重組二聚化人尿胰蛋白酶抑制劑、其製備方法及其應用的製作方法

2023-09-21 21:04:25 3

專利名稱：重組二聚化人尿胰蛋白酶抑制劑、其製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地，本發明涉及一種具有與天然人尿胰蛋白酶抑制劑類似或更高生物活性的重組人尿胰蛋白酶抑制劑二聚體、其製備方法及應用。
背景技術：
人尿膜蛋白酶抑制劑(human Urinary Trypsin Inhibitor, hUTI),也稱為烏司他丁或尿抑素，是含有兩個Kunitz結構域的蛋白酶抑制劑類的糖蛋白。hUTI存在於正常人的尿液和血液中，分子量約為40kD。hUTI具有多種生理活性，如對絲氨酸蛋白酶家族的抑制作用，其中絲氨酸蛋白酶家族包括胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶、組織蛋白酶-G和白細胞彈性蛋白酶。hUTI還具有免疫調節作用，可下調促炎症細胞因子的釋放，例如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-1 (IL-1)和白介素(IL_6)(參見Park等，J Korean Med Sci, 25 :128_34，2010 ;Sato 等，Jpn J Thorac Cardiovasc Surg, 48 428-34,2000 ;Park 等，Korean J Anesthesiol, 58 334-37,2010 ；Inoue 等，Expert OpinInvestig Drugs, 19 513-20 2010 ;Yang 等，Biologicals 38:552-6,2010 ;Pugia 等，ClinChem Lab Med43 :1-16，2005 ;Pugia 等，Adv Clin Chem 44:223_245，2007)。此外，hUTI還通過中和I3DGF-D (PDGF-DD) /PDGF-BBR活性二聚體而幹擾其介導的信號通路，進而抑制惡性間皮瘤細胞的轉移，通過抑制腫瘤細胞的增殖和下調CXCL4和MMP-9蛋白的表達，可顯著降低乳腺癌移植裸鼠模型中的乳腺腫瘤的生長(參見Yaguchi等，Cancer Lett 288 214-18,2010 ;Sun 等，J Int Med Res 38 :967_76，2010 ;Kobayashi 等，Biol Chem 384 749-754，2003)，提示hUTI在腫瘤治療方面具有潛在用途。此外，進一步研究證實hUTI可抑制多種組織中胰蛋白酶和其它蛋白酶的水解活性，並發揮局部或全身抗炎作用(參見Bae 等，Inflammation35 176-82, 2012 ;Takano 等，Lab Invest 89 833-9, 2009 ;Inoue 等，J Clin Biochem Nutr43 :139-142，2008 ;Ueki 等，J Biosci Bioeng 104:315-20,2007;Molor-Erdene 等，Thromb Haemost 94 136-45, 2005 ；Hirose 等，Biol Pharm Bull 21 651-56,1998 ;Wu等，Hepatobiliary Pancreat Dis Int 8 :53_8,2009)。在對實施全身麻酉卒的高危手術患者體內靜脈注射hUTI，可以改善血液微循環，緩解炎症反應。此外，hUTI還可用於多種急性炎症的治療，包括急性胰腺炎、系統性炎症反應綜合症、急性循環衰竭、彌散性血管內凝血(DIC)和多器官功能障礙症候群(參見Jong In Han,Korean J Anesthesiol,58 325-327,2010)。動物模型研究顯示， hUTI對內毒素介導的休克反應以及肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用(參見 Inoue 等，Expert Opin Investig Drugs, 19 :513_20，2010 ;Wu 等，Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 8 :53_58, 2009)。hUTI 還在其它多種肺,肝臟,心臟,腎臟病感染模型中發揮作用(參見Bao等，Eur J Pharmacol 603 :114_9，2009 ;Kim等，Cardiology I14:264_70，2009 ;Matsuo 等，Thromb Res 52 :237_45，1988 ;Saitoh 等，Anesth Analg 89 :1565-9,1999 ；Mastumoto 等，Masui 38 :531_9，1989 ；Aoike 等，Nephron52 368-9,1989)。在一項臨床研究中，hUTI聯合胸腺素α -1可增加重度膿毒症患者的存活率(參見 Li 等，JIntensive Care Med, 24 =47-53,2009) 另一項臨床研究中，hUTI 對治療由SARS病毒引起的急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫症(ARDS)顯示有效(參見美國專利 US 7，470，666)。早在1985年，日本Mochida公司從人尿中提取的hUTI就獲得上市許可，商品名"Miraclid"。其主要適應症為胰腺炎和休克所致的急性循環衰竭。其它類似的產品包括中國的廣州天普生化醫藥公司(Techpool)生產的「注射用尿抑素」、韓國Han Lim製藥公司生產的"Ulistin"、韓國Kolon製藥公司生產的"Ustatin"，和韓國Yu Young製藥公司生產的"Statin"。目前，臨床上hUTI被廣泛用於治療急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性發作、急性循環衰竭、彌散性血管內凝血(DIC)、腫瘤、休克和外科手術中輔助用藥，防治順鉬化療時對腎功能的損失、AIDS的輔助治療以及先兆流產的預防和治療等。目前，市場上商品化的hUTI製劑產品都從人尿中提取，但作為從人尿中提取的一類藥物，如何避免病毒汙染和保證產品的質量穩定性是很大的技術難題，因檢測方法及病毒滅活技術的局限性以及一些不可預知的新致病病毒感染時有發生，並不能完全杜絕尿源性產品發生病毒汙染的可能性。此外，尿源hUTI還存在原料來源有限、採集困難及純化過程複雜的問題。目前，尿源hUTI雖然在適應症上取得了突破，並在中國、日本、韓國獲準上市，但在美國和歐洲等發達國家仍不允許動物提取的成分作為藥品進行臨床試驗和最終上市。相比而言，重組hUTI在其純度、抗原性、安全性、無自身尿源性病毒感染等方面具有尿源hUTI無法比擬的優點，展示出廣闊的醫用前景。因此，用基因重組技術來獲得大量高活性hUTI蛋白是較好的選擇,而迄今世界上尚未有重組hUTI藥品上市。

尿胰蛋白酶抑制劑被用作治療性蛋白藥物，必備的條件是要有正確的三維構像，有生理活性和無抗原性應答。對於用基因重組技術製備出來的蛋白，宿主在生產過程中應包括糖基化和二硫鍵形成，以及其他翻譯後修飾過程。重組製備藥用rhUTI需考慮上述問題。隨著基因重組技術的廣泛應用，採用酵母表達系統，純化的rhUTI在體外具有抑制胰蛋白酶的活性。德國拜耳公司(參見美國專利US 5,407,915)用啤酒酵母表達rhUTI蛋白具有體外活性，但其N-端有嚴重的不均一性問題60% hUTI具有天然N-端，而40% N-端少一個丙氨酸(Ala)。此外，酵母表達的重組rhUTI蛋白，其表達量很低，目前報導的最高產量僅為 55mg/L (參見 Jian-qiu Wang 等，Protein Expr Purif, 60 :127-31, 2008 ;美國專利 US5，407，915)。此外，酵母表達的rhUTI蛋白易產生不同於天然蛋白的翻譯後修飾過程，可能導致體外活性的降低和/或其它副作用，例如誘發免疫反應。之後，有許多研究都表明，細菌表達的rhUTI同樣具有抑制胰蛋白酶的作用(參見Brinkmann T等，J Biol Chem, 272 11171-11175，1997)，但原核系統對蛋白沒有剪切及加工功能，其表達的蛋白在結構與活性等方面與天然蛋白有較大差異，同時也存在產量太低的問題。因此，酵母或大腸桿菌都不是重組 rhUTI 的理想表達系統(參見 Brooks SA, Mol Biotechnol，28 :241_55，2004)。事實上,工業上僅有少數治療性蛋白藥物,如白蛋白(Recombumin ，由Novozymes公司生產)和快速起效胰島素類似物(Humalog ，由Eli Lilly公司生產)因翻譯後修飾過程簡單，選用酵母作為表達系統。現有技術中，雖有一些採用酵母系統表達rhUTI的研究報導，但是一直沒有rhUTI規模化生產和動物模型試驗方面的研究數據被公開。具有完善翻譯後修飾功能是哺乳動物細胞被選作大多數生物藥表達宿主的主因。總體來說，由哺乳動物細胞表達的重組蛋白具有正確的三維摺疊構象以及類似於天然蛋白分子的糖基化修飾。其中，中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary Cell7CHO)是用於真核生物外源基因表達最為成功的宿主細胞，已有越來越多的藥用蛋白在其中獲得了高效表達，很多藥物已投放市場，如EPO、G-CSF等。與其它表達系統相比，它具有許多優點(1)準確的翻譯後修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然蛋白分子；(2)表達產物能胞外分泌，便於分離純化；(3)具有外源基因的高效擴增和表達能力；(4)有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可進行懸浮培養或在無血清培養基中高密度生長，培養體積能達到1000L以上；(5) CHO細胞屬於成纖維細胞，很少分泌內源蛋白，有利於外源蛋白的分離純化。然而，有報導稱由中國倉鼠卵巢細胞表達的rhUTI會產生大量凝集，導致活性大部分喪失。其蛋白凝集是由蛋白間非天然二硫鍵之間的共價交叉連接所致(參見 Seefeldt MB 等，Pr`otein Sci, 13 =2639-50,2004) 在健康受試者中，靜脈注射(1. v.)hUTI後的O至3小時，其血漿半衰期約為33分鐘，約佔90%的注射仙11已被清除。在之後的4個小時，此階段清除速率放緩，其半衰期約為2小時。在注射7小時後，血漿中殘留的hUTI僅剩1% (參見Jonsson-Berling等，Scand J Clin Lab Invest，51 :549_57，1991)。對輸注hUTI的大鼠進行藥代動力學及組織學分布研究顯示，腎臟是hUTI主要的降解和排洩器官。此外，採用免疫組化的方法，觀察到hUTI在人正常組織以及病變組織中分布和定位於腎小球(參見Yoshida等，Cancer，64 860-9，1989)。雖然hUTI在血漿中的清除機制尚不明確，腎臟應是其主要的分解代謝器官。由於hUTI的體內循環半衰期較短，且hUTI在使用過程中安全性好，副作用少，目前國內報導的諸多應用文獻中，僅有幾例出現皮疹，未出現過敏性休克和重要臟器損害。市售hUTI的推薦臨床使用劑量為5 20萬單位，每天I 3次。在臨床應用中，證實隨著hUTI劑量的加大，其療效更顯著，且無明顯副作用。這使得可以開發其長效類似物，以減少給藥次數，降低藥物在體內的波動，提高患者的依從性。為了延長hUTI的體內循環半衰期，可通過增加hUTI的分子量，來減緩腎臟的清除作用。該策略被應用於多種長效製劑的開發，例如增加EPO ( Aranesp^由Amgen公司研發)的N-糖基化位點，或將PEG分子連接於G-CSF ( Neulasta*,由 Amgen 公司研發)。IgG類的免疫球蛋白是人類血液中最豐富的蛋白質。它們的半衰期可高達21天，而Fe片段是IgG保持體內較長半衰期的主要原因，同時具有穩定蛋白的作用。重組hUTI在其純度、抗原性、安全性、無自身尿源性病毒感染等方面具有尿源hUTI無法比擬的優點，展示出良好的醫用前景。但目前仍存在rhUTI表達量低、體內半衰期短以及活性差等技術問題。

發明內容
本發明旨在提供一種重組二聚化hUTI蛋白、其製備方法及應用，以解決現有技術中rhUTI表達量低、體內半衰期短以及活性差的技術問題。為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種重組二聚化hUTI蛋白。該重組二聚化hUTI蛋白從N端到C端依次包含人UT1、肽接頭和人IgG Fe變體的胺基酸殘基序列，其中，人IgG Fe變體選自如下組(i)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域；(ii)含有Ser228Pro和heu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2和CH3區域；(iii)含有 Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區、CH2 和 CH3 區域。進一步地，肽接頭含有2-20個胺基酸殘基，且肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的胺基酸殘基。進一步地，肽接頭的胺基酸殘基序列如SEQ ID NO : 7所示。進一步地，重組二聚化hUTI蛋白的胺基酸殘基序列如SEQ ID NO :2、4或6所示。進一步地，重組二聚化hUTI蛋白的胺基酸殘基序列是去除了 I到19位胺基酸殘基的hUTI前導肽之後的SEQ ID NO :2、4或6所示的胺基酸序列。根據本發明的另一方面，提供了一種編碼上述重組二聚化hUTI蛋白的DNA序列。進一步地,該DNA序列具有SEQ ID NO :1、3或5所示的DNA序列。根據本發明的再一方面,提供一種載體,該載體包含上述DNA序列。根據本發明的再一方面，提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含上述載體。進一步地，宿主細胞是CHO的衍生細胞株，即包含上述載體的CHO細胞株。根據本發明的再一方面，提供一種藥物組合物，該藥物組合物包括藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及有效量的上述重組二聚化hUTI蛋白。根據本發明的再一方面，提供一種上述重組二聚化hUTI蛋白的製備方法，該方法是米用上述宿主細胞製備而來。

根據本發明的又一方面，上述重組二聚化hUTI蛋白在製備用於治療腫瘤、急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性發作、急性循環衰竭、彌散性血管內凝血、多器官功能性障礙綜症、系統炎症反應綜合症、休克的藥物，外科手術中輔助用藥，改善血液微循環、緩解炎症、防治順鉬化療時對腎功能的損失、AIDS的輔助治療以及先兆流產的預防和治療的藥物中的應用。以下具體介紹本

發明內容
Fe 元件Fe元件來自免疫球蛋白的Fe區域，Fe在消滅病原體的免疫防禦中具有重要作用。IgG的效應子功能由Fe介導，通過兩種主要機制(I)與細胞表面Fe受體(FcyRs)的結合，通過抗體依賴性細胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補體成分Cl的Clq部分的結合，引發依賴於補體的細胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3能有效的結合Fe Y Rs0 IgG4與Fe Y Rs的結合親和力比IgGl和IgG3的低一個數量級，而IgG2與Fe YRs的結合低得難以測定。人IgGl和IgG3還能有效地結合Clq，並激活補體級聯反應。人IgG2對補體的固定很弱，而IgG4表現極端缺乏激活補體級聯的能力(參見Jefferis R等，Immunol Rev，163 :59_76，1998)。對於醫療用途而言，重組二聚化蛋白的Fe區域必須不會介導效應子功能而裂解或除去這些細胞。因此，hUT1-L-Fc的Fe區域必須是非裂解性的，即在結合Fe Y Rs和Clq而觸發效應子功能方面，Fe最好是無活性的。顯然，沒有一種天然的IgG同種型適合產生hUT1-L-Fc重組二聚化蛋白。為了得到非裂解性的Fe，必須使天然Fe區域中的一些胺基酸突變，以減少其效應子功能。通過比較人和鼠的IgG同種型的胺基酸序列，CH2區域氨基末端附近的Fe部分顯示在IgG Fe與Fe Y Rs的結合中起作用。基因工程抗體已經證明在234位至237位基序的重要性 Duncan AR 等，Nature, 1988, 332 :563_564)。按 Kabat 等人(參見 Sequences ofProteins of Immunological Interest,第 5 版，United States Department of Healthand Human Services, 1991)所述的EU編號體系將胺基酸殘基編號。在四種人IgG同種型中，IgGl和IgG3%FcyRs的結合最好，且具有相同的序列Leu234-Leu_Gly-Gly237 (圖1僅顯示了 IgGl)。在以低親和力與FcyRs結合的IgG4中，其序列含有單個胺基酸取代，Phe取代234位的Leu。在不結合FcyRs的IgG2中，兩個取代和一個缺失形成Val234-Ala-Gly237 (圖1)。為了減少Fe與Fe Y Rs的結合和ADCC活性，用Ala替代IgG4中的 Leu235(參見 Hutchins JT 等，Proc Natl Acad Sci USA，92 :11980_11984，1995)。IgGl抗體內的Glu233-Leu-Leu235序列曾被用IgG2中的Pro233-Val_Ala235相關序列來替換。這種改變使IgGl變體在小鼠中失去了透過Fe Y R-介導除去靶點細胞的能力(參見Isaacs JD 等，J Immunol,161 :3862_386，1998)。對於Fe Y R與Clq結合非常重要的第二部分位於人IgG的CH2區域羧基端附近(Duncan AR等，Nature，332 :738_740，1988)。在四種人IgG同種型中，這部分中僅有一個位點顯示取代用IgGU IgG2和IgG3中的Ala330和Pro331替代IgG4中的Ser330和Ser331 (圖1)。Ser330的存在不影響Fe Y R與Clq的結合。用Ser替代Pro331使IgGl失去了與Clq的結合親和力，而用Pro替代Ser331部分保留了 IgG4補體固定活性(參見TaoMH 等，J ExpMed, 178 :661_667，1993 ；Xu Y 等，J Biol Chem, 269 :3469_3474，1994)。肽接頭

連接肽的長度對重組二聚化蛋白的活性非常重要。已有人報導了促紅細胞生成素(EPO)衍生物(如二聚物)，與EPO單體相比，含有2個完整的EPO區域(相隔3到7個胺基酸肽接頭)的重組二聚化蛋白表現出減弱的活性(參見Qiu H等，J Biol Chem,273 :11173-11176，1998)。然而，當這兩個EPO區域間的肽接頭的長度為17個胺基酸時，二聚體EPO分子的體外和體內生物活性明顯提高(Sytkowski AJ等，J Biol Chem, 274 24773-24778，1999 ;美國專利No. 6，187，564)。這可能解釋為重組二聚化蛋白兩部分間增加的連接肽，使該分子的兩部分能分別行使其功能(參見Ashkenazi A等，Curr Opin inImmunol,9 :195-200,1997)。本發明人經過長期而深入的研究，首次設計了一種獨特的絞鏈區肽接頭來降低空間位阻效應，可以製得hUTI的C端與Fe變體偶聯的重組二聚化蛋白，中間有柔軟的肽接頭。此重組二聚化蛋白不僅不會導致hUTI的功能喪失，反而能夠維持、甚至提高hUT1-Fc重組二聚化蛋白的生物活性。優選肽接頭的胺基酸殘基序列為GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0此外，本發明還發現，在hUTI和人IgG Fe變體間添加的肽接頭以兩種方式提高hUT1-L-VFc的體外生物活性(I)使Fe區域遠離hUTI上的結構域，和(2)使一個hUTI遠離另一個hUTI的結構域，從而降低空間位阻效應。且人的IgG Fe變體在CH2區域在228、234、235、331位點含有胺基酸突變，從而降低Fe的效應子功能。重組二聚化蛋白及其製備方法本發明重組二聚化蛋白由CHO細胞生產，經標準化純化程序製備。根據本發明所述的核苷酸序列，本技術領域人員可方便地用各種已知方法製得本發明的編碼核酸。這些方法例如但不限於PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實驗指南》。作為本發明的一種實施方式，通過分段合成核苷酸序列再進行基因亞克隆拼接的方法來構建本發明的全長基因編碼核酸序列。
本發明還提供了一種表達載體，包含編碼本發明的重組二聚化蛋白的DNA序列以及與之操作性相連的表達調控序列。所述的「操作性相連」或「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調節或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它就是可操作地連於編碼序列。表達載體可採用市售的例如但不限於pcDNA3、pIRES、pDR、pBK、pSP0RT等可用於真核細胞系統表達的載體。本領域技術人員可以根據宿主細胞來選擇合適的表達載體。根據已知空載表達載體的酶切圖譜，本領域技術人員可按照常規方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發明的重組二聚化蛋白的DNA編碼序列插入合適的限制性位點，獲得本發明的重組表達載體。本發明還提供了表達本發明重組二聚化蛋白的宿主細胞，其中含有本發明的重組二聚化蛋白的DNA編碼序列。所述的宿主細胞優選的是真核細胞，例如但不限於CHO，COS細胞，293細胞，RSF細胞等。作為本發明的優選方式，所述的細胞是CHO細胞，其可較佳地表達本發明的重組二聚化蛋白，可獲得生理活性良好，穩定性良好的重組二聚化蛋白。
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本發明還提供一種用重組DNA技術製備本發明重組二聚化蛋白的方法，其步驟包括I)提供編碼重組二聚化蛋白的核酸序列；2)將I)的核酸序列插入到合適的表達載體，獲得重組表達載體；3)將2)的重組表達載體導入合適的宿主細胞；4)在適合表達的條件下培養宿主細胞；5)篩選高表達的穩定細胞系；6)收集上清液，並純化重組二聚化蛋白產物。將所述編碼序列導入宿主細胞可採用本領域的多種已知技術，例如但不限於磷酸鈣沉澱，原生質體融合，脂質體轉染，電穿孔，微注射，反轉錄法，噬菌體轉導法，鹼金屬離子法。有關宿主細胞的培養和表達可參見Olander RM Dev Biol Stand 1996 ;86 :338。可通過離心去除懸浮液中的細胞和殘渣，收集上清液。可通過瓊脂糖凝膠電泳技術進行鑑定。可將上述製備獲得的重組二聚化蛋白純化為基本均一的性質，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當重組蛋白為分泌表達時，可以採用商品化的超濾膜來分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產品，首先將表達上清濃縮。濃縮液可採用凝膠層析的方法進一步加以純化，或採用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質可為瓊脂糖、葡聚糖、聚醯胺等常用於蛋白純化的基質。Q-或SP-基團是較為理想的離子交換基團。最後，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產物進一步精製純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達到基本均一。可利用含有所述重組二聚化蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對表達的重組二聚化蛋白進行純化。根據所使用的親和柱的特性，可利用常規的方法，如高鹽緩衝液、改變PH等方法洗脫結合在親和柱上的融合性多肽。可選擇地，所述的重組二聚化蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個或多個多肽片段，作為蛋白標籤。任何合適的標籤都可以用於本發明。例如，所述的標籤可以是FLAG，HA, c-Myc,6-His或8_His等。這些標籤可用於對重組二聚化蛋白進行純化。藥物組合物本發明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量(如O. 000001-90wt% ;較佳的O. 1-5(^七％;更佳的，5_40wt%)的本發明的重組二聚化蛋白，以及藥學上可接受的載體。通常，可將有效量的本發明重組二聚化蛋白配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中PH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。術語「有效量」或「有效劑量」是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。「藥學上可接受的」的成分是適用於人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語「藥學上可接受的載體」指用於治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。藥學上可接受的載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物製劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量。本發明的藥物製劑還可製成緩釋製劑。本發明所述的重組二聚化蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗。所述的因素包括但不限於所述的重組二聚化蛋白的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。根據本發明一種典型的實施方式，重組二聚化hUTI蛋白從N端到C端依次含有人UT1、肽接頭和人Ig G Fe變體(表示為hUT1-L-vFc)。其中，IgG Fe變體是無裂解性的，且與天然IgG Fe相比含有胺基酸突變。較佳地，其中人Ig Fe變體含有選自以下的變體絞鏈區、CH2和CH3區域(A)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgGl ； (B)含有 Pro331Ser 突變的人 IgG2 ;和(C)含有 Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變的人IgG4。較佳地，使用約2-20個胺基酸長度的、含有以下2種或多種胺基酸構成的柔性肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸，如本發明一實施例中所公開的優選序列為SEQ ID 7 (GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGly GlySerGlyGlyGlyGlySer)。優選地，本發明所述的重組二聚化hUTI蛋白的胺基酸序列如SEQ ID N0:2、4或6所示，其成熟蛋白為去除了 hUTI前導肽(I到19位胺基酸殘基)之後SEQ ID N0:2、4或6所示的胺基酸序列，其中，人Ig Fe變體含有絞鏈區、CH2和CH3區域。其CH2區域在228、234、235和331位(由EU編號體系確定的位置)含有胺基酸突變，從而降低Fe的效應子功倉泛。根據本發明一種典型的實施方式，提供一種編碼上述重組二聚化hUTI蛋白的DNA序列。優選地，該DNA序列具有SEQ ID NO :1、3或5所示的DNA序列。根據本發明一種典型的實施方式，提供一種載體，該載體包含上述DNA序列。根據本發明一種典型的實施方式，提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含上述載體。優選地，宿主細胞是CHO的衍生細胞株。
根據本發明一種典型的實施方式，本發明的藥物組合物包括藥學上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發明所述的重組二聚化hUTI蛋白。本發明的重組二聚化hUTI蛋白一般地應用於急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性發作、急性循環衰竭、腫瘤、休克和外科手術中輔助用藥，防治順鉬化療時對腎功能的損失、AIDS的輔助治療以及先兆流產的預防和治療等。根據本發明一種典型的實施方式，提供一種從哺乳動物細胞系如CHO衍生的細胞系製備或生產這種重組二聚化hUTI蛋白的方法。培養轉染的細胞系，使得重組二聚化hUTI蛋白在其生長培養基中在24小時期間以超過100 (最佳的為300) yg/io6(百萬)個細胞的水平下表達。這些hUT1-L-vFc 二聚體蛋白顯示出高度的體外和體內生物活性和延長的體內血清半衰期而無不良副作用，從而改善了藥物動力學和藥效，進而降低了實現類似藥效所需的劑量和注射次數。此外，本發明所公開的重組二聚化hUTI蛋白的製備方法，表達產量高且因與IgGFe變體的偶聯,所形成的重組二聚化蛋白可以通過Protein A親和層析得到高效便捷的純化。本發明一優選實施例中，將CHO細胞株在IOOmL搖瓶中培養15天，其表達的重組二聚化蛋白累積產量為3g/L(圖6)。在細胞培養的第5天至第11天間，活細胞數目最多約為6 X IO6個/mL，在此條件下，分泌率測定為50 μ g/106個細胞/24小時。本發明的重組二聚化hUTI蛋白及其製備方法的優點概括如下1. Fe與hUTI偶聯形成的二聚體蛋白，在CHO細胞中具有很高的表達量，比hUTI在CHO細胞中表達量高30倍，比在酵母細胞中的表達量高60倍。2.純化工藝 高效便捷、大大降低生產成本。3.本發明所表達的重組二聚化hUTI蛋白與天然hUTI具有類似的體外生物學活性和高出38倍的體內生物學活性(摩爾比活性)。4.本發明所表達的重組二聚化hUTI蛋白體內循環半衰期延長，血清中藥物濃度波動的減少，安全性提高，耐受性的改善，降低注射頻率而提高患者的生活質量。應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。


圖1顯示了人IgGl、IgG2、IgG4和它們變體的絞鏈區和CH2區域的胺基酸序列的比對。比較這三部分胺基酸序列胺基酸區域228、234-237和330-331。這些變體的胺基酸突變以粗斜體顯示。胺基酸殘基編號是根據EU編號體系標定。圖2顯示了在PCDNA3表達載體內HindII1-EcoRI片段的hUT1-L-vFc Y 2的核苷酸序列(同SEQ ID 1)及推導的胺基酸序列(同SEQ ID 2)。hUTI由信號肽(1_19)、成熟hUTI蛋白(20-162)構成。成熟的重組二聚化蛋白含有hUTI (20-162)、肽接頭(163-178)和 Fe Y 2 變體(179-401)。圖3顯示了在PCDNA3表達載體內HindII1-EcoRI片段的hUT1-L-vFc Y 4的核苷酸序列(同SEQ ID 3)及推導的胺基酸序列(同SEQ ID 4)。hUTI由信號肽(1_19)、成熟hUTI蛋白(20-162)構成。成熟的重組二聚化蛋白含有hUTI (20-162)、肽接頭(163-178)和 Fe Y 4 變體(179-407)。圖4顯示了在PCDNA3表達載體內HindII1-EcoRI片段的hUT1-L-vFc Y I的核苷酸序列(同SEQ ID 5)及推導的胺基酸序列(同SEQ ID 6)。hUTI由信號肽(1-19)、成熟hUTI蛋白(20-162)構成。成熟的重組二聚化蛋白含有hUTI (20-162)、肽接頭(163-178)和 Fe Y I 變體(179-405)。圖5顯示了所構建hUT1-L-vFc重組二聚化蛋白基因的真核表達質粒的基因圖譜。該表達質粒全長9063bp，含有10個主要基因片斷，包括LhCMV啟動子；2.目標基因hUT1-L-vFc ；3. EMCV IRES ；4. mDHFR 篩選基因；5. bGH 中止序列；6. SV40 啟動子；7.卡拉黴素抗性基因；8. SV40中止序列；9. ColEl複製子；10.氨苄青黴素抗性基因。圖6顯示了 300ml搖瓶內細胞株的生長及其分泌hUT1-L-vFc蛋白的濃度趨勢曲線圖。圖7顯示了重組hUT1-L-vFc純化蛋白(由▼表示)與天然尿源hUTI純化蛋白(由 表示)的體外活性比較。UTI的IC50值為8L5±6.0nM，UT1-Fc的IC50值為70. 9±1· 5nM。圖8顯示了重組hUT1-L-vFc純化蛋白與天然尿源hUTI在雨蛙素誘導的急性胰腺炎小鼠動物模型的體內活性比較。尿源hUTI在很高劑量(40mg/Kg)才能看見對血清澱粉酶急劇上升期的微弱抑制作用(8% )，在低劑量(lmg/Kg)時看不見任何抑制作用；而hUT1-L-vFc在低劑量(3mg/Kg)就看見對血清澱粉酶急劇上升期的顯著抑制作用(26%，p< O. 005)，在中等劑量(30mg/Kg)時抑制作用更加明顯(53%，p < O. 001)。考慮它們分子大小的差別，重組二聚體hUT1-L-vFc的作用劑量要比尿源hUTI的的作用劑量低38倍，而且藥效更好。圖9顯示了 hUT1-L-vFc純化蛋白(Lane 2)與天然尿源hUTI (lane 3)的10%SDS-PAGE蛋白電泳圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照製造廠商所建議的條件。實施例1.構建編碼hUT1-L-vFc重組二聚化蛋白的基因表達載體編碼hUTI前導肽和成熟蛋白的基因採用人工合成的辦法獲得，將所合成的506bpDNA片段插入轉移載體如PUC57中的EcoRV限制性酶切位點間，獲得了 phUTI質粒，其所含hUTI基因的序列可由DNA測序驗證。柔性肽Linker 與人 IgG Fe 區域 Fcy2 變體 vFcy2 (Pro331Ser 突變)、Fcy4 變體 vFcY4(Ser228Pro 和 Leu235Ala 突變)、Fcyl 變體 vFcYl (Leu234Val、Leu235Ala 和Pro331SSer突變)的融合基因由人工合成的方法獲得，所合成的片段5』和3』端各有一個限制性酶內切位點，分別為BamHI和EcoRI。將獲得的DNA片段插入到轉移載體如PUC19的BamHI和EcoRI位點間，得到PL-vFC Y質粒。由DNA測序驗證L-vFc γ基因序列。為製備hUT1-L-vFc Y融合基因，將phUTI質粒用SpeI和BamHI進行雙酶切，電泳後再膠回收hUTI片段。經純化的hUTI片段被插入到PL-VFC Y質粒中肽接頭的5』 -端，連接構成phUT1-L-vFc Y質粒。所構建的融合基因由汕11、617-5虹組成的肽接頭以及？(^變體基因組成。將獲得的完整的編碼hUT1-L-vFcy重組二聚化蛋白的基因序列經HindIII/EcoRI雙酶切後，插入到哺乳動物細胞表達質粒如P⑶NA3 (Invitrogen)的相應酶切位點間。如圖5所示，最終獲得的融合基因表達質粒pCDNA3-hUT1-L-vFc Y，該質粒含巨細胞病毒早期啟動子，它是哺乳動物細胞高水平表達外源基因所需的增強子。該質粒還含有選擇性標記物，從而在細菌中可以具有氨苄青黴素抗性，而在哺乳動物細胞中可以具有G418抗性。另外，當宿主細胞是DHFR基因表達缺陷型時，P⑶NA3表達載體所含有的小鼠的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在時，能共擴增hUT1-L-vFcY融合基因和DHFR基因(美國專利4，399，216)。在人UTI和Fe部分間存在的(且彼此化學結合)的肽接頭(較佳地為柔性接頭)增加了 UTI區域的柔性且提高了它的生物活性。對本發明而言，優選的是長度為約20個或更少(但不能少於2個)胺基酸的肽接頭，當然由I個胺基酸構成的肽接頭也在本發明的保護範圍內。宜使用含有或由2個或更多選自以下胺基酸構成的肽接頭甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。一種肽接頭的例子含有Gly-Ser肽構件,如GlyGlyGlyGlySer。圖2、圖3、圖4分別顯示了含三種Fcy變體融合基因的核苷酸序列及推導的胺基酸序列，它們共同含有編碼人 UT1、16-胺基酸肽接頭(GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)和各自含有編碼 Fcy2 變體 vFcy2 (hUT1-L-vFc Y 2) ,Fcy4 變體 vFcY4(hUT1-L_vFc Y 4)或Fcyl 變體 vFcYl (hUT1-L-vFc y ^ 的序列。實施例2-6中具體實驗時所採用的hUT1-L-vFc均為hUTI_L-VFcY2，當然可以用同樣的方法對本發明要求保護的其他重組二聚化hUTI進行操作。實施例2.重組二聚化蛋白在穩定轉染細胞系中的表達將重組的表達載體質 粒P⑶NA3-hUT1-L-vFcY2轉染入哺乳動物宿主細胞系，以表達hUT1-L-vFcY2重組二聚化蛋白。為了穩定高水平的表達，優選的宿主細胞系是DHFR酶缺陷型CHO-細胞(美國專利No. 4，818，679)。一種優選的轉染方法是電穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉降、脂轉染和原生質融合。在電穿孔中，用設置為250V電場和960 μ Fd 電容的 Gene Pulser Flectroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA),在比色杯內的2 5 X IO7個細胞中加入IOygffi PvuI線性化的質粒DNA。在轉染兩天後，將培養基改成含O. 6mg/mL G418的生長培養基。用抗人IgG Fe的ELISA分析方法，篩選對選擇用藥具有抗性的轉染子。也可用抗hUTI的ELISA分析方法進行表達重組二聚化蛋白的定量。通過極限稀釋96孔組織培養板，亞克隆產生高水平Fe重組二聚化蛋白的孔。實施例3.重組hUT1-L-vFc 二聚化蛋白的生產為了實現重組二聚化蛋白高水平的表達，宜用受MTX藥物抑制的DHFR基因進行共擴增。在含有遞增濃度MTX的生長培養基中，用DHFR基因共擴增轉染的重組二聚化蛋白基因。用極限稀釋法亞克隆能在高達I μ g/mL MTX培養基中生長的轉染子。對亞克隆細胞系的分泌率作進一步分析。篩選分泌水平超過約100(較佳地約200) μ g/106(即百萬)個細胞/24小時的細胞系，使其在無血清培養基中懸浮生長。本發明篩選到的一高產量細胞株，首先在培養皿中進行無血清馴化培養，然後轉移到搖瓶中進行懸浮馴化培養。在IOOmL搖瓶中培養15天，圖6顯示了其表達的重組二聚化蛋白累積產量為3g/L。在細胞培養的第5天至第11天間，活細胞數目最多約為6X IO6個/mL，在此條件下，分泌率測定為50 μ g/106個細胞/24小時。為了得到更多的hAT-L-vFc重組蛋白，也可以選用2000ml搖瓶培養。最後用條件培養基純化重組二聚化蛋白。實施例4.重組hUT1-L-vFc 二聚化蛋白的純化與定性分析用IN NaOH將含有重組二聚化蛋白的條件培養基滴定到pH 7 8，然後用O. 45微米的硝酸纖維素過濾器過濾。將濾液加樣到磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)平衡的Pros印A柱上。待重組二聚化蛋白結合於Prosep A後,棄去流出的組分。用PBS洗漆該柱,直到280nm處的OD值低於O. 01。然後用O.1M pH為3. 75的檸檬酸緩衝液洗脫結合的重組二聚化蛋白。用O. 4體積的IM K2HPO4中和，合併含有純化蛋白的組分，並用PBS透析。然後用O. 22微米的硝酸纖維素過濾器過濾，並存儲在-70°C。如圖9中所示，由SDS-PAGE測得的尿源hUTI (烏司他丁，天普生化)(Lane3)的分子量顯示為38kD。在相同條件下，經純化的重組hUT1-L-vFc (Lane2)遷移至約55kD處(粗條帶)，因糖基化形式的差異性，另有較少量的其他高分子量蛋白遷移至約70kD處(細條帶)。用BSA作為標準，通過BCA蛋白質分析定量該重組二聚化蛋白。實施例5.體外活性檢測 本發明中CHO細胞培養上清中分泌的或經純化的重組hUT1-L-vFc蛋白的生物學活性採用現有技術中公認的標準操作方法測定(參見Kakade等，Cereal Chem,46 :518-526，1969)，通過測定體系中胰蛋白酶的殘留活性的來判斷。反應體系中以BAPNA(N a-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride, Sigma-Aldrich 公司)作為豬胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司)的底物。反應混合物中包含20 μ I經稀釋的hUTI蛋白、純化的hUT1-L-vFc重組二聚化蛋白或hUT1-L-vFc轉化子的培養上清，5 μ I胰蛋白酶(100mg/ml，溶於含2. 94g/L CaCl2的ImM HCl中)，用0. 2M三乙醇胺緩衝液調至終體積為125 μ I。將反應混合物在37°C搖床中孵育20min，加入5 μ I ΒΑΡΝΑ (25mg的ΒΑΡΝΑ溶解在最小體積的DMSO中，並用0. 2Μ三乙醇胺緩衝液調節終濃度至10mg/ml)，然後在37°C搖床中繼續孵育20min。加入30μ I的30% (ν/ν)冰醋酸終止反應。反應同時需設置空白對照和胰蛋白酶對照。在405nm處讀取其吸光值。圖7顯示了尿源hUTI或純化的重組hUT1-L-vFc二聚化蛋白的摩爾濃度(nM)與其參比活性的對應關係。在上述條件下，hUTI的IC5tl值約為 81. 5±6· OnM，而經純化的 hUT1-L-vFc 蛋白約為 70. 9±1· 5nM。實施例6.體內活性檢測本發明中純化的重組hUT1-L-vFc蛋白的體內活性用Caerulein(雨蛙素)誘導的急性胰腺炎小鼠動物模型來評估(參見Ding等，Hepatobiliary Pancreat. Dis.1nt. ,9 645-650,2010 ;Galuppo 等，Br J. Pharmacol. ,2011 ；162 :1186-1201)。雨蛙素注射法是目前比較常用的一種建立急性胰腺炎的動物模型的方法。其特點是不需手術，對機體內環境影響較小，操作簡便，易於複製，重複性好；所致急性胰腺炎在形態、生化改變、時間進程上與人的急性胰腺炎相似。Caerulein是膽囊收縮素的類似物，可以激活CCK受體。CCK受體是G蛋白偶聯受體，激活後可以通過PLC-1P3信號通路引起胰腺腺泡細胞滑面內質網中鈣離子釋放，進而激活NADPH超氧歧化酶，使ROS生成增加，I K B α磷酸化，最終導致NF κ B激活，炎症相關因子如TNF α，IL_6，N0等表達增加。大量炎症相關因子的相互作用促進胰腺局部炎症逐步發展系統性炎症反應(多器官衰竭綜合症)。因此ROS導致的氧化應激反應被認為是急性胰腺炎發展的重要致病環節。實驗中取8周齡的C57BL/6雄性小鼠30隻，20-22g，隨機分為5組，6隻/組。提前禁食不禁水15小時。各組間隔I小時caerulein50 μ g/kg,連續注射6次。各組分別在第I次和第5次注射caerulein後,尾靜脈注射不同劑量的尿源hUTI (烏司他丁)或重組hUT1-L-vFc。各組動物於最後一次注射caerulein後的不同時間點從小鼠眼眶取血約200 μ I。血液室溫下放置O. 5小時，6000rpm離心10分鐘，製備血清。-70°C凍存。樣品送至國家上海新藥安全評價研究中心，用日立7060全自動生化檢測儀檢測血清澱粉酶的含量，來評估受試藥品的作用效果。在上述小鼠急性誘導胰腺炎動物模型中，血清澱粉酶在最後一次注射雨蛙素後迅速上升，3小時後達到峰值，然後緩慢回落，至24小時後回到起點。根據我們的實驗觀察，最後一次注射雨蛙素後I小時是最佳藥效觀測時間點。尿源hUTI在很高劑量(40mg/Kg)才能看見對血清澱粉酶急劇上升期的微弱抑制作用(8% )，在低劑量(lmg/Kg)時看不見任何抑制作用；而仙11-1^亦(3在低劑量(3mg/Kg)就看見對血清澱粉酶急劇上升期的顯著抑制作用(26%，P < O. 005)，在中等劑量(30mg/Kg)時抑制作用更加明顯(53%，p < O. 001)。重組二聚體hUT1-L-vFc的理論分子量是尿源單體hUTI的5倍，如果考慮兩者可能的糖基化程度不同，從圖9上來看，重組二聚體hUT1-L-vFc的實際分子量大約是尿源hUTI的3倍。根據以上分子量的差別，等同於尿源hUTI摩爾數的重組hUT1-L-vFc很高劑量(120mg/Kg)在實驗小鼠中無法實施。考慮它們分子大小巨大差別，重組二聚體hUT1-L-vFc的作用劑量要比尿源hUTI的的作用劑量低38倍，而且藥效更好。實施例7.融合蛋白的藥代動力學測定SD大鼠單劑量(2mg/Kg)尾靜脈注射hUT1-L-vFc樣品，選取不同時間點抽取SD大鼠的血液樣品，肝素抗凝，離心後的上清液用ELISA方法測定血漿中的融合蛋白含量。用ELISA測定時，用羊抗人 的Fe的多抗進行包埋、辣根過氧化物酶標記的鼠抗人hUTI的單抗來檢測。實施例4中純化hUT1-L-vFc樣品的血漿半衰期約為910分鐘，而純化尿源hUTI半衰期約為182分鐘，所以本發明中重組hUT1-L-vFc體內半衰期大幅度延長。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種重組二聚化hUTI蛋白，其特徵在於，所述重組二聚化hUTI蛋白從N端到C端依次包含人UT1、肽接頭和人IgG Fe變體的胺基酸殘基序列， 其中，所述人IgG Fe變體選自如下組 (i)含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區、CH2和CH3區域； (ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區、CH2和CH3區域； (iii)含有Leu234Val、Leu235Ala 和 Pro331Ser 突變的人 IgGl 絞鏈區、CH2 和 CH3 區域。
2.如權利要求1所述的重組二聚化hUTI蛋白，其特徵在於，所述肽接頭含有220個胺基酸殘基，且所述肽接頭含有兩個或更多選自甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的胺基酸殘基。
3.如權利要求2所述的重組二聚化hUTI蛋白，其特徵在於，所述肽接頭的胺基酸殘基序列如SEQ ID NO 7所示。
4.如權利要求1所述的重組二聚化hUTI蛋白，其特徵在於，所述重組二聚化hUTI蛋白的胺基酸殘基序列如SEQ ID NO:2、4或6所示。
5.如權利要求1所述的重組二聚化hUTI蛋白，其特徵在於，所述重組二聚化hUTI蛋白的胺基酸殘基序列是去除了 I到19位胺基酸殘基的hUTI前導肽之後的SEQ ID NO :2、4或6所示的胺基酸序列。
6.編碼如權利要求1至5中任一項所述的重組二聚化hUTI蛋白的DNA序列。
7.如權利要求6所述的DNA序列，其特徵在於，所述DNA序列具有SEQID ΝΟ:1、3或5所示的DNA序列。
8.—種載體,其特徵在於,包含如權利要求6或7所述的DNA序列。
9.一種宿主細胞,其特徵在於,包含如權利要求8所述的載體。
10.如權利要求9所述的宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞是CHO的衍生細胞株。
11.一種藥物組合物，其特徵在於，包括藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權利要求1所述的重組二聚化hUTI蛋白。
12.—種如權利要求1至5中任一項所述的重組二聚化hUTI蛋白的製備方法，其特徵在於，採用如權利要求9或10所述的宿主細胞製備所述重組二聚化hUTI蛋白。
13.如權利要求1至5中任一項所述的重組二聚化hUTI蛋白在製備用於治療腫瘤、急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性發作、急性循環衰竭、彌散性血管內凝血、多器官功能性障礙綜症、系統炎症反應綜合症、休克的藥物，外科手術中輔助用藥，改善血液微循環、緩解炎症、防治順鉬化療時對腎功能的損失、AIDS的輔助治療以及先兆流產的預防和治療的藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種重組二聚化hUTI蛋白、其製備方法及應用。其中，該重組二聚化hUTI蛋白。該重組二聚化hUTI蛋白從N端到C端依次包含人UTI、肽接頭和人IgG Fc變體的胺基酸殘基序列。該重組二聚化hUTI蛋白具有與人尿源胰蛋白酶抑制劑類似的體外生物學活性和更高的體內生物學活性，以及延長的體內半衰期。
文檔編號C12N5/10GK103044554SQ20121014690
公開日2013年4月17日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者李強, 孫乃超, 周若芸, 武棟棟, 劉瑞賢, 金宜慧 申請人:旭華(上海)生物研發中心有限公司