辣根過氧化物酶介導自由基引發體系及製備水凝膠的方法
2023-09-21 21:06:50 4
辣根過氧化物酶介導自由基引發體系及製備水凝膠的方法
【專利摘要】本發明涉及辣根過氧化物酶介導自由基引發體系及製備水凝膠的方法，引發體系由N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶和過氧化氫組成。採用N-羥基琥珀醯亞胺作為酶的底物，避免了使用生物毒性較大的乙醯丙酮。本發明製備方法通過調節三元引發體系的組分濃度比例，可以控制在室溫下50s～5min內引發單體聚合製備水凝膠，並可用於製備高強度的納米複合水凝膠，具有環境友好、成膠快速可控的優勢，在藥物控制釋放、酶固定化、組織工程等領域具有明顯的應用前景。
【專利說明】辣根過氧化物酶介導自由基引發體系及製備水凝膠的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及高分子【技術領域】，尤其是涉及一種辣根過氧化物酶介導自由基引發體系及利用該體系製備水凝膠的方法。
【背景技術】
[0002]自由基聚合反應常用於高分子聚合物生產、精細化工品製造中，是工業生產高分子產品的重要技術。自由基反應的第一步都是自由基引發。傳統的自由基引發方式主要有:熱引發；氧化還原引發；紫外光引發；高能輻射(如雷射、α射線、β射線、Υ射線、X射線輻照等)引發等。這些聚合引發方式或需要使用特殊設備並消耗大量能量，或需要使用某些有毒的引發劑，對生物體有害，而且可能影響自然環境，反應條件較為苛刻。
[0003]與傳統的自由基引發方式相比較，通過生物酶催化反應產生自由基是一種環境友好、反應條件溫和、高效、低能耗、操作簡便的自由基引發方式，是用於自由基聚合反應製備高分子材料的優越方法。
[0004]氧化還原酶可以催化電子轉移反應產生自由基，在水溶液中引發烯類單體的聚合。文獻報導，辣根過氧化物酶(EC1.11.1.7) / β - 二酮/過氧化氫三元酶介導自由基引發體系能引發親水性乙烯基單體(如丙烯醯胺)進行自由基聚合，或引發疏水性單體(如苯乙稀)進行細乳液聚合(Polym.Chem.,2012, 3,900-906 ；B1macromolecules, 2006, 7,2927-2930 ；Chem.Rev.，2001，101，3793-3818)。然而，該反應中會出現不可重現的、時間較長(45?360min)的誘導期，不利於實際應用。本課題組研究開發了一系列組分配比優化的辣根過氧化物酶/乙醯丙酮/過氧化氫三元引發體系並申請了中國專利。這類引發體系可以在室溫下快速^min內)引發自由基聚合，製備得到具有高強度、高催化性能的納米複合水凝膠(Chem.Commun.,2013,101，3793-3818)。在該體系中，以乙醯丙酮作為辣根過氧化物酶的底物，產生自由基引發聚合。然而，乙醯丙酮生物毒性較大，不利於其在生物材料中的應用。目前，不含乙醯丙酮的辣根過氧化物酶介導自由基聚合引發體系尚未見報導。
[0005]N-羥基琥珀醯亞胺是一種在生物學、合成化學中有廣泛應用的醯胺類化合物，其結構中含有活潑的氮羥基，可與抗原、抗體、核酸等共價結合，常用於醫藥中間體，合成多肽、抗生素等的前體以及腫瘤的診斷顯像和治療，生物相容性好。本課題組最近研究發現，N-羥基琥珀醯亞胺與辣根過氧化物酶、過氧化氫按一定濃度比例配製，可產生自由基引發單體進行聚合反應。該自由基引發體系能用於快速可控地製備水凝膠，有利於所製備的水凝膠在生物體內的應用，如在動脈栓塞中作為栓塞劑，或作為可注射的組織工程支架材料坐寸。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種基於N-羥基琥珀醯亞胺的辣根過氧化物酶介導的自由基聚合引發體系。
[0007]本發明的另一個目的是採用上述引發體系在水溶液中引發烯類單體進行聚合製備水凝膠的方法，該方法反應條件溫和，操作簡便，成膠快速且時間可控，並可用於製備高強度的納米複合水凝膠。
[0008]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0009]辣根過氧化物酶介導自由基引發體系，該體系為在室溫下以水為反應介質引發烯類單體進行自由基聚合的引發體系，包含N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶和過氧化氫。
[0010]過氧化氫和辣根過氧化物酶(300units/mg)的摩爾濃度比為25?960，同時滿足N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為2?29，引發體系中採用的N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾濃度不低於2.65mM，過氧化氫的摩爾濃度不低於0.66mM。
[0011]本發明的引發體系製備工藝簡單，可採用多種方式進行配製，可以將N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶、過氧化氫三者混合後直接使用；或者先將N-羥基琥珀醯亞胺和辣根過氧化物酶混合反應一段時間後，再與過氧化氫配合使用；或者先將N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫混合反應一段時間後，再與辣根過氧化物酶配合使用。
[0012]區別於現有技術所述的引發體系產生由乙醯丙酮衍生的碳中心自由基引發聚合的機理，本發明的引發體系具有新型的自由基引發機理。通過電子自旋共振(ESR)證明了本發明的引發體系中產生了由N-羥基琥珀醯亞胺衍生的氮氧自由基。在無自旋捕捉劑的情況下，本發明的三元引發體系(其中N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為29，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為278)產生的ESR掃描信號為氮氧自由基的9重峰，說明體系中產生了由N-羥基琥珀醯亞胺衍生的氮氧自由基從而引發聚合反應進行。
[0013]利用辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，將N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶與烯類單體的水溶液混合均勻，然後向其中加入過氧化氫，調節辣根過氧化物酶/N-羥基琥珀醯亞胺/過氧化氫三元引發體系的組分濃度比例，在室溫下控制在50s?5min內產生自由基引發單體聚合形成三維聚合物網絡，得到水凝膠。
[0014]辣根過氧化物酶/N-羥基琥珀醯亞胺/過氧化氫三元引發體系的組分濃度調整為:過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為25?960，並同時滿足N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為2?29，引發體系中採用的N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾濃度不低於2.65mM,過氧化氫的摩爾濃度不低於0.66mM。
[0015]所述的烯類單體選自水溶性的丙烯酸酯衍生物、丙烯醯胺衍生物或N-乙烯基吡咯烷酮中的至少一種；烯類單體的加入量佔反應原料總重量的5?15%，優選8?10%。
[0016]所述的水溶性的丙烯酸酯衍生物為甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)、丙烯酸羥丙酯(HPA)或聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯(PEGMA)，所述的丙烯醯胺衍生物為丙烯醯胺(AM)、N, N- 二甲基丙烯醯胺(DMAA)或N-異丙基丙烯醯胺(NIPA)。
[0017]反應物中還可以添加帶有兩個或者多個雙鍵的水溶性化合物作為交聯劑，包括N，N-亞甲基雙丙烯醯胺(BIS)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)或乙烯基修飾的蛋白質，所述的交聯劑用量佔反應原料總重量的0.3?5%。
[0018]反應物中還可以添加可水分散的無機納米材料製備高強度的納米複合水凝膠，所述的無機納米材料為納米二氧化娃或納米輕基磷灰石，優選平均粒徑10?40nm的納米二氧化矽。所述的無機納米材料的用量佔反應原料總重量的5?16%。
[0019]普通高分子水凝膠一般只能抵抗大約20?10kPa的壓縮強度而且易被壓碎。本發明製備的納米複合水凝膠能抵抗1300kPa左右的壓縮強度而且能恢復到原狀，具有優良的力學性能和生物相容性，可以應用於藥物控制釋放、酶固定化、組織工程等領域。
[0020]與現有技術相比，本發明的突出優點是:採用生物相容性好的N-羥基琥珀醯亞胺作為酶的底物，提供了一種新型的辣根過氧化物酶介導的自由基引發機理，避免了使用生物毒性較大的乙醯丙酮，有利於其在生物材料中的應用。本發明的另一突出優點是:通過調節辣根過氧化物酶/N-羥基琥珀醯亞胺/過氧化氫三元引發體系的組分濃度比例，能在室溫下使用較低的引發劑濃度(例如，N-羥基琥珀醯亞胺摩爾濃度為2.65mM,同時過氧化氫的摩爾濃度為0.66mM)快速可控地製備水凝膠。因而該方法在製備可注射水凝膠應用於生物學領域具有明顯的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為電子自旋共振檢測到的本發明自由基引發體系產生的自由基信號。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術方案，以下結合實例進一步說明本發明，但這些實例並不用來限制本發明。
[0023]實施例1
[0024]1)配製前驅液:取N，N_ 二甲基丙烯醯胺0.11?0.13g，交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.07?0.09g，去離子水1.6?1.7g加入樣品瓶中，用旋渦混合器混合均勻。
[0025]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺(λ 66mg,辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L (反應體系中Ν-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為4.35，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為25，過氧化氫最終摩爾濃度為0.66mM)，快速混勻同時用秒表計時，密閉靜置得到淺棕紅色透明水凝膠，成膠時間3minl0so
[0026]實施例2
[0027]1)配製前驅液:步驟同實施例1。
[0028]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺0.61mg，辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L (反應體系中Ν-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為2，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為25，過氧化氫最終摩爾濃度為1.32mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺棕紅色透明水凝膠，成膠時間2min20s。
[0029]實施例3
[0030]1)配製前驅液:步驟同實施例1。
[0031]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺1.77mg，辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L (反應體系中Ν-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為5.84，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為25，過氧化氫最終摩爾濃度為1.32mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺棕紅色透明水凝膠，成膠時間lmin40s。
[0032]實施例4
[0033]1)配製前驅液:步驟同實施例1。
[0034]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺8.02mg，辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L (反應體系中N-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為13.23，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為50，過氧化氫最終摩爾濃度為2.63mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺棕紅色透明水凝膠，成膠時間50s。
[0035]實施例5
[0036]I)配製前驅液:取N，N-二甲基丙烯醯胺0.09?0.llg，交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)0.05?0.07g，去離子水1.62?1.72g加入樣品瓶中，用旋渦混合器混合均勻。
[0037]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺8.5mg,辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L(反應體系中N-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為5.84，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為480，過氧化氫最終摩爾濃度為6.32mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺黃色透明水凝膠，成膠時間2min30s。
[0038]實施例6
[0039]I)配製前驅液:步驟同實施例5。
[0040]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺8.5mg,辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L(反應體系中N-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為5.84，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為960，過氧化氫最終摩爾濃度為6.32mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺黃色透明水凝膠，成膠時間3min40s。
[0041]實施例7
[0042]I)配製前驅液:步驟同實施例5。
[0043]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺5.34mg，辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L (反應體系中N-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為3.67，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為480，過氧化氫最終摩爾濃度為6.32mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺黃色透明水凝膠，成膠時間5min。
[0044]實施例8
[0045]I)配製前驅液:步驟同實施例5。
[0046]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺7.04mg,辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L (反應體系中N-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為4.84，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為480，過氧化氫最終摩爾濃度為6.32mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺黃色透明水凝膠，成膠時間3min。
[0047]實施例9
[0048]I)配製前驅液:步驟同實施例5。
[0049]2)水凝膠的製備:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺42.17mg,辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L,過氧化氫水溶液50 μ L(反應體系中N-輕基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為29，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為480，過氧化氫最終摩爾濃度為6.32mM)，快速混勻，密閉靜置得到淺黃色透明水凝膠，成膠時間2min25s。
[0050]實施例10
[0051]I)配製前驅液:取N，N- 二甲基丙烯醯胺0.30g,納米二氧化矽水分散液(21wt% ) 1.533g，聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量250)6.77mg加入樣品瓶中，用旋渦混合器混合均勻。
[0052]2)水凝膠的製備及性能測試:在上述前驅液中依次加入N-羥基琥珀醯亞胺10.33mg,辣根過氧化物酶濃縮液100 μ L，過氧化氫水溶液50 μ L(反應體系中N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為7.1，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為480)，快速混勻，密閉靜置得到淺黃色透明水凝膠(含16wt%納米二氧化矽)。上述水凝膠製成圓柱狀樣品(直徑15.7mm，高9.0mm)後，使用電子萬能試驗機測得壓縮強度為1350kPa (壓縮應變99% )，測試後可恢復原狀。
[0053]如圖1所示，在無自旋捕捉劑的情況下，本發明的三元引發體系(其中N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為29，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為278)產生的ESR掃描信號為氮氧自由基的9重峰，說明體系中產生了由N-羥基琥珀醯亞胺衍生的氮氧自由基從而引發聚合反應進行。
[0054]實施例11
[0055]利用辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，該方法將N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶與烯類單體的水溶液混合均勻，然後向其中加入過氧化氫，調節辣根過氧化物酶/N-羥基琥珀醯亞胺/過氧化氫三元弓I發體系的組分濃度比例，其中，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為25，N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為4，引發體系中採用的N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾濃度為2.65mM，過氧化氫的摩爾濃度為0.66禮，採用的烯類單體為聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯，加入量佔反應原料總重量的5%，另外，在水凝膠的製備過程中還可以加入N，N-亞甲基雙丙烯醯胺，交聯劑用量佔反應原料總重量的0.3%。
[0056]在室溫下控制在4minl0s內產生自由基引發單體聚合形成三維聚合物網絡，得到水凝膠。
[0057]實施例12
[0058]利用辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，該方法將N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶與烯類單體的水溶液混合均勻，然後向其中加入過氧化氫，調節辣根過氧化物酶/N-羥基琥珀醯亞胺/過氧化氫三元引發體系的組分濃度比例，過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為960，並且N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為29，引發體系中採用的N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾濃度不低於19.1mM,過氧化氫的摩爾濃度不低於0.66mM。選用的烯類單體為N，N-二甲基丙烯醯胺，加入量佔反應原料總重量的15%，另外，在水凝膠的製備過程中還可以加入平均粒徑為10?40nm納米二氧化矽製備高強度的納米複合水凝膠，用量佔反應原料總重量的16%。在室溫下控制在5min內產生自由基引發單體聚合形成三維聚合物網絡，得到水凝膠。
[0059]以上對本發明做了示例性的描述，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制。其他的任何未背離本發明的原理實質下所作的修改、替換、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.辣根過氧化物酶介導自由基引發體系，其特徵在於，該自由基引發體系為在室溫下以水為反應介質引發烯類單體進行自由基聚合的引發體系，包含N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶和過氧化氫，所述的過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為25?960，所述的N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為2?29。
2.根據權利要求1所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系，其特徵在於，所述的N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾濃度不低於2.65mM,過氧化氫的摩爾濃度不低於0.66mM。
3.根據權利要求1所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系，其特徵在於，所述的自由基引發體系為N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶、過氧化氫直接混合得到自由基聚合的引發體系； 或是將N-羥基琥珀醯亞胺和辣根過氧化物酶混合後，再加入過氧化氫配合使用得到自由基聚合的引發體系； 或是將N-羥基琥珀醯亞胺和或過氧化氫混合後，再加入辣根過氧化物酶配合使用得到自由基聚合的引發體系。
4.利用權利要求1-3中任一項所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，其特徵在於，該方法將N-羥基琥珀醯亞胺、辣根過氧化物酶與烯類單體的水溶液混合均勻，然後向其中加入過氧化氫，調節辣根過氧化物酶/N-羥基琥珀醯亞胺/過氧化氫三元弓I發體系的組分濃度比例，在室溫下控制在50s?5min內產生自由基引發單體聚合形成三維聚合物網絡，得到水凝膠。
5.根據權利要求4所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，其特徵在於，所述的過氧化氫和辣根過氧化物酶的摩爾濃度比為25?960，並且N-羥基琥珀醯亞胺和過氧化氫的摩爾濃度比為2?29，引發體系中採用的N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾濃度不低於2.65mM,過氧化氫的摩爾濃度不低於0.66mM。
6.根據權利要求4所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，其特徵在於，所述的烯類單體選自水溶性的丙烯酸酯衍生物、丙烯醯胺衍生物或N-乙烯基吡咯烷酮中的至少一種:烯類單體的加入量佔反應原料總重量的5?15%，優選8?10%。
7.根據權利要求6所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，其特徵在於，所述的水溶性的丙烯酸酯衍生物為甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯或聚乙二醇甲基丙烯酸甲酯；所述的丙烯醯胺衍生物為丙烯醯胺、N，N-二甲基丙烯醯胺或N-異丙基丙烯醯胺。
8.根據權利要求4所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，其特徵在於，在水凝膠的製備過程中還可以加入帶有兩個或者多個雙鍵的水溶性化合物作為交聯劑，包括N，N-亞甲基雙丙烯醯胺、聚乙二醇二丙烯酸酯或乙烯基修飾的蛋白質；所述的交聯劑用量佔反應原料總重量的0.3?5%。
9.根據權利要求4所述的辣根過氧化物酶介導自由基引發體系製備水凝膠的方法，其特徵在於，在水凝膠的製備過程中還可以加入可水分散的無機納米材料製備高強度的納米複合水凝膠，所述的無機納米材料為納米二氧化矽或納米羥基磷灰石，優選平均粒徑為10?40nm的納米二氧化矽；所述的無機納米材料的用量佔反應原料總重量的5?16%。
【文檔編號】C12P13/02GK104450814SQ201310425096
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】蘇騰, 王啟剛 申請人:同濟大學