的裝置；和 與所述層的至少一個締合的基本不帶電的聚合物。
31.如權利要求31所述的試劑盒，所述試劑盒還包括感興趣靶分子的至少一個陽性對 照樣品。
全文摘要
本文實施方案涉及用於檢測和/或確定樣品中靶分子的存在和/或濃度的系統、方法、組合物和裝置。在某些實施方案中，可以使用非凝膠電泳技術分離和分析靶分子。
文檔編號C12Q1/68GK101809166SQ200880106265
公開日2010年8月18日 申請日期2008年9月10日 優先權日2007年9月10日
發明者史蒂文·派屈克·泰瑞爾, 巴裡·范特-赫爾 申請人:萊澤爾診斷公司