通過抑制利於軟骨形成的分子來治療肌腱病變的製作方法

2023-09-13 16:54:25 2

專利名稱：通過抑制利於軟骨形成的分子來治療肌腱病變的製作方法
技術領域：
本發明的技術領域涉及通過降低受損腱中的軟骨和/或纖維軟骨產生 來治療肌腱病變。本發明進一步涉及抑制與在受損腱中軟骨和/或纖維軟骨 產生相關的分子。
背景技術：
肌腱病變為用來描述多種類型的腱病症的通常術語。術語"腱炎"(表 示"腱的炎症")通常用來描述腱的問題，但炎症很少是腱疼痛的原因。最 通常地，腱疼痛實際上是腱中或周圍的結締組織中 一 系列微撕裂的症狀， 更加適當地稱為肌腱變性(tendinosis)。其它的腱病症包括起因於伴隨纖維 定向障礙的膠原變性的鍵疼痛、腱中的類黏蛋白基質增加、鈣化、腱過度 使用、血管化、老化、以M對身體突起的摩擦。越來越多數量的腱專家 使用肌腱病變來描述這些病症，通常共同表徵為腱炎、肌腱變性 (tendinosis)、腱圍炎(paratendinitis)、腱鞘炎(tenosynovitis)、 paratenonitis、腱過度使用損傷、以及創傷。Khan等人,S/7or傷Af^/ 27:393-408 (1999).
正常的腱組織包含緊密填充的結締組織，其具有規則排列的膠原纖維 束，所述的膠原纖維以相同方向運行在初級、二級和三級、具有高抗張強 度的纖維束中。扁平、錐形的腱細胞(tenocyte)分散在這些纖維中，這些腱細胞合成富含I型膠原的勦性細胞外基質(ECM) 。 I型膠原束為腱提 供彈性和結構支持。在健康的腱中，在ECM合成和降解之間存在動態平 衡。然而，肌腱病變負面地影響這種平衡，並導致膠原纖維結構重排和解 體。膠原束的解體導致腱出現軟骨。在肌腱病變組織中清楚地觀察到ECM 中成纖維細胞、肌成纖維細胞、新血管形成以及糖胺聚糖(GAG)的病理學 聚集。Tallon等人，M^/5WS/^rtoExe/T 33(12):1983-90 (2001); Khan等人， S/7^feAT^/27(6):393-408 (1999)。受損腱中代謝和形態上的變化導致疼痛 和對撕裂與破裂的易感。
目前，認為受損腱ECM的降解和重塑由從定居結締組織細胞和侵入 性炎症細胞釋放的金屬蛋白酶引起，其中所述的金屬蛋白酶能夠降解基質 大分子例如聚集蛋白聚糖、飾膠蛋白聚糖和^鏈蛋白聚糖。這些金屬蛋 白酶包括MMP(MatrixMetalIoproteinases，基質金屬蛋白酶)、ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase，解聯蛋白和金屬蛋白酶)和ADAMT(A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs, 具有血 小板反應蛋白基序的解聯蛋白和金屬蛋白酶，例如聚集蛋白聚糖酶)。Riley G.， Ex/7eW/^v Mo/Af^/ 7(5):l-23 (2005); Rees等人，B/oc/ie附/ 350:180-188(2000)。然而，MMP的廣譜抑制劑在治療與肌腱病變具有病 理相似性的骨關節炎的臨床試驗上是不成功的。Clark等人，五xpeW 0/7& 77iw7Wgeto 7(1): 19-34 (2003)。因此，抑制金屬蛋白酶不大可能有效地治 療肌腱病變。事實上，在高度受力的腱例如岡上肌腱和跟腱中需要最小水 平的金屬蛋白酶活性來提供具有適當水平的ECM的腱。Riley G.， Ex/^" 細脅/臉"7(5): 1-23 (2005)。
目前，存在多種標準的非手術性和手術性肌腱病變治療。非手術性方 法包括休息、冷療法、活性修正、物理療法、非類固醇類抗炎藥物(NSAID )、 和皮質類固醇。休息和活性修正可以幫助患一些這種病症的患者，但還存 在大量不能用這些療法治療的臨M體。儘管廣泛使用，但經口的抗炎藥 物療法尚未在控制的研究中證實有用，並且具有不希望的副作用。 一些研究進一步表明，事實上，非類固醇類藥物療法對康復過程具有副作用，這 是因為其通過減輕疼痛而使患者忽視肌腱病變的早期症狀。
皮質類固醇通常用於降低組織中的炎症，但不建議使用此類藥物治療 肌腱病變，特別是因為皮質類固醇抑制膠原的合成。 一些研究在用可的松 治療的患者中觀察到短期的改善，但跟蹤患者超過1年的研究顯示高的症 狀復發率和不確定的有效率。可的松注射也具有腱破裂、感染、皮膚脫色 和皮下萎縮的風險。在糖尿病患者中，注射可能導致高血糖。
腱修復的外科方法包括清創術和受損腱的修復。然而，開放或關節鏡 外科手術具有許多潛在的併發症，例如深度感染、損傷神經血管結構、以 及形成傷疤。外科手術也很昂貴，並且具有伴隨局部或全身麻醉的額外風 險。
因此，仍然存在對治療腱相關損傷、優於現有療法的方法的需求。柔 韌腱組織的損傷或其它損害痊癒慢，並且需要數月或者甚至數年才能完全 恢復。腱相關損傷對社會具有顯著影響。在美國，過度^f吏用損傷佔全部損
失相關的機構出診的將近7%。 Woodwell等人，Adv Data 346:1-44 (2004)。 基於美國勞工部4亍業就業統計部門(U.S. Department of Labor, Bureau of Labor Statistics)數據的信息，此類損傷導致工作時間顯著損失(見 http:〃www.bls.gov/lif)。
發明概述
本發明提供新的治療肌腱病變的方法。通過對過度使用的大鼠腱進行 轉錄概況分析，現在已經發現，軟骨特異的基因例如聚集蛋白聚糖、多功 能蛋白聚糖、Col2al (1I型膠原)和Sox9的表達水平在受損的腱中增加。這 些結果表明受損的腱組織由於過度使用而轉變為纖維軟骨。與主要包含I 型膠原的腱不同，纖維軟骨含有II型膠原和大的蛋白聚糖，例如聚集蛋白 聚糖和多功能蛋白聚糖。腱中軟骨和纖維軟骨的形成對於腱修復是有害的， 因為軟骨組織破壞了緊密填充的腱I型膠原纖維。這種破壞降低了腱的抗 張強度和彈性。因此，本發明提供通過降低患者腱組織中軟骨特異性蛋白聚糖的形成 來在患者中治療肌腱病變的方法。本發明也提供減少軟骨特異性蛋白聚糖 形成的化合物在製備治療肌腱病變的藥物中的用途。
在一些實施方案中，這些方法和用途包括降低涉及在患者腱組織中合 成聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖的酶的活性。在特定實施方案中，這
些方法和用途包括在患者腱組織中降低硫酸軟骨素N-乙醯氨基半乳糖基 轉移酶1(CS-GalNAcT-l)和/或半乳糖胺多肽N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶 l(GalNT-l)的活性。在其它實施方案中，這些方法和用途包括降低一種或 多種涉及軟骨蛋白聚糖合成的其它酶的活性，其中所述的酶包括但不限於 UDP-D-木糖:核心蛋白質p-D-木糖基轉移酶、Gal轉移酶、GlcA轉移酶、 GlcNAc轉移酶、磺基轉移酶、硫酸軟骨素合酶和硫酸乙醯肝素磺基轉移 酶。
涉及產生軟骨結構蛋白質的酶和其它蛋白質的活性可以通過直接或間 接地抑制酶或其它蛋白質的功能來降低，或者通過抑制酶或其它蛋白質自 身的表達來降低。
本發明也提供通過降低患者腱組織中軟骨特異性結構蛋白質的表達來 治療患者的肌腱病變的方法。本發明進一步提供降低軟骨特異性結構蛋白 質表達的化合物在製備治療肌腱病變的藥物中的用途。在一些實施方案中， 軟骨特異性結構蛋白質例如但不限於聚集蛋白聚糖、多配體蛋白聚糖 3(syn-3)、多功能蛋白聚糖以及II型膠原的表達受到直接抑制。在其它實施 方案中，降低了涉及軟骨特異性基因表達的轉錄因子的活性。這些轉錄因 子和信號轉導蛋白質包括例如Sox9。
在其它實施方案中，本發明包括鑑定治療肌腱病變的化合物的方法， 其中包括向需要治療的受試者施用測試化合物、並檢測該物質抑制涉A^ 組織中糖胺聚糖(glycoglycosaminoglycan)—(GAG)合成的酶的活性的能力。
在一些實施方案中，鑑定治療肌腱病變的化合物或者評估治療的方法 包括(l)提供至少一種選自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、石克酸乙醯肝 素(葡糖胺)3-0-磺基轉移酶1(Hs3stl)、 GalNT-l和Sox9的樣品成分；(2)將樣品與測試化合物組合；(3)測量樣品成分應答測試化合物的活性；以及 (4)確定測試化合物是否抑制樣品成分的活性。
本發明額外的目的和優點將部分在下文的描述中給出，並且部分在描 述中顯而易見，或者可以通過實施本發明而學習到。本發明的目的和優點 通過下文的詳細描述和所附權利要求書中特別指出的成分及組合來實現和 獲得。
應當理解，上述一般描述和下文的詳細描述僅為範例和解釋性的，並 不限制所述本發明。
摻入和構成本說明書一部分的附圖顯示了本發明的一些實施方案，並
和描述一^L解釋本發明原理的作用。
附圖簡述
在圖l-7中，SST代表岡上肌腱；PT代表膝腱未損傷的內參；R代表 進行了過度使用步驟(Soslowsky等人，J. Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000))的動物；C代表未進行過度使用步驟的對照動物；時間過程是l、 2 和4周；並且BM代表骨髓。


圖1顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因晶片、在過度使用的腱(圖 1A)中Col2al (1I型膠原)4周的基因表達譜。如圖(圖1B)所示，也測定了正 常肌骨胳組織中Col2al基因的表達水平。表達譜表明，與正常腱組織相比， Col2al在軟骨組織和過度使用的腱組織中都高度表達。
圖2顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因晶片、在過度使用的腱(圖 2A)中Agcl(聚集蛋白聚糖)4周的基因表達譜。如圖(圖2B)所示，也測定 了正常肌骨胳組織中Agcl基因的表達水平。表達譜表明，與正常腱組織 相比，Agcl在軟骨組織和過度使用的腱組織中都高度表達。
圖3顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因晶片、在過度使用的腱(圖 3A)中Sox9(sry-型高泳動族框9)4周的基因表達鐠。如圖(圖3B)所示，也 測定了正常肌骨胳組織中Sox9基因的表達水平。表達鐠表明，與正常腱組 織相比，Sox9在軟骨組織和過度使用的腱組織中都高度表達。圖4顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因晶片、在過度使用的腱(圖 4A)中CspgZ(多功能蛋白聚糖^周的基因表達語。如圖(圖4B)所示，也測 定了正常肌骨胳組織中多功能蛋白聚糖基因的表達水平。表達鐠表明，與 正常腱組織相比，多功能蛋白聚糖在軟骨組織和過度使用的腱組織中都高 度表達。
圖5顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因晶片、在過度使用的腱(圖 5A)中硫酸軟骨素N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶(CS-GalNAcT-l)4周的基因 表達譜。如圖(圖5B)所示，也測定了正常肌骨胳組織中CS-GalNAcT-l基 因的表達水平。表達譜表明，與正常腱組織相比，CS-GalNAcT-l在軟骨 組織和過度使用的腱組織中都高度表達。
圖6顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因晶片、在過度使用的腱(圖 6A)中GalNT-l (GalNTl-UDP-N-乙醯基-a-D-半乳糖胺:多肽-N-乙醯^^ 半乳糖基轉移酶1)4周的基因表達譜。如圖(圖6B)所示，也測定了正常肌 骨胳組織中GalNT-l基因的表達水平。表達語表明，與正常腱組織相比， GalNT-l在過度4吏用的腱組織中高度表達。
圖7顯示使用Affymetrix RAE230 2.0基因晶片、在過度使用的腱(圖 7A)中Hs3stl (A乾酸乙醯肝素(葡糖胺)3-0-磺基轉移酶l)4周的基因表達 譜。如圖(圖7B)所示，也測定了正常肌骨胳組織中Hs3stl基因的表達水平。 表達譜表明，與正常的腱相比，Hs3stl在過度使用的腱中高度表達，並且 與正常的腱組織相比在軟骨組織中高度表達。
序列簡述
CS-GalNAcT-l的核苷酸和胺基酸序列可以以下列登錄號從Genbank 獲得人(NM—018371);小鼠(NMJ72753)和大鼠(XM—224757)。
CS-GalNAcT-2的核苷酸和#^酸序列可以以下列登錄號從Genbank 獲得人(NM—018590);小鼠(NM—030165)和大鼠(XM—232316)。
GalNT-l的核苷酸和tt酸序列可以以下列登錄號從Genbank獲得 人(NM—020474);小鼠(NM—013814)和大鼠(NM—124373)。聚集蛋白聚糖的核苷酸和M酸序列可以以下列登錄號從Genbank 獲得人(NM—001135);小鼠(NM—007427)和大鼠(NM—0221卯)。
Col2al的核苷酸和M酸序列可以以下列登錄號從Genbank獲得 人(NM—001844);小鼠(NMJ)31163)和大鼠(NM—012929)。
Sox9的核苷酸和M酸序列可以以下列登錄號從Genbank獲得人 (NM—000346);小鼠(NMJ)11448)和大鼠(XM 343981)。
多功能蛋白聚糖的核苷酸和M^列可以以下列登錄號從Genbank 獲得人(NM—004385);小鼠(XM—488510)和大鼠(XM—215451)。
硫酸乙醯肝素(葡糖胺)3-0-磺基轉移酶1的核苷酸和M酸序列可 以以下列登錄號從Genbank獲得人(NM—005114)、小鼠(NM—010474)和 大鼠(NM—053391)。
發明詳述
本發明提供通過降低一種或多種涉M組織中軟骨和/或纖維軟骨形 成的分子的活性來治療肌腱病變的方法。
為了更加容易理解本發明，首先定義一些術語。額外的定義在本發明 的詳細說明中給出。
如本文所用，術語"肌腱病變"包括所有發生在腱中和周圍的病理，其 中包括但不限於腱炎、肌腱炎、肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎(tenosynovitis )、 腱過度4吏用損傷和創傷、腱周圍炎(perintendinitis)以及paratenonitis。
如本文所用，術語"腱缺陷"指的是任何腱病症，其中包括但不限於肌 腱病變。
如本文所用，術語"受損的腱"指的是患有肌腱病變或腱缺陷的腱組織。 如本文所用，術語"過度使用的"腱指的是患有因為過度使用、而非直
接創傷引起的腱缺陷或肌腱病變的腱。
如本文所用，術語"患者，，或"受試者"指的是任何對腱缺損敏感、患有
腱缺損或者處於腱缺損恢復過程中、並且需要治療的人或動物。如本文所用，術語"腱炎"指的AM^腱炎(另一種說法)、肌腱病變、或 腱的炎症。
如本文所用，術語"肌腱變性"指的AI/L腱病變或在腱中發生微撕裂導 致腱弱化、通常導致疼痛、僵硬和失去強度的任意變性病症。
如本文所用，術語"腱損傷"指的是肌腱病變或者任意腱組織變得缺陷
或退^匕的病症o
如本文所用，術語"小分子"包括除多肽和核酸以外的、能起影響生物 過程作用的任意化學或其它組分。
如本文所用，術語"治療(動詞)"或"治療(名詞)"指的是任意對哺 乳動物包括人疾病的給藥或應用方案，並且包括抑制疾病。其包括阻止疾 病發展和減輕疾病，例如通過復原或恢復或修復丟失、失去或缺陷的功能、 或者刺激無效的過程。
如本文所用，術語"活性"指的是可以通過多種方式進行抑制、減低或 幹擾的酶或蛋白質的生物學功能。
如本文所用，術語"酶的活性"指的是與酶相關的一種或多種生理活性、 催化活性、調節活性或酶促活性。
如本文所用，術語"有效量"表示足夠顯示有意義的患者益處、即治癒 肌腱病變或者增加治癒和改善症狀的速率的每種本發明抑制劑的總量。
I.腱和軟骨的組成
腱包含有序的I型膠原層，其間分敉著小量的III型膠原、成纖維細 胞樣腱細胞和軟骨細胞樣纖維軟骨細胞。I型膠原被填充進入緻密的膠原 纖維中，這在腱^t所貼附的肌肉拉伸和牽拉時為其提供強度和僵硬。相對 地，軟骨包含n型膠原和蛋白聚糖，並且設計來抵抗壓縮、而非張力。纖 維軟骨為腱和軟骨組織的混合物，並且主要存在於腱和骨頭之間的界面處。 在腱內形成軟骨和纖維軟骨對腱的功能是有害的，這是因為其破壞緊密填 充的i型膠原纖維、並且降低腱的抗張強度。因此，本發明的方法可以用 來在受損或損傷的腱組織中阻止或降低軟骨和/或纖維軟骨的形成。腱中軟骨形成的一個指徵是在組織中出現增加水平的蛋白聚糖，這通
常通過這些蛋白聚糖的糖胺聚糖(GAG)側鏈的存在來檢測。蛋白聚糖為表 徵為具有一個或多個線性GAG鏈的核心蛋白質的糖蛋白家族，其中所述 的GAG鏈由重複的二糖單位組成。硫酸軟骨素蛋白聚糖例如聚集蛋白聚 糖和多功能蛋白聚糖為軟骨特異的。聚集蛋白聚糖是軟骨主要的結構成分， 並且負責軟骨的壓縮強度和彈性。聚集蛋白聚糖分子的7jC合和聚集產生多 種在軟骨組織中承擔壓縮性負荷的凝膠。Watanabe等人，/ 肌oc/^附 12《4):687-93 (1998)。軟骨組織中存在的其它蛋白聚糖包括硫酸乙醯肝素 蛋白聚糖，例如多配體蛋白聚糖3 (syn-3)。 Kirn-Safran等人，所r幼Z)e/ecto 72(C部分):69-88 (2004)。
II.促進軟骨和纖維軟骨形成的分子
本發明部分基於下列發現，即軟骨特異性基因(例如聚集蛋白聚糖、 多功能蛋白聚糖和II型膠原)在受損的腱中表達增加。由在Soslowsky等 人，/S/^"Ww ￡76ow9:79-84 (2000)所述的大鼠腱過度使用模型中獲 得的基因表達譜的這一結果表明受損的腱由於過度使用而轉變為纖維軟 骨。
本發明也部分基於下列發現，即涉及軟骨特異性蛋白聚糖糖胺聚糖 (GAG)側鏈合成的酶在過度使用的腱中表達增加。這個發現即軟骨特異性 酶在受損腱中上調為在嚴重受損腱中觀察到的GAG聚集提供了機制。 Khan等人，S/^Ws Af^/ 27:393-408 (1999)和Tallon等人，AT^/S/ wte
33(12):1983-90 (2001)。這些增加的GAG水平表明，蛋白聚糖例如 聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和syn-3的水平在受損的腱中增加。因此， 可以通過降低負責產生這些蛋白聚糖的酶的活性來防止軟骨特異性蛋白聚 糖聚集，進而治療肌腱病變。A.在肌腱病變中促進軟骨形成的分子受到上調
使用Affymetrix 061^(:出？@系統來鑑定正常腱和遭受過度使用步驟的 腱之間基因表達的差異。基因表達語產生多於400個過度使用後在岡上肌 腱中差異調節的基因。通過4周過度使用，107個基因受到上調，並且27 個基因受到下調。 一些最高上調的基因為軟骨特異性的基因，其中包括膠 原2型a-l鏈(Col2al)、 Sox9、多功能蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖。其它上 調的基因包括涉及軟骨蛋白聚糖上GAG側鏈形成的基因，其中包括 CS-GalNAcT-l、 GalNT-l和Hs3stl。基於這些結果，這些分子自身或者 其它負責這些分子活性的起始或維持、或者負責編碼這些分子的基因表達 的分子可能涉及過度使用的腱中軟骨和/或纖維軟骨的形成。這些分子可以 包括如下文所列的酶、轉錄因子和信號轉導因子
酵
一種抑制腱組織中軟骨或纖維軟骨產生的方法為抑制涉及蛋白聚糖合 成的酶的表達或活性。涉及蛋白聚糖GAG鏈合成的酶的完整目錄見Silbert 等人，/f/BM5 h/e 54:177-186 (2002)和Sugahara等人,/VBMB丄《/e 54:163-175 (2002)。這些酶包括在過度使用的腱中表達增加的蛋白質(實施 例l)。因此，本發明的一個實施方案涉及抑制下列任意一種酶的表達或 活性
CS-GalNAcT畫l和CS-GalNAcT-2(EC 2.4.1.174和EC 2.4.1.175)涉及硫 酸軟骨素GAG側鏈的起始和延伸。CS-GalNAcT-l涉及軟骨素GAG的 起始和延伸，而CS-GalNAcT-2涉及這些相同軟骨素GAG的延伸。關於 這些酶詳細的描述，請參見Uyama等人，/.所o/. C7ie附.277(11):8841-8846 (2002)、 Gotoh等人，丄&W. C7^附.277(41):38189陽38196(2002)、 Sato等人 / C7^附.278(5):3063-3071 (2003)、 Uyama等人，/ C7^附. 278(5):3072-3078 (2003)。UDP-D-木糖:核心蛋白質p-D-;Mt基轉移酶(EC 2.4.2.269)，其涉及將 最初的木糖部分添加到蛋白聚糖核心蛋白質上，這是GAG側鏈合成最初 的步驟之一；
Gal轉移酶(EC 2.4.1.133和EC 2.4.1.134)，其涉及將半乳糖殘基添加 到新的GAG側鏈的木糖部分上；
GlcA轉移酶(EC 2.4.1.135、 EC 2..4.1.226和EC 2.4.1.225)，其涉及將 GlcA部分添加到新的GAG側鏈的半乳糖殘基上；
GlcNAc轉移酶(EC 2.4.1.223和EC 2.4.1.224)，其涉及將GlcNAc部分 添加到通過CS-GalNAcT酶添加的石危酸軟骨素GAG的GalNAc部分上；
磺基轉移酶(EC 2.8.2.5和EC 2.8.2.1),其涉及將硫酸根殘基轉移到硫 酸軟骨素GAG上；
硫酸軟骨素合成酶(EC 3.1.6.4和EC 3.1.6.12),其涉及將硫酸根殘基初 次添加到硫酸軟骨素GAG上；
GalNT-l(E.C.2.4.1.41)催化在糖蛋白上形成0-連接的寡糖側鏈中的第 一步。White等人，C7iem 270(41):24156-65 (1995);並且
Hs3stl(EC 2.8.2.23)催化硫酸根殘基添加到硫酸乙醯肝素GAG上。 Shworak等人，C7^w 272(44): 28008-19 (1997)
直接或間接抑制任意一種這些酶的活性將減少蛋白聚糖的形成。下文 討論了抑制這些酶的方法。
2,基因表達
防止軟骨和/或纖維軟骨形成的備選方法是直接或間接地防止受損腱 組織中軟骨特異性蛋白質的表達。例如，可以通過許多方法降低多功能蛋 白聚糖或聚集蛋白聚糖，軟骨特異性蛋白聚糖的表達，其中所述的方法包 括防止編碼聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖的基因的轉錄或翻譯、或者防 止涉及聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖基因表達的轉錄因子的表達或功能 (這將具有防止這些基因轉錄的結果)。實施本發明時重要的是確保對軟骨特異性因子的抑制作用局限在受損 的腱中，因為許多軟骨特異性因子包括蛋白聚糖和II型膠原是功能性關節 軟骨和其它組織重要的成分。
構蛋白質表達的非酶蛋白質的活性或表達。通過抑制這些基因的表達或活
及軟骨結構蛋白質表達的蛋白質包括但不限於Sox9。
其它抑制腱組織中軟骨或纖維軟骨形成的方法涉及直接地抑制主要軟 骨結構蛋白質例如聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和II型膠原的表達(而 非活性)。發現下列基因在受損的腱組織中受到上調，並且這些基因與軟 骨形成相關。
a) Sox9
Sox9 (sry-型高泳動族框9)為涉及軟骨發育的轉錄因子。Sox9在軟骨 細胞中表達，這和膠原al(II)基因(Col2al)的表達一致。Sox9通過激活或 增強表達軟骨結構蛋白質例如II型膠原的基因的轉錄來調節軟骨發生。 Shum等人，爿W/iW船/ 仏4(2):94-106 (2002); Bi等人，G^w". 22(1):85-9 (1999)。
Col2al
Col2al編碼軟骨的主要成分，II型膠原的al鏈。Cheah等人，iVocA^/
(/S爿82(9):2555-9 (1985)。 Agcl
Agcl編碼聚集蛋白聚糖蛋白聚糖的核心蛋白質。Doege等人， E;Cffce〃"/"屍A/V^r/x Gew&s f5Vwi^fe/， I. /". i oy"， Cl Z),，編著.)Academic Press (New York) 137-152 (19卯)。如本文所用，術語"聚集蛋白聚糖"指的 是軟骨組織特異的大蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖包含包被了許多硫酸軟骨素 GAG部分的蛋白質核心。聚集蛋白聚糖是軟骨的主要結構成分，並且能夠 結合水和形成粘性的凝膠樣物質。這種7JC合作用為軟骨組織提供了彈性和 壓縮強度。Cspg2
Cspg2編碼多功能蛋白聚糖蛋白多糖的核心蛋白質。多功能蛋白聚糖 是另 一個具有許多硫酸軟骨素側鏈的大蛋白聚糖。像聚集蛋白聚糖一樣， 多功能蛋白聚糖結合水，並且形成增加組織強度和彈性的黏性凝膠。 Knudson等人，^附CW/Dev12:69-78 (2001)。
B.通過抑制促進軟骨形成的分子來治療肌腱病變 本發明提供通過降低上文所列分子的表達和/或活性來治療或預防肌
腱病變的方法。本發明進一步提供施用上文所列分子的抑制劑來治療或預
防肌腱病變的方法。 治療策略
本發明部分基於下列發現，即編碼聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖 Sox9、 II型膠原、CS-GalNAcT-l、 GalNT-l和HS3stl的基因的表達水平 在過度使用的腱組織中與對照組織相比顯著增加(圖1-7)。這個結果表明， 涉及蛋白聚糖合成途徑的酶或其它分子的表達增加導致受損的腱組織轉變 為軟骨和/或纖維軟骨。因此，在一個實施方案中，本發明包括治療肌腱病 變的方法，其中包括通過抑制涉及軟骨和/或纖維軟骨合成的酶或其它分子 的活性、表達或聚集來降低腱組織中軟骨和/或纖維軟骨的形成。
阻斷涉A^:中軟骨或纖維軟骨形成的酶或其它分子活性的抑制劑在本
發明中是有用的。用於本發明方法的抑制劑被任選糖基化的、加入聚乙二 醇的或者連接於另一個非蛋白質的聚合物。抑制劑可以被修飾為具有改變 的糖基化模式(即與最初的或天然的糖基化模式相比是改變的)。如本文所 用，"改變的，，表示與最初的抑制劑相比添加或刪除了一個或多個糖類部分、 和/或添加或刪除了 一個或多個糖基化^i點。向抑制劑添加糖基化位點可以
一種增加糖部分數量的方式是通過將糖苷化學或除波偶聯於抑制劑的M 酸殘基。這些方法在WO87/05330和Aplin等人，CW, Wev 5/od^附 22:259-306 (1981)中進行了描述。存在於底物上的任意糖部分的移除可以化學或S^地完成，如Sojar等人，祝oc/ie附5/0/7/i戸259:52-57 (1987)、 Edge等人，^mz/肌oc/^附118:131-137 (1981)和Thotakura等人， 五"^附o/ 138:350-359 (1987)中所述。
包括例如肽、小分子和核酸的蛋白質和非蛋白質抑制劑也可以用於本 發明的方法。
a)肽和小分子
用於本發明方法的抑制劑包括小的有機肽和分子、以及小的無機分子。 這些肽和小分子包括合成和純化的天然存在的抑制劑。本領域熟知鑑定特 異靶向於目的蛋白質的肽和小分子的方法。例如，可以使用耙蛋白質i^！ 和/或生物學功能的測定來篩選肽和/或'J 、分子文庫對乾蛋白質例如 CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT國2、 GalNT-l和/或Sox9的抑制。在另一個 實施方案中，可以在靼蛋白質例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Sox9的竟爭性放射性配體結合測定中用其底物或配體篩選 小分子和/或肽文庫。
備選地，可以用基於焚光共振能量轉移(FRET )的測定例如時間分 辨的FRET(TR-FRET)測定來鑑定抑制劑。在示例性實施方案中，將蛋白 聚糖的核心蛋白質用His或GST標籤標記，並使用偶聯了銪(螢光團) 的抗His或GST抗體來標記蛋白質。備選地，將核心蛋白質在賴氨酸或半 胱氨酸殘基上用銪進行非特異性標記。供體糖分子用Cy5 (螢光染料)標 記。可以用於這項測定的供體和受體分子的列表可以在Uyama等人，/肌o/ C&附278(5):3072-78 (2003)的表1中找到。
受體和供體分子以不同比率與和不與乾酶組合。TR-FRET測定通過
下列步驟進行，即在340nm激發系統、分別在615和665 nm測量銪和 Cy5的發射、並計算Cy5發射與銪發射的比率。
當不存在酶時，供體和受體分子彼此不能緊密靠近，並且Cy5和銪分 子的個體焚光不存在淬滅，進而產生基線水平的比率。當向測試系統中加 入靼酶時，供體糖分子轉移至受體蛋白質，並且淬滅系統的螢光。Cy5與 銪螢光的比率隨著轉移的糖分子數量達到最大而增加。為了鑑定靶酶的抑制劑，向測定系統中加入肽或小分子。當測試化合 物能夠抑制糖向蛋白質的轉移時，螢光的淬滅就會減少。如果測試肽能夠
抑制酶100。/。的轉移活性，那麼Cy5發射與銪發射的比率就為基線水平。 然後在基於細胞的系統中評估在這項測定中至少抑制50。/。酶活性的化合 物來評定其降低GAG合成(如下文所述)的能力。
本發明也提供^f吏用額外的篩選測定例如二級和三級測定(secondary and tertiary assay )，來進一步鑑定此類分子對腱形態的作用，例如使用 上文詳細描述測試。
b) 顯性失活的突變體
在本發明的一些實施方案中，突變的CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl或Sox9蛋白質可以用在本發明的方法中作為抑制劑。例
體或經改造的同源物可以用於本發明的方法。
c) 核酸
能夠阻斷上文所列的靶分子活性的核酸在本發明中是有用的。此類抑 製劑可以編碼與例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl 或Sox9相互作用的蛋白質。備選地，此類抑制劑可以編碼能與靼分子(例 如GalNAc)的底物或配體相互作用的蛋白質，並且如果所編碼的蛋白質 阻斷耙分子與其底物或配體的結合、或者如果其阻斷底物或配體結合乾分 子後的活性，那麼此類抑制劑就在本發明的方法中是有效的。當然，抑制 劑可以編碼同時與靶分子及其底物或配體相互作用的蛋白質。此類核酸可 以用來表達例如CS-GalNAcT-l、CS-GalNAcT-2、Hs3stl、GalNT-l或Sox9 的抑制劑來用於本發明的方法。
本發明的方法也包括使用幹擾性RNA分子("RNAi")來降低上文所 列的任意分子或其蛋白質結合配偶體的表達，其中所述的幹擾性RNA分 子包括但不限於短的幹擾性RNA (siRNA)、短的髮夾RNA ( shRNA ) 和短的雙鏈RNA (sdsRNA) 。 RNAi可以通過引入核酸分子例如合成的 短幹擾性siRNA或RNA幹擾劑來起始，進而抑制或沉默靶基因的表達。見，例如美國專利^>開號2003/0153519和2003/01674901、以及美國專利 號6，506，559和6,573,099。
siRNA可以化學合成，通過體外轉錄產生，或者在宿主細胞內產生。 一般而言，siRNA至少長15-50個核苷酸，例如長20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30個核苷酸。siRNA可以是大約15至大約40個 核苷酸長度的雙鏈RNA (dsRNA)，例如大約15至大約28個核苷酸的長度， 其中包括大約19、 20、 21或22個核苷酸長度，並且可以在每條鏈上包含 具有大約O、 1、 2、 3、 4、 5或6個核苷酸長度的3，和/或5，突出端。siRNA 可以通過轉錄沉默來抑制乾基因。優選地，siRNA能夠通過降解乾信使 RNA或者特異地轉錄後基因沉默(PTGS )乾信使RNA來促進RNA幹擾。
用於本發明方法的siRNA也包括小的髮夾RNA ( shRNA ) 。 shRNA 包含短的(例如大約19至大約25個核苷酸)的反義鏈、接著是大約5個 至大約9個核苷酸的核苷酸環、以及類似有義鏈(analogous sense strand)。 備選地，有義鏈可以在核苷酸環結構之前，並且反義鏈可以在之後。這些 shRNA可以包含在質粒和病毒載體中。
siRNA分子的耙向區域可以選自所給的耙序列。例如，核苷酸序列可 以從起始密碼子下遊大約25-100個核苷酸處起始。核苷酸序列可以含有5， 或3，非翻譯區，以及靠近起始密碼子的區域。本領域熟知設計和製備siNRA 分子的方法，其中包括多種選擇序列作為RNAi反應物的規則。見，例如 Boese等人，Af"/ioA五rtgwo/ 392:73-96 (2005)。
siRNA可以寸吏用Hannon等人，7Vfl似"418:244-251 (2002)、 McManus 等人，A^/^Wews 3:737-747 (2002)、 Heasman等人，所o/ 243:209-214 (2002)、 Stein等人，/ C/," /wwW， 108:641-644 (2001)和Zamore等人， Aw"肌o/8(9):746-750 (2001)所述的標準技術產生。優選的siRNA為5， 磷酸化的。
siRNA可以用來耙向例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT畫l、 Hs3stl、 Sox9、 Agcl、 Cspgl或Col2al、或者上文所列的其它分子、及其 底物或配體。核酸可以從其自然環境，以基本純的或同質的形式獲得、分離和/或純 化。熟知在多種不同宿主細胞中克隆和表達多肽的系統。適當的宿主細胞
包括細菌、哺乳動物細胞、酵母和杆狀病毒(baculovirus)系統。本領域 可用的表達異源多肽的哺乳動物細胞系包括例如中國倉鼠卵巢細胞、HeLa 細胞、幼地鼠腎細胞、NSO小鼠黑素瘤細胞、以及許多其它細胞。關於適 合從核酸產生蛋白質的其它細胞見Gene Expression Syst ems, Fernandez等人，Academic Press (1999)。 RNAi分子可以化學合成，或者 從編碼siRNA或shRNA序列的DNA序列表達。
為了產生上文所列分子顯性失活突變體，可以選擇或構建含有適當調 節序列的適當載體，其中所述的調節序列包括啟動子序列、終止子序列、 多聚腺苷酸化序列、增強子序列、選擇或標記基因以及其它適當的序列。 根據需要，載體可以是質粒或病毒，例如噬菌體或噬菌粒。更多細節參見， 例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook等人，第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。許多操作核酸的已知技術和 方法，例如製備核酸構建體、誘變、測序、將DNA引入細胞和基因表達、 以及蛋白質分析中，都在Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人編輯，第2版，John Wiley & Sons (1992)中詳細描述。
可以將核酸融合至編碼額外多肽序列的其它序列，例如用作標記或才艮 告基因的序列。標記或報告基因的實例包括內醯胺酶、氯黴素乙醯轉移酶 (CAT)、腺苷脫氨酶(ADA)、 M糖苷磷酸轉移酶(負責新黴素(G418)抗性)、 二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮黴素-B-磷酸轉移酶(HPH)、胸腺嘧咬核苷激 酶(TK)、 lacZ(編碼半乳糖苷酶)、黃噤呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(XGPRT)、 螢光素酶。本領域也熟知許多其它基因。
2.抑制酶活性
在本發明特定的實施方案中，治療肌腱病變的方法包括降低、抑制或 下調涉及蛋白聚糖生物合成的酶的活性，其中所述酶例如涉及將硫酸軟骨 素GAG添加到聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖上的那些。這些酶包括 例如CS-GaINAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 UDP-D-木糖:核心蛋白質p-D-木糖基轉移酶、Gal轉移酶、GlcA轉移酶、GlcNAc轉移酶、磺基轉移酶、硫 酸軟骨素合酶、Hs3stl和Ga證-l。
在示例性實施方案中，本發明包括降低、抑制或下調受損腱中 CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Hs3stl酶的活性。在其 它實施方案中，本發明包括降低、抑制或下調受損腱中Xyl轉移酶、Gal 轉移酶、GlcA轉移酶、GalNAc轉移酶、GlcNAc轉移酶、磺基轉移酶或 硫酸軟骨素合酶的活性。上述肽或小分子抑制劑可以用來實行這些方法。
a)鑑定酶活性的抑制劑
本發明進一步包含鑑定和評估在受損腱組織中作為CS-GalNAcT-l 、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl、 Xyl轉移酶、Gal轉移酶、GlcA轉移 酶、GalNAc轉移酶、GlcNAc轉移酶、磺基轉移酶或硫酸軟骨素合酶的抑 製劑的物質的功效的方法。
此類抑制劑阻斷或降低涉;^M中軟骨或纖維軟骨形成的酶的活性。這
些抑制劑包括修飾的可溶性底物、蛋白質、小分子以及核酸。
鑑定治療肌腱病變的物質的方法包括測定每個獨立物質對上文所列酶 的酶活性、蛋白質-耙相互作用或者蛋白質-蛋白質相互作用的效果。多種 體內或體外的測定可以用來測定抑制劑治療肌腱病變的功效。在一示例性
實施方案中，通過類似於高通量篩選(HTS)的方法，通過測定小分子影 響例如上文所列酶的酶活性、靶結合或蛋白質-蛋白質相互作用的能力而對 其潛在的治療用途進行了體外評估。
在典型的HTS測定中，候選化合物對例如酶活性、配體-受體結合等的 抑制效果可以通過將存在已知濃度候選者時的測試測定與參照進行比較來 測定，其中所述的參照在不存在候選者和/或在存在已知抑制劑化合物時進 行。 一般地，可以使用常規染料、螢光或放射性活性分子來監測候選化合 物的效果。因此，例如，可以鑑定出抑制配體與其受體結合、或者抑制酶 活性、降低酶過程周轉的候選化合物。
本發明的示例性實施方案提供在體外鑑定治療肌腱病變的物質的方 法，其中包括(l)提供至少一種選自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、GalNT-l和Hs&tl的樣品成份的樣品；("組合樣品成分和測試物質；p)測 定樣品成分應答測試物質的活性；並(4)確定測試物質是否抑制樣品成分的 活性。
在一個示例性實施方案中，鑑定治療肌腱病變的物質的體外方法包括 用BMP-2蛋白質或表達BMP-2蛋白質的腺病毒處理軟骨外植體、初級軟骨 細胞顆粒培養物或者軟骨細胞系。BMP-2刺激ECM和GAG合成。然後將 測試化合物加入培養物中，並通過測量35S到GAG側鏈中的摻入和/或通過 DMMB測定來評估抑制劑對GAG合成的效果。測試化合物的效果將與適當 的載體對照進行比較。
潛在的酶抑制劑的體內測定可以包括(l)重複向哺乳動物(例如 Sprague-Dawley大鼠)施用至少2、 4、 6或8周時間的測試抑制劑；(2)將哺 乳動物每周5天、每天l小時以17米/分鐘進行下坡跑步方案(實施例l);
肌腱的效果，其^認為腱變:生(例如:胞和形態-學上的異常)的變緩歸因 於抑制劑，並且表明抑制劑對於治療腱變性病症是有效的。
應當理解，用於本發明方法的測試抑制劑可以在一種或多種腱變性病 症的動物模型和/或人中進行評估。
本領域已知多種在體內和體外在存在抑制劑時測量酶活性的測定。一 些較常用的測定的實例包括分光光度法、螢光分光測定法、圓二色性 (circular dichroism )、自動化的分光光度法和螢光分光測定法、偶聯測 定、自動化的酸或鹼滴定法、放射性方法、無標記的光學檢測和酶抑制測 定。在示例性實施方案中，CS-GalNAcT-l和/或CSGalNAcT-2的酶活性如 Uyama等人，J Biol Chem 277(11):8841-46 (2002)中所述進行檢測。在另一 示例性實施方案中，GalNT-l的酶活性如White等人，J Biol Chem 270 (41):24156-65 (1995)所述進行檢測。
例如，用於本發明方法的酶抑制劑可以與其抑制的酶相互作用。備選 地，抑制劑可以與例如酶底物(例如GalNAc )或其它結合配偶體相互作用。 如果抑制劑阻斷酶與其底物的結合、並且/或者如果抑制劑阻斷底物結合酶後的活性，那麼其可以降低或者並且在本發明中有效。當然，抑制劑可以
與酶和第二種因子例如其底物都相互作用。在這個方面，CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Hs3stl的抑制劑包括例如^f務飾的可溶性底 物、其它蛋白質(包括結合酶和/或酶底物的蛋白質)、修飾形式的酶或其 片段、前肽、肽和所有這些抑制劑的模擬物。
酶的抑制劑可以例如是直接的酶抑制劑，結合併中和酶的活性；降低 酶的表達水平；影響前體分子的穩定性或向活性、成熟形式的轉變；幹擾 酶與其一個或多個底物的結合；或者其幹擾酶的細胞內功能。
3.抑制轉錄因子活性
用於本發明方法的轉錄因子抑制劑可以直接通過結合、或者間接通過
在這個方面，Sox9的抑制劑可以包括經々務飾的可溶性配體或靶分子、小分 子和核酸。
本領域已知在存在抑制劑時在體內和體外測量Sox9活性的測定。 一些 較常用的Sox9抑制劑的測定的實例包括酵母雙雜交系統、螢光素酶報告基 因、測定存在Sox9抑制劑時軟骨細胞特異性基因(例如Col2al、 Agcl)表 達水平的PCR測定、Sox9或軟骨特異性基因的Western印跡分析、瞬時轉 染、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)測定和Northern印跡分析。
可以使用多種基於螢光共振能量轉移(FRET)的蛋白質-蛋白質或蛋白 質-核酸相互作用的測定來測定抑制劑對Sox9與其結合配偶體相互作用的 壯闊用。例如，可以使用AlphaScreenTM擴增的發光近似性同質測定(購自 普金艾爾莫公司(PerkinElmer⑧))，或者可以採用生物發光共振能量轉 移(Bioluminesence Resonance Energy Transfer)(購自普金艾爾莫公司
(PerkinElmer )的BRETTM)來進行幹擾Sox9結合性相互作用的抑制劑的 體外測定。
在一個實施方案中，本發明提供用於鑑定治療肌腱病變的物質的體外 測定的方法，其中包括(l)提供融合於供體螢光分子的上文所列靶分子； 組合靶分子和測試物質；(3)加入融合於受體螢光分子的靶分子的結合配偶體；(4)檢測靶分子和其結合配偶體之間的螢光能量轉移水平；並(5)測定測 試物質是否抑制靶分子與其結合配偶體的相互作用。
抑制劑能夠幹擾靶分子與其結合性配偶體的結合，並進而影響兩者間 的FRET水平。因此，可以使用FRET測量來鑑定多種效力的抑制劑。 一旦 在體外鑑定了靶分子的抑制劑，就可以進行進一步的體內測試來測定抑制 劑在預防腱中軟骨和纖維軟骨形成中的功效和適用性。
4. 抑制蛋白質表達
在另一個實施方案中，治療肌腱病變的方法包括降低、抑制或下調基 因例如CS-GalNAcT畫l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l 、 Hs3stl 、 Col2al、 Cspgl、 Agcl和/或Sox9、及其編碼的多肽或蛋白質的表達和/或聚集。用於抑制這 些基因表達的組合物包括例如上文II(B)(l)(c)部分中所述的幹擾性RNA分 子。
這些抑制劑可以以任意方式施用，但在特定實施方案中，將表達RNAi 抑制劑的DNA摻入腺病毒栽體，然後將所述載體注射進入需要腱修復的患 者。在示例性實施方案中，編碼RNAi的核苦酸序列位於polII啟動子的下遊， 如Wahdwa等人，Curr Opin Mol Ther 6(4):367-72 (2004)中所述。將siRNA 和shRNA插入腺病毒載體的方法為本領域熟知，並在Krom等人，BMC Biotech 6(11):[先於印刷的電子發行中進行了描述。備選地，直接將RNAi 抑制劑注射i^受損的腱組織、並通過電穿孔法將其轉運進入細胞，如 Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005)中所述。
5. 肌腱病變病症
本發明的方法可以用來在任何需要該治療的哺乳動物中治療或預防肌 腱病變，其中所述的哺乳動物包括人、靈長類、猴、齧齒動物、羊、兔、 狗、豚鼠、馬、牛和貓。可以治療或預防的病症包括例如腱炎、肌腱炎、 肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎(tenocynovitis)、腱過度使用損傷、腱創傷、腱 周圍炎、paratenonitis、和"肌腱病變"病症家族中的任意其它病症。
肌腱病變可以由於過度使用和重複運動、突然損傷(從輕度到重度)、 逐漸變性或老化導致。大多數腱損傷由一系列疾愈緩慢的小裂傷(肌腱變性)組成，所述小裂傷減弱腱、通常導致疼痛、僵硬和失去強度。肌腱病變通 常需要數周的治療、減少或改變活動、以及休息。太快恢復使用受損的腱 將導致更多的腱損傷，使受損的腱更加容易撕裂或破裂。因此，通過本發 明治療或預防的病症包括伴隨過度使用、體育或事故相關損傷和創傷、營 養缺乏和年齡增長的腱變性病症(急性和慢性兩種)。
肌腱病變的一個實例是外上髁炎，也已知為"網球肘(tennis elbow)"， 這是熟知的體育醫學和矯形外科病症。這種病症潛在的病理涉及過度使用 和微撕裂肘部處的橈側腕短伸肌腱。身體嘗試修復這些微撕裂，但在許多 情況中，癒合過程是不完全的。進行慢性外上髁炎手術的患者的病理學樣 品顯示受損腱中紊亂的血管成纖維細胞發育異常。這種不完全的修復嘗試 導致變性的、不成熟的、並且血管化的組織。不完全修復的組織比正常的 腱組織弱，並且缺乏行使正常功能的強度。這種弱化的組織也通過引起疼 痛，並消極地影響生活質量而限制患者。類似的不完全修復存在於其它類 型的腱相關損傷或損害中，例如膝腱炎(跳躍者膝)、跟腱炎(常見於跑步運 動員)、和肩袖腱炎(常見於"過頭頂，，的運動員，例如棒球投手)。
肌腱病變也可以由於例如增長的年齡、不好的飲食、體育活動、創傷、 損傷或藥物例如培氟沙星(pefloxacin)引起。例如，前列腺素E1(PGE1) 誘導的、前列腺素E2(PGE2)誘導的或者培氟沙星誘導的肌腱病變是人肌腱 病變建立的很好的動物模型。在一個實施方案中，本發明提供在個體中治 療或預防藥物誘導的肌腱病變例如培氟沙星誘導的肌腱病變的方法。在其 它示例性實施方案中，本發明提供治療或預防由於過度使用、體育或事故 相關的損傷和創傷、營養缺乏和年齡增長誘導的肌腱病變的方法。
本發明進一步提供通過向哺乳動物施用分子活性和/或表達的抑制劑 來治療或預防腱變性病症、延緩腱退化、恢復腱品質、維持腱健康、治療 或預防腱組織的低氧變性、治療或預防腱組織的透明素變性、治療或預防 腱組織的類黏蛋白或myxoid變性、治療或預防腱組織的類血纖維蛋白變 性、治療或預防腱組織的脂類變性、治療或預防腱組織的鈣化、治療或預 防腱組織的纖維軟骨和骨的組織轉化、維持腱的微觀結構完整性、維持腱中的纖維結構、維持腱中的纖維排列、維持正常的腱血管供應、維持腱組
織中正常的細胞構成、恢復腱組織中正常的ECM含量、減少腱組織中GAG 的病理學聚集、和/或維持腱的質量、抗張強度和/或柔性品質的方法，其中 所述的分子例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Xyl轉移酶、 Gal轉移酶、GlcA轉移酶、GalNAc轉移酶、GlcNAc轉移酶、磺基轉移酶、 硫酸軟骨素合酶、Col2al、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、Hs3stl和/或 Sox9，並且施用上述抑制劑的量為在肌腱病變組織中預防或降低此類分子 活性和/或表達的有效量。 6.評估治療和動物模型
本發明的方法可以用來在腱組織中治療肌腱病變或微缺陷。治療後或 者治療期間的腱品質可以例如通過評估腱的耀Jf見結構完整性、腱皎原穩定 性、腱組織細胞構成的變異、腱血管化、和/或GAG含量來測定。在治療後 或者治療期間評估腱健康的方法為本領域已知，並且包括但不限於磁共振 成像(MRI)、超聲波掃描術、以及功能性和/或疼痛評估。備選地，腱的健 康可以通過評估腱組織中GAG的水平來測定。
一種測定腱G AG含量的測定為對於測量腱中硫酸化糖胺聚糖(G AG) 濃度的1，9-二甲基亞甲藍(DMMB)測定。另 一種測定腱GAG含量的測定為 組織學的愛茜藍(AB)染色，其可以用來檢測腱組織中增加數量的GAG。
III.治療的方法和藥物組合物
用於本發明方法的抑制劑可以通過局部的、經口的、靜脈內的、 內的、肌內的、腔內的、皮下的、植入的或者經皮的方式局部或全身施用。
在示例性實施方案中，也可以通過基因療法的方式向個體施用抑制劑， 其中在體內向患者施用編碼抑制劑的核酸序列。在示例性實施方案中，將
病毒表達載體。然後直接將腺病毒注射進入患者的腱，在所述的腱中表達 核酸抑制劑。例如，Mehta等人，J Hand Surg30A(l):136畫41 (2005)、 Lou等人，J Orthoped Res 19:1199-1202 (2001)和Lou， Clin Orthopaed Rel Res 379S:S252-55 (2000)中描述了腺病毒介導的核酸向腱組織遞送的實例。
在其它示例性實施方案中，將核酸抑制劑摻入其它病毒表達載體，例 如慢病毒、皰滲病毒和腺伴隨病毒。適當的載體可以通過評估每種類型病 毒在初級腱細胞中的體外傳染性來進行選擇。
備選地，將核酸抑制劑直接注射"腱組織，並通過電穿孔轉移" 細胞，如Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4):1314曙18 (2005)中所 述。
在其它示例性實施方案中，用於本發明方法的肽或小分子抑制劑可以 包被在經皮膚的貼劑上，並直接應用於覆蓋腱組織的皮膚，如Paoloni等人, J Bone Joint Surg 86A(5):916-22 (2004)中所述。
本領域已知治療肌腱病變的分子的施用方法。"施用"不限於任意的特 定遞送系統，並且可以不限制地包括腸胃外的(包括皮下的、靜脈內的、髓 內的、關節內的、肌內的、腔內的或腹膜內的注射)、直腸的、局部的、經 皮膚的或者經口的(例如在膠嚢、混懸劑或片劑中)。可以局部或全身地發 生向個體施用，以單次劑量，或者連續或間斷地重複施用，並且以任何的 多種生理學上可接受的鹽形式，和/或與作為藥物組合物(上文所述)部分 的可藥用載體和/或添加劑一起施用。本領域技術人員熟知生理學上可接受 的鹽形式、標準的藥物製劑才支術和賦形劑。見Physicians， Desk Reference (PDR) 2003，第57版，Medical Economics Company, 2002和Remington: The Science and Practice of Pharmacy,編著。Gennado等人，第20版， Lippincott, Williams & Wilkins， 2000)。
用於本發明方法的抑制劑可以施用從大約l jiig/kg至大約20 mg/kg的劑 量,這取決於症狀的嚴重度和疾病的i^艮。適當的有效劑量由主治醫生從 下列範圍選擇例如大約l照/kg至大約20mg/kg、大約l jng/kg至大約10 mg/kg、大約l fig/kg至大約l mg/kg、大約10照/kg至大約l mg/kg、大約10 ^g/kg至大約100 pg/kg、大約IOO jig至大約l mg/kg、以及大約500 pg/kg至 大約l mg/kg。在另一個示例性實施方案中，重複施用抑制劑至少2、 4、 6、 8、 10、 12、 20或40周的時期，或者至少l、 1.5或2年或者高達受試者的終身，從而 來例如治療肌腱病變。在本發明的另一個實施方案中，以單次劑量施用抑 製劑來例如刺激恢復腱的正常結構和組成。
一般而言，用於本發明方法的抑制劑可以施用在10-8和10-7、 10-7和 10-6、 10-6和10-5或者10-5和10-4g/kg之間的劑量。在一種動物模型中完成 的治療有效劑量可以轉換為用在另 一動物包括人中，使用本領域已知的換 算係數。見，例如Freireich等人，Cancer Chemother Reports 50(4):219-244 (1966)。
在本發明方法中使用的抑制劑的確切劑量基於想要的結果憑經驗確 定。示例性結果包括(l)腱變性病症得到治療或預防；(2)腱退化得到緩解； (3)腱的品質得到恢復；(4)腱的健康得到維持；(5)腱的低氧變性得到治療或 預防；(6)腱的透明素變性得到治療或預防；(7)腱的類黏蛋白或myxioid變 性得到治療或預防；(8)腱的類血纖維蛋白變性得到治療或預防；(9)腱的脂 類變性得到治療或預防；(10)腱的鈣化得到治療或預防；(ll)腱的纖維軟骨 和骨的組織轉化得到治療或預防；(12)腱的纖維結構得到維持；(13)腱中的 纖維排列得到維持；(14)腱正常的血管供應得到維持；(15)腱中正常的細胞 構成得到維持；(16)腱中正常的ECM含量得到恢復；和/或(17)腱的質量、 抗張強度和/或柔性品質得到維持。例如，施用有效量的抑制劑來至少20、 30、 40、 50、 100、 200、 300、 400或500%地減緩腱的退化(例如腱質量的、 結構組成、和/或對微撕裂和疼痛敏感性的損失)。
在一些實施方案中，用於本發明方法的組合物還包含可藥用的賦形劑。 如本文所用，詞語"可藥用的賦形劑，，指的是任意和所有與藥物施用兼容的 溶劑、*劑、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延遲吸收劑等。本領 域熟知此類介質和物質作為藥物活性物質的用途。組合物也可以含有其它 提供補充的、額外的或者增強的治療功能的活性化合物。藥物組合物也可 以與施用說明一起包括在容器、包裝或者分樣器(dispenser)中。與本發明方法聯合施用的藥物組合物應當被配製成與其預期的施用途 徑兼容。此類製劑的實例包括結晶蛋白質製劑，其是以棵露的或者與生物
可降解聚合物(例如PEG、 PLGA)組合來提供。
用於本發明方法的抑制劑可以作為藥物組合物與載體凝膠和基質或者 其它用於引導骨再生和/或骨替換的組合物一起施用。此類基質的實例包括 合成的聚乙二醇(PEG)、羥磷灰石、基於膠原和血纖蛋白的基質、Tisseel 血纖蛋白膠等。
在一些實施方案中，抑制劑可以與其它治療性化合物例如NSAID、皮 質類固醇、 一氧化氮、睪酮、雌激素、生長因子(例如BMP-12、 BMP-13 和MP52)《且合或伴隨地施用。
用於本發明方法的抑制劑可以被包被在腱植入物、基質和貯存系統上、 或者摻入其中來促進治療或預防腱損傷。
實施例
實施例l:大鼠岡上肌腱由於過度使用表達軟骨標記
了研究。先前已經描述了腱過度使用的大鼠模型。Soslowsky等人，J Shoulder Elbow Surg 9:79-84 (2000)。已經表明，炎性和生血管標記在這個 模型中被改變(Perry等人，J Shoulder Elbow Surg 14:79S-83S (2005))，但採
取更廣泛的途徑來理解圍繞過度使用損傷的事件。
對24隻雄性Sprague-Dawley大鼠(400-450 g)進行岡上肌腱(SST)過度 使用方案1周(11=8)、 2周(11=8)和4周(11=8)。方案由每周5天、每天l小時的以 17米/分鐘的下坡跑(10%坡度)組成。額外的6隻大鼠用作籠內活動的對照 (時間0)。在每個時間點，兩隻額外的非跑動大鼠被用作年齡匹配的同齡 組對照。
在屍體剖檢時，從每個肩部取出岡上肌腱，並從每個膝部取出膝腱 (PT)。膝腱用作運動效果的內參，因為用此方案其不顯示過度使用的明顯 徵狀。稱量採集的腱，並速凍在液氮中。將組織冷凍破碎，並用TRIzol試劑(英傑生命科技公司(Invitrogen ))抽提。用RNeasy試劑盒(強基因公司 (QIAGEN))從抽提物的水相中分離RNA。用分光光度計測定RNA的濃 度。監測大於30，000個轉錄物表達水平的轉錄概況分析用Affymetrix大鼠基 因組230 2.0陣列進行。對所有陣列圖像都在視覺上檢查缺陷和品質。在進 一步的分析中排除高背景、低信號強度、或者主要缺陷的陣列。信號值用 Gene Chip Operating System 1.0 (GCOS， Affymetrix)測定。對於每組陣列， 將統計值標準化為100的平均信號強度值。將默認的GCOS統計值用於所有 分析。如果基因在任意組織中的平均表達大於100個信號單位、並且具有通 過GCOS默認設置測定的Present (P) call的樣品百分數大於或者等於66。/。， 那麼就認為基因是可檢測的。將標準化的信號值轉變為底數為10的對數。 如果ANOVA檢測的p值《.01，並且在任意時間點跑動和對照間的差異都為 至少2倍，那麼就認為基因是差異表達的。
過度^f吏用後，在岡上肌腱中超過400個基因受到差異調節。通過跑動4 周，107個基因受到上調，並且27個基因受到下調。在最高上調的基因中， 許多是在軟骨組織中高度表達的，其中包括II型膠原al、多功能蛋白聚糖 和聚集蛋白聚糖。這些結果表明，過度使用的腱轉變為纖維軟骨的表型。 這些相同基因在跑動動物的膝腱中未受到上調(見圖l-7)。 實施例2:製備siRNA抑制劑
siRNA如下選擇，即通過將CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的核苷
列輸入商業網站(例^口sirnawizard.com或Ambion⑧siRNA Target Finder)來設計特異的siRNA。序列選擇指導包含在這些工具中。
siRNA的功效通過將其轉染進入C-20/A4和/或C-28/I2軟骨細胞，並通 過實時RT-PCRJli測CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l的表達來測量。具相同核 普酸組成的適當亂序(scramble)siRNA被用作實驗對照。
實施例3:蛋白聚糖合成的抑制劑的體外測試系統
如果siRNA能夠降低C-20/A4和/或C-28/I2軟骨細胞中CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的表達，那麼就測試其降低蛋白聚糖GAG側鏈產生的能 力。用BMP-2蛋白質或表達BMP-2的腺病毒處理C-20/A4和/或C-28/I2軟骨細胞來刺激細胞外基質和GAG的合成。將siRNA或者備選地，小分子、GAG 合成的抑制劑加入到培養物中，並通過比較在存在或不存在抑制劑時35S 到蛋白聚糖中的摻入來評估抑制劑的效果。備選地，通過用DMMB測定比 較在存在或不存在抑制劑時GAG的水平來評估抑制劑的效果，如Arai等人， Osteoarthritis and Cartilage 12:599-613 (2004)中所述。
實施例4:通過CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的siRNA抑制來治療 肌腱病變的方法
用跑臺過度使用方案(實施例l)或者局部注射PGE1、 PGE2或培氟 沙星(300 mg/ml)l周(每周5次)來在大鼠中+秀導肌腱病變。
一旦在體外發現siRNA降低了CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的活 性，就將其轉換為shRNA，並將shRNA序列克隆和插入腺病毒，例如Krom 等人，BMC Biotech 6(11):[電子發行]中所述。使用腺病毒來在體內表達 shRNA、並隨後抑制CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l的表達。將注射方法在 初級腱細胞中進行優化。
將表達shRNA的功能性腺病毒直接注射ii7v受損的腱(Mehta等人，J Hand Surg 30A(1):136-41 (2005))來局部降低CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l 基因的表達。包括亂序序列(Scramble sequence )作為實驗對照。通過評 估GAG水平來評估腱中軟骨組織形成的量。使用組織學的愛茜藍染色來檢 測腱組織中糖胺聚糖(GAG)的增加的量。使用DMMB試劑定量從腱中抽提 的石克酸化GAG的量。
抑制CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l對肌腱病變的效果的體內評估通過 組織學和腱強度的機械性或功能性檢測來測定。如果與未處理的對照相比， GAG水平顯著下降和/或被降低到與正常、未受損傷的腱相似的水平，就認 為抑制劑是有效的。備選地，當與未處理的對照相比，如果功能或機械測 試證明改善的功能和/或降低的疼痛，就認為抑制劑是有效的。
權利要求
1. 在患者中治療肌腱病變的方法，其包括降低患者腱組織中軟骨特異性蛋白聚糖的形成。
2. 權利要求l的方法，其中所述的患者為人。
3. 權利要求l的方法，其中所述的患者選自靈長類、猴、齧齒動物、 羊、兔、狗、豚鼠、馬、牛和貓。
4. 權利要求l的方法，其包括降低患者腱組織中涉及蛋白聚糖合成的 酶的活性，所述蛋白聚糖選自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和多配體蛋 白聚糖-3。
5. 權利要求1的方法，其包括降低患者腱組織中硫酸軟骨素N-乙醯氨 基半乳糖基轉移酶1(CS-GalNAcT-l)和/或半乳糖胺多肽N-乙醯氨基半乳 糖基轉移酶l(GalNT-l)的活性。
6. ^又利要求1的方法，其中所述的活性通過抑制CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 Hs3stl和/或GalNT-l的酶活性來降低。
7. 衝又利要求l的方法，其中所述的活性通過抑制CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 Hs3stl和/或GalNT-l基因的表達來降4氐。
8. 權利要求l的方法，其包括降低涉及軟骨產生的轉錄因子的活性。
9. 權利要求8的方法，其包含降低Sox9的活性。
10. 權利要求9的方法，其中所述的活性通過抑制Sox9增強軟骨特異 性基因表達的能力來降低。
11. 權利要求8的方法，其中所述的活性通過抑制Sox9基因的表達來 降低。
12. 權利要求l的方法，其包括降低軟骨特異性蛋白質的表達。
13. 權利要求12的方法，其包括降低選自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白 聚糖和多配體蛋白聚糖-3的蛋白聚糖的表達。
14. 權利要求12的方法，其包括降低Col2al的表達。
15. 權利要求l的方法，其中所述的肌腱病變為腱炎。
16. 權利要求l的方法，其中所述的肌腱病變為肌腱變性。
17. 權利要求l的方法，其中所述的肌腱病變為腱損傷。
18. 在患者中治療肌腱病變的方法，其包括向患者的腱組織中施用 CS畫GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2 、 GalNT-l、 Hs3stl和/或Sox9的抑制劑。
19. 權利要求18的方法，其中所述的抑制劑降低CS-GalNAcT-l和/ 或GalNT-l的酶活性。
20. 權利要求18的方法，其中所述的抑制劑降低CS-GalNAcT-l和/ 或GalNT-l的表達。
21. 權利要求18的方法，其中所述的抑制劑局部施用。
22. 權利要求18的方法，其中所述的抑制劑包含幹擾性RNA分子。
23. 權利要求18的方法，其中所述的抑制劑包含小分子。
24. 在患者中治療肌腱病變的方法，其包括降低患者腱組織中軟骨特 異性蛋白質的表達。
25. 權利要求24的方法，其包括抑制聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖 和/或II型膠原的表達。
26. 權利要求24的方法，其包括抑制Sox9的表達。
27. 權利要求24的方法，其包括抑制Sox9的活性。
28. 鑑定治療肌腱病變的物質的方法，其包括向需要治療的受試者施 用測試物質，並測量該物質抑制腱組織中涉及糖胺聚糖(GAG)生物合成 的酶的活性的能力。
29. 鑑定在治療肌腱病變中有用的化合物的方法，其包括向需要治療 的受試者施用測試化合物，並測量化合物抑制腱組織中涉及糖胺聚糖合成 的酶的活性的能力。
30. 根據權利要求29的方法，其進一步包括步驟(a) 提供至少一種選自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、石危酸乙醯肝 素(葡糖胺)3-0-磺基轉移酶1、 GalNT-l和Sox9的樣品成分；(b) 將樣品與測試化合物組合；(c) 測量樣品成分應答測試化合物的活性；以及(d)確定測試化合物是否抑制樣品成分的活性。
31. 化合物在製備治療肌腱病變的藥物中的用途，所述化合物降低軟 骨特異性蛋白聚糖的形成。
32. 根據權利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及軟骨合成的 酶或其它蛋白質的活性。
33. 根據權利要求32的用途，其中所述的化合物直接或間接抑制酶或 蛋白質的功能。
34. 根據權利要求32或33的用途，其中所述的化合物抑制酶或蛋白 質的表達。
35. 才艮據權利要求32至34中任意一項的用途，其中所述的酶選自 UDP-D-木糖:核心蛋白質P-D-木糖基轉移酶、Gal轉移酶、GlcA轉移酶、 GlcNAc轉移酶、磺基轉移酶、硫酸軟骨素合酶和硫酸乙醯肝素磺基轉移 酶。
36. 根據權利要求35的用途，其中所述的酶選自硫酸軟骨素N-乙醯氨 基半乳糖基轉移酶1(CS-GalNAcT-l)、硫酸軟骨素N-乙醯氨基半乳糖基轉 移酶2(CS-GalNAcT-2)、半乳糖胺多肽N-乙醯氨基半乳糖基轉移酶 1(GalNAcT-l)和硫酸乙醯肝素(葡糖胺)3-0-磺基轉移酶1(Hs3stl)。
37. 才艮據權利要求31的用途，其中所述的化合物降低軟骨特異性結構 蛋白質的表達。
38. 根據權利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及軟骨特異性 結構蛋白質表達的轉錄因子的活性。
39. 根據權利要求38的用途，其中所述的轉錄因子為Sox9。
40. 根據權利要求31至39中任意一項的用途，其中所述的蛋白聚糖 選自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、多配體蛋白聚糖-3和II型膠原。
41. 根據權利要求31至40中任意一項的用途，其中所述的肌腱病變 選自肌腱炎、腱炎、肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎、腱損傷、腱創傷、腱周 圍炎和paratenonitis。
42.根據權利要求31至41中任意一項的用途，其中向選自靈長類、 猴、齧齒動物、羊、兔、狗、豚鼠、馬、牛和貓的患者施用藥物。
全文摘要
本發明提供治療肌腱病變的方法。治療或預防的病症包括腱炎、肌腱炎、肌腱變性、腱圍炎、腱鞘炎、腱過度使用損傷和創傷、腱周圍炎、paratenonitis或其它腱變性病症。公開的治療方法包括向患者施用有效量的、涉及肌腱病變的腱中軟骨或纖維軟骨形成的分子的抑制劑來治療或預防腱變性病症、減緩腱退化、恢復腱的健康結構、刺激腱的再生、和/或維持腱的質量和/或品質。
文檔編號A61K48/00GK101432026SQ200780015676
公開日2009年5月13日 申請日期2007年3月2日 優先權日2006年3月3日
發明者J·M·阿查姆褒特, S·葉林斯基 申請人:惠氏公司