一種乳頭瘤病毒嵌合蛋白及其用途的製作方法

2023-09-21 12:24:55

本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及一種乳頭瘤病毒嵌合蛋白，及由其形成的病毒樣顆粒，以及乳頭瘤病毒嵌合蛋白或乳頭瘤病毒嵌合病毒樣顆粒在製備預防乳頭瘤病毒感染及感染誘發的疾病的疫苗中的用途。
背景技術：
：目前已分離鑑定了200多型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)，分為嗜黏膜組和嗜皮膚組。黏膜組的hpv主要感染泌尿生殖道、肛門肛周及口咽部的黏膜及周圍皮膚，誘發各種良惡性病變。根據誘發病變的性質不同，可分為誘發惡性腫瘤的高危型(包括hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等)；可疑高危型(hpv26、30、53、66、67、69、70、73、82、85等)；尚未確定型(hpv34、42、43、54、71、81、83、97、102、114等)；及誘發疣狀增生等良性病變的低危型(hpv6、7、11、13、32、40、42、44、61、62、72、74、81、83、84、86、87、89、90、91、106等)。嗜皮膚組主要感染上述部位之外的皮膚組織，誘發皮膚疣狀增生，並與某些皮膚癌的發生密切相關。高危型hpv感染相關的惡性腫瘤目前已確定的有：宮頸癌、陰道癌、陰唇癌、陰莖癌、肛門肛周癌、口咽癌、扁桃體癌、口腔癌，其中以宮頸癌的危害最大。宮頸癌是世界範圍第三高發的婦女惡性腫瘤，年發病約52.7萬，其中亞洲地區28.5萬；中國的年發病數7.5萬。hpv16是全球範圍內的優勢流行株，在hpv相關的腫瘤如宮頸癌、肛周癌、陰莖癌、外陰癌等相關癌及癌前病變中的檢出率都是最高的。例如，hpv16感染相關的宮頸癌約佔中國宮頸癌總數的58.7％，佔世界宮頸癌發病總數的53.5％，其餘41.3％-46.5％的宮頸癌由其餘約19種高危型hpv感染合併引起。目前已經上市了多種以hpvl1蛋白的病毒樣顆粒(vlp)為基礎的混合性預防疫苗，如葛蘭素史克公司的二價苗cervarix(hpv16/18)，默沙東公司的四價苗gardasil(hpv6/11/16/18)及九價苗gardasil9(hpv6/11/16/18/31/33/35/45/52/58)。由於這類疫苗誘發的免疫保護反應主要是針對疫苗構成型別的，因此這類疫苗多為hpv多價疫苗，如要獲得廣譜疫苗的預防效果需要繼續擴大疫苗的價次。鑑於hpv的型別目前已鑑定了200多型，高危型已鑑定多達20型，因此通過單純擴大vlp型別種類研發廣譜疫苗在經濟成本及人體所能承受的最大接種量方面都帶來了許多挑戰。病毒次要衣殼蛋白l2可誘發交叉中和抗體，且具有體內交叉保護活性。研究 發現，誘發交叉保護活性的中和抗體表位主要分布在l2蛋白的n端多個保守區域，如hpv16l2蛋白的胺基酸(aa.)17-36多肽的免疫血清可高滴度中和hpv16/18，同時還可有效中和hpv5/6/45/52/58(gambhirar,karanamb,etal.j.virol.2007；81(24):13927–13931)，針對hpv16l2aa.17-36的單抗rg-1亦具有交叉中和活性(gambhirar,karanamb,etal.j.virol.2007；81(24):13927–13931)，因此，l2蛋白的與hpv16l2的aa.17-36多肽同源區又被稱為rg-1表位。採用不同疫苗載體，如硫氧還蛋白(trx)、噬菌體vlp、植物病毒vlp及感染哺乳類的病毒vlp(腺相關病毒、牛乳頭瘤病毒-1、hpv16)，構建以hpv16l2aa.17-36多肽為基礎的融合蛋白疫苗，可顯著提高多肽的免疫原性，提高中和抗體的滴度及交叉中和或保護範圍(christinas,richardr,etal.j.virol.2009；83(19):10085-10095；seitzh,canalie,etal.vaccine2014；32:2610–2617；tumbane,peabodyj,etal.plosone2011；6(8):e23310；nietok,weghoferm,etal.plosone2012；7(6):e39741)。hpvl2aa.17-36多肽區域在不同種屬的乳頭瘤病毒之間，胺基酸序列同源性很高。現有的以不同hpv型別rg-1表位為基礎的疫苗研究如下：將hpv31/51型rg-1表位插入細菌蛋白trx的表面，獲得的免疫血清有交叉中和活性，但中和型別相對較少(seitzh,canalie,etal.vaccine2014；32:2610–2617)；將hpv16/31型rg-1表位聯合插入腺相關病毒vlp表面，獲得的免疫血清合計中和6個hpv型別(nietok,weghoferm,etal.plosone2012；7(6):e39741)；將hpv45型rg-1表位插入hpv18vlp表面，獲得的免疫血清合計中和4個hpv型別(huberb,schellenbacherc,etal.plosone2015；10(3):e0120152)。這些結果表明，上述型別的rg-1表位均有誘發交叉中和抗體的活性。此外，多種型別的rg-1區域的截短型多肽(hpv1/5/6/11/16/18/45/58l2aa.17-31)分別插入噬菌體vlp表面，形成的8種嵌合vlp(chimericvlp,cvlp)混合免疫後的小鼠可產生針對8種型別病毒的免疫保護反應(tumbane,peabodyj,etal.plosone2011；6(8):e23310)，由於缺乏對每種rg-1截短多肽cvlp免疫活性的具體分析，因此不能判斷各型截短型的rg-1表位多肽的免疫活性。從上述文獻報導的中和型別分析來看，hpv16型rg-1表位的免疫原性最強，無論是插入hpv及噬菌體的vlp表面均可誘發廣譜中和抗體反應；hpv31/45/51型的可能次之，其他型別的不明(缺乏報導)；值得注意的是8種型別(hpv1/5/6/11/16/18/45/58)rg-1區域的截短型多肽(l2aa.17-31)噬菌體cvlp混合免疫獲得的抗血清，其中和的型別不多，提示其中某些型別截短多肽可能是沒有活性的或是活性很弱，具體比較分析不同型別rg-1表位多肽及截短型多肽免疫原性，可望明確其免疫原性及免疫原性的差異。因此，除hpv16外，目前對其他不同型別的rg-1表位區的免疫原性研究欠深入或者缺乏研究；而且缺乏針對不同型別rg-1表位區的免疫原性的比較分析；重要的是，在相關的載體疫苗研究中，rg-1表位型別的選擇不是依據其免疫原性的強弱，而 是依據其他因素，如該型別的病毒是否優勢流行及感染相關疾病的危害程度是否嚴重。因此現有以rg-1表位為基礎的疫苗研究有待提高。hpv33的感染率及在hpv感染相關腫瘤中的檢出率較高，在世界範圍內，其在宮頸癌標本中的檢出率為2.6％；在亞洲和中國均為3.8％，僅次於hpv16/18/58型(x.castellsaguéetal.vaccine25s(2007)c1–c26)。但是hpv33l2蛋白rg-1表位的免疫原性缺乏研究，該表位是否能誘發中和抗體及誘發抗體的中和範圍及特點都不明確。基於目前的研究進展及認知，hpv33型rg-1表位疫苗的免疫活性是無法預測的。研究發現，hpv16l1vlp是一個極具研發前景的hpv16l2rg-1表位疫苗載體，在hpv16l1蛋白表面區的特定位置按照一定的方式插入hpv16l2rg-1表位後，可在vlp表面展示，免疫後可誘發廣譜中和抗體及保護反應。如在hpv16l1蛋白de環(aa136/137)位點，直接插入hpv16l2aa.17-36形成的嵌合vlp(cvlp)可誘發廣譜中和抗體反應，可中和至少14個hpv型別(schellenbacherc,rodenr,etal2009；j.virol.2009；83(19):10085–10095)；在h4區域的430/433位點，採用非等長置換法插入hpv16l2aa.18-38，可以誘發交叉中和hpv18及31型的中和抗體(kondok,ochih,etal.j.med.virol.2008；80:841–846)。目前尚未見有將hpv33l2蛋白表位嵌合在乳頭瘤病毒vlp表面的報導。由於hpv33rg-1表位與hpv16rg-1表位的胺基酸序列有一定差異(同源性約80％)，在上述位點插入後是否能形成vlp尚不清楚。另外，採用其他不同的插入方式，如在de環135-138區域，採用非等長置換合併插入片段兩端引入胺基酸修飾，獲得的融合蛋白是否能形成vlp，插入的表位是否能在表面有效呈遞尚不清楚，插入後是否影響骨架自身的主要中和抗體表位也不清楚。最後，在上述區域插入截短型的hpv33l2多肽，是否能形成vlp，形成vlp以後是否具有誘發交叉保護反應的活性，是否影響骨架自身的主要中和抗體表位，對其表達量的影響如何，同樣也是不清楚的。上述不清楚的問題是無法預測的。因此，本發明選用了hpv33型rg-1表位及截短型的rg-1表位，用於hpv16型cvlp的研究，結果顯示，本發明獲得的hpv33型rg-1長表位及短表位的cvlp的免疫原性很強(可中和至少10個hpv型別)，可與文獻報導的hpv16型rg-1vlp的相媲美，但中和型別的範圍有所不同(schellenbacherc,rodenr,etal2009；j.virol.2009；83(19):10085–10095；schellenbacherc,kwakk,etal.j.invest.derma.2013；doi:10.1038/jid.2013.253)。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於提供一種乳頭瘤病毒嵌合蛋白，用於製備預防乳頭瘤病毒感染及感染誘發的疾病的疫苗。本發明人經研究出人意料地發現，在全長或截短型hpv16l1蛋白的表面區插 入hpv33l2蛋白多肽，可提高hpv33l2多肽的免疫原性，獲得的嵌合蛋白在大腸桿菌或昆蟲細胞表達系統中可高水平表達，該嵌合蛋白可組裝成vlp，並可誘發針對來自不同屬/亞屬的多種型別hpv的廣譜保護性免疫反應。本發明基於以上發現，現已完成，在本文實施例中提供數據。基於上述目的，本發明一方面提供了一種乳頭瘤病毒嵌合蛋白，其骨架是乳頭瘤病毒的l1蛋白或乳頭瘤病毒的l1蛋白的突變體，所述的骨架上嵌合至少一個來自hpv33l2蛋白的多肽。可選地，所述的多肽選自hpv33l2蛋白(胺基酸序列如seqidno.7所示)的aa.1-200區域內的任意連續8-33個胺基酸的片段。進一步優選地，所述的多肽為hpv33l2蛋白rg-1表位區。優選地，所述的多肽的胺基酸序列如seqidno.1所示。可選地，所述的多肽是在seqidno.1所示的胺基酸序列的n端延長或截短1-5個胺基酸和/或c端延長或截短1-5個胺基酸所獲得的多肽。優選地，所述的多肽的胺基酸序列如seqidno.2或者seqidno.3所示。可選地，所述的多肽還可以是與seqidno.1所示的胺基酸序列同源性大於60％的多肽，優選是同源性大於70％的多肽、同源性大於80％的多肽、同源性大於90％的多肽，甚至更優選是同源性大於95％的多肽。可選地，所述的骨架是hpv16l1蛋白或hpv16l1蛋白的突變體。優選地，所述的hpv16l1蛋白選自高危型hpvl1蛋白或高危型hpvl1蛋白的突變體；進一步優選地，本發明涉及的嵌合蛋白骨架選自hpv16l1蛋白(例如ncbi資料庫aac09292.1序列)或hpv16l1蛋白突變體。hpv16l1蛋白骨架可來自但不限於hpv16phi1、tha7、alg1、sen32、fra25、fra63、114k、114b、z-1194等變異株的l1蛋白(touzea,mehdaouise,etal.j.clin.micr.1998；36(7):2046-2051)。優選地，所述的hpv16l1蛋白的胺基酸序列如seqidno.4所示。可選地，所述的hpv16l1蛋白的突變體是在所述的hpv16l1蛋白的n端截短0-9個胺基酸和/或c端截短0-34個胺基酸的所獲得的蛋白。可選地，所述的來自hpv33型l2蛋白的多肽嵌合於所述的hpv16型l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的表面區，優選為嵌合於所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的de環，更優選為通過直接插入的方式嵌合於所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸136和胺基酸137之間，或者通過非等長置換的方式嵌合於所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸135-138區域，其中，在所述的非等長置換的方式中，所述的來自hpv33l2蛋白的多肽的n端和/或c端含有1-3個胺基酸的連接子。可選地，所述的連接子由選自甘氨酸(g)、絲氨酸(s)、丙氨酸(a)及 脯氨酸(p)的胺基酸任意組合構成。優選地，n端選用g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子，c端選用p(脯氨酸)連接子。可選地，在所述直接插入的方式中，所述來自hpv33l2多肽的胺基酸序列是seqidno.1或seqidno.2，插入位點為所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸136和胺基酸137之間。可選地，在所述非等長置換的方式中，刪除所述hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸135-138區域後，在hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸134及139之間插入如seqidno.5或seqidno.6所示的胺基酸序列。可選地，所述的來自hpv33l2蛋白的多肽嵌合於所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的表面區，優選為嵌合於所述的hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的h4區，更優選為通過非等長置換的方式嵌合於hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸431-432區域，可選地，在所述的非等長置換的方式中，所述的來自hpv33l2多肽的n端和/或c端含有1-3個胺基酸的連接子。可選地，在所述非等長置換的方式中，刪除所述hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸431-433區域後，在hpv16l1蛋白或c端截短31個胺基酸的所述hpv16l1蛋白的突變體的胺基酸430及434之間插入如seqidno.2或seqidno.3所示的胺基酸序列。本發明的另一方面涉及編碼上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸。本發明還提供了包含上述的多核苷酸的載體，以及包含所述的載體的細胞。本發明涉及的編碼上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白的多核苷酸序列適用於不同的表達系統。可選地，這些核苷酸序列採用大腸桿菌密碼子進行全基因優化，可在大腸桿菌表達系統中高水平表達；或採用昆蟲細胞密碼子進行全基因優化，可在昆蟲細胞表達系統中高水平表達。本發明還提供了一種乳頭瘤病毒外殼蛋白多聚物，優選地，該多聚物為乳頭瘤病毒嵌合五聚體或嵌合病毒樣顆粒，其含有上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白，或者由上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白所形成。本發明還提供了上述的乳頭瘤病毒嵌合蛋白、乳頭瘤病毒嵌合五聚體或上述的乳頭瘤病毒嵌合病毒樣顆粒在製備預防乳頭瘤病毒感染及感染誘發的疾病的疫苗中的用途。本發明還提供了一種用於預防乳頭瘤病毒感染及感染誘發的疾病的疫苗，其包含上述的乳頭瘤病毒嵌合五聚體或嵌合病毒樣顆粒、佐劑、以及疫苗用賦形劑或載體，優選地，還包含至少一種嗜黏膜組和/或嗜皮膚組的hpv的病毒樣顆粒或嵌合病毒樣顆粒。其中，這些病毒樣顆粒的含量分別為能誘發保護性免疫反應的 有效量。可選地，所述佐劑為人用佐劑，優選是鋁佐劑、水包油乳劑或油包水乳劑及tlr刺激劑的佐劑組合物、氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩定劑的組合物或者mf59佐劑與聚肌苷酸-聚胞苷酸佐劑及穩定劑的組合物。發明中相關術語的說明及解釋根據本發明，術語「昆蟲細胞表達系統」包括昆蟲細胞、重組杆狀病毒、重組bacmid及表達載體。其中昆蟲細胞來源於市場上可得到的細胞，在此舉例但不限於：sf9，sf21，highfive。根據本發明，術語「原核表達系統」包括但不限於大腸桿菌表達系統。其中表達宿主菌來源於市場上可得到的菌株，在此舉例但不限於：bl21(de3)，bl21(de3)plyss，c43(de3)，rosetta-gamib(de3)。根據本發明，術語「全長hpv16型l1蛋白」的例子包括但不限於ncbi資料庫中編號為aac09292.1的蛋白等長的全長l1蛋白。「截短型hpv16型l1蛋白」的基因片段指的是其與野生型hpv16型l1蛋白基因相比，在其5』端和/或3』端缺失編碼1個或多個胺基酸的核苷酸，其中「野生型hpv16型l1蛋白」的全長序列例如但不限於ncbi資料庫中的如下序列:aac09292.1、aiq82817.1、aac61736.1等。根據本發明，術語「疫苗用賦形劑或載體」是指選自一種或多種，包括但不限於：ph調節劑，表面活性劑，離子強度增強劑。例如，ph調節劑舉例但不限於磷酸鹽緩衝液，表面活性劑包括陽離子、陰離子或非離子型表面活性劑，舉例但不限於聚山梨酯80(tween-80)，離子強度增強劑舉例但不限於氯化鈉。根據本發明，術語「人用佐劑」是指在臨床上可應用於人體的佐劑，包括當前已獲得批准的和將來可能獲得批准的各種佐劑，例如但不限於鋁佐劑、mf59及各種形式的佐劑組合物。根據本發明，術語「乳劑」是指由水相成分、油相成分及乳化劑按適當比例混合，經乳化後形成的非均相液體分散體系。其中水相成分包括但不限於磷酸鹽緩衝液、hepes緩衝液等緩衝系統；油相成分為可代謝脂類，包括但不限於植物油、魚油、動物油、合成油及其他脂類成分(例如但不限於角鯊烯、生育酚)；乳化劑為適宜的表面活性劑，例如但不限於山梨醇酐三油酸酯(span-85)、聚山梨酯80(tween-80)。根據本發明，術語「穩定劑」是指可與佐劑中的聚肌苷酸-聚胞苷酸結合併起到穩定作用的成分，包括但不限於抗生素(例如但不限於卡那黴素、新黴素、慶大黴素)、無機鹽(例如但不限於氯化鈣、氯化鎂、磷酸鈣)、陽離子的有機複合物(例如但不限於硬脂酸鈣、葡萄糖酸鈣)。根據本發明，本發明的疫苗可採用患者可接受的形式，包括但不限於口服或者注射，優選注射。根據本發明，本發明疫苗優選單位劑型使用，其中單位劑型中蛋白病毒樣顆粒的劑量為5μg-100μg，優選30μg-60μg。附圖說明圖1a-圖1b：本發明實施例5中嵌合蛋白在大腸桿菌及昆蟲細胞中的表達鑑定。結果顯示，12種嵌合蛋白均可在大腸桿菌或昆蟲細胞中高水平表達。圖1a：嵌合蛋白在大腸桿菌中的表達鑑定：1為hpv16l1de136-137/33de；2為hpv16l1de136-137/33des；3為hpv16l1de135-138/33de；4為hpv16l1de135-138/33des；5為hpv16l1h4/33de；6為hpv16l1h4/33des；圖1b：嵌合蛋白在昆蟲細胞中的表達鑑定：1為hpv16l1δcde136-137/33de；2為hpv16l1δcde136-137/33des；3為hpv16l1δcde135-138/33de；4為hpv16l1δcde135-138/33des；5為hpv16l1δch4/33de；6為hpv16l1δch4/33des。圖2a-圖2b：本發明實施例6中純化後獲得的cvlp的動態光散射分析結果。結果顯示hpv16l1δcde135-138/33de及hpv16l1δcde135-138/33des重組蛋白形成的病毒樣顆粒水化動力學直徑分別為91.6nm和97.9nm，顆粒組裝的百分比均為100％。圖2a：hpv16l1δcde135-138/33de；圖2b：hpv16l1δcde135-138/33des。圖3a-圖3f：本發明實施例7中純化後獲得的cvlp的透射電鏡觀察結果。視野中可見大量的病毒樣顆粒，顆粒均一度好。其中在de區域插入l2蛋白的多肽的cvlp直徑為50nm左右，與l1蛋白的vlp的大小相似；在h4區域插入l2蛋白的多肽的cvlp直徑較小，在35-40nm之間。bar＝200nm。圖3a：hpv16l1δcde136-137/33devlp；圖3b：hpv16l1δcde136-137/33desvlp；圖3c：hpv16l1δcde135-138/33devlp；圖3d：hpv16l1δcde135-138/33desvlp；圖3e：hpv16l1δch4/33devlp；圖3f：hpv16l1δch4/33desvlp。具體實施方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的範圍。下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍，因為實施方案必然是多樣的。本說明書中使用的用語僅是為了闡述特定的實施方案，而非作為限制，本發明的範圍已界定在所附的權利要求中。除非特別說明，本說明書中所使用的所有技術和科學用語均和本案所屬
技術領域：
的技術人員所普遍明了的意義相同。下面就本發明的優選方法和材料加以敘述，但是與本說明書中所述方法和材料類似或等效的任何方法和材料均可用以實施或測試本發明。下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法或產品說明書所描述的方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。本說 明書中所提到的所有公開文獻均被併入於此作為參考，以揭示並說明所述公開文獻中的方法和/或材料。實施例1：嵌合l1蛋白的基因的合成及表達載體構建12種嵌合l1蛋白，分別為：1)嵌合l1蛋白hpv16l1de136-137/33de：骨架為全長hpv16l1蛋白(序列如seqidno.4所示)，在其de環aa.136/137位點，直接插入hpv33l2蛋白的aa.16-37多肽(插入片段序列如seqidno.1所示)。編碼hpv16l1de136-137/33de的多核苷酸序列經大腸桿菌密碼子優化設計，構建方式為在hpv16l1大腸桿菌密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.8所示)的核苷酸408/409之間插入hpv33型l2蛋白的aa.16-37的大腸桿菌密碼子優化基因(序列如seqidno.9所示)；2)嵌合l1蛋白hpv16l1de136-137/33des：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.4所示)，在其de環aa.136/137位點，直接插入hpv33l2蛋白的aa.17-32的多肽(插入片段序列如seqidno.2所示)。編碼hpv16l1de136-137/33des的多核苷酸序列經大腸桿菌密碼子優化設計，構建方式為在hpv16l1大腸桿菌密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.8所示)的核苷酸408/409之間插入hpv33l2蛋白的aa.17-32的大腸桿菌密碼子優化基因(序列如seqidno.10所示)；3)嵌合l1蛋白hpv16l1de135-138/33de：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.4所示)，刪除其aa.135-138區域，並在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv33l2蛋白的aa.16-37多肽(在hpv16l1蛋白的aa.135-138區域非等長置換插入)，插入片段的胺基酸序列如seqidno.5所示。其中，hpv33l2aa.16-37多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1de135-138/33de的多核苷酸序列經大腸桿菌密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.8所示)的核苷酸403-414，並在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.11；4)嵌合l1蛋白hpv16l1de135-138/33des：骨架為全長hpv16l1蛋白(序列如seqidno.4所示)，刪除其aa.135-138區域，並在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽(在hpv16l1蛋白的aa.135-138區域非等長置換插入)，插入片段的胺基酸序列如seqidno.6所示。其中，hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1de135-138/33des的多核苷酸序列經大腸桿菌密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.8所示)的核苷酸403-414，並在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.12；5)嵌合l1蛋白hpv16l1h4/33de：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.4所示)，在其h4區域的aa.430-433區域非等長置換插入hpv33l2蛋 白的aa.17-37多肽，即刪除hpv16l1蛋白的aa.431-432區域，並在aa.430/433之間融合aa.17-37多肽，插入片段的胺基酸序列如seqidno.3所示。編碼hpv16l1h4/33de的多核苷酸序列經大腸桿菌密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.8所示)的核苷酸1291-1296，並在核苷酸1290/1297之間插入序列seqidno.13；6)嵌合l1蛋白hpv16l1h4/33des：骨架為全長的hpv16l1蛋白(序列如seqidno.4所示)，在其h4區域的aa.430-433區域非等長置換插入hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽，即刪除hpv16l1蛋白的aa.431-432區域，並在aa.430/433之間融合aa.17-32多肽，插入片段的胺基酸序列如seqidno.2所示。編碼hpv16l1h4/33des的多核苷酸序列經大腸桿菌密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1大腸桿菌密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.8所示)的核苷酸1291-1296，並在核苷酸1290/1297之間插入序列seqidno.10；7)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde136-137/33de：骨架為c端截短31個胺基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.4的c端截短31個胺基酸)，在其de環aa.136/137位點，直接插入hpv33l2蛋白aa.16-37多肽(插入片段序列如seqidno.1所示)。編碼hpv16l1δcde136-137/33de的多核苷酸序列經昆蟲細胞密碼子優化設計，構建方式為在hpv16l1昆蟲細胞密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.14所示)的核苷酸408/409之間插入hpv33l2蛋白的aa.16-37的昆蟲密碼子優化基因(序列如seqidno.15所示)；8)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde136-137/33des：骨架為c端截短31個胺基酸的hpv16型l1蛋白(即在序列seqidno.4的c端截短31個胺基酸)，在其de環aa.136/137位點，直接插入hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽(插入片段序列如seqidno.2所示)。編碼hpv16l1δcde136-137/33des的多核苷酸序列經昆蟲細胞密碼子優化設計，構建方式為在hpv16l1昆蟲細胞密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.14所示)的核苷酸408/409之間插入hpv33l2蛋白的aa.17-32的昆蟲密碼子優化基因(序列如seqidno.16所示)；9)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde135-138/33de：骨架為c端截短31個胺基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.4的c端截短31個胺基酸)，刪除其aa.135-138區域，並在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv33l2蛋白的aa.16-37多肽(在hpv16型l1蛋白的aa.135-138區域非等長置換插入)，插入片段的胺基酸序列如seqidno.5所示。其中，hpv33l2蛋白的aa.16-37多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1δcde135-138/33de的多核苷酸序列經昆蟲細胞密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1昆蟲細胞密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.14所示)的核苷酸403-414，並在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.17；10)嵌合l1蛋白hpv16l1δcde135-138/33des：骨架為c端截短31個胺基酸 的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.4的c端截短31個胺基酸)，刪除其aa.135-138區域，並在aa.134/139之間融合包含連接子的hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽(在hpv16l1蛋白的aa.135-138區域非等長置換插入)，插入片段的胺基酸序列如seqidno.6所示。其中，hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽的n端融合g(甘氨酸)p(脯氨酸)連接子且c端融合p(脯氨酸)連接子。編碼hpv16l1δcde135-138/33des的多核苷酸序列經昆蟲細胞密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1昆蟲細胞密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.14所示)的核苷酸403-414，並在核苷酸402/415之間插入序列seqidno.18；11)嵌合l1蛋白hpv16l1δch4/33de：骨架為c端截短31個胺基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.4的c端截短31個胺基酸)，在其h4區域的aa.430-433區域非等長置換插入hpv33l2蛋白的aa.17-37多肽，即刪除hpv16l1蛋白的aa.431-432區域，並在aa.430/433之間融合hpv33l2蛋白的aa.17-37多肽，插入片段的胺基酸序列如seqidno.3所示。編碼hpv16l1δch4/33de的多核苷酸序列經昆蟲細胞密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1昆蟲細胞密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.14所示)的核苷酸1291-1296，並在核苷酸1290/1297之間插入序列seqidno.19；12)嵌合l1蛋白hpv16l1δch4/33des：骨架為c端截短31個胺基酸的hpv16l1蛋白(即在序列seqidno.4的c端截短31個胺基酸)，在其h4區域的aa.430-433區域非等長置換插入hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽，即刪除hpv16型l1蛋白的aa.431-432區域，並在aa.430/433之間融合hpv33l2蛋白的aa.17-32多肽，插入片段的胺基酸序列如seqidno.2所示。編碼hpv16l1δch4/33des的多核苷酸序列經昆蟲細胞密碼子優化設計，構建方式為刪除hpv16l1昆蟲細胞密碼子優化基因骨架(序列如seqidno.14所示)的核苷酸1291-1296，並在核苷酸1290/1297之間插入序列seqidno.16。依據大腸桿菌密碼子及依據昆蟲細胞密碼子優化的嵌合l1基因採用全基因合成的方式，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。大腸桿菌密碼子優化的嵌合蛋白基因經ndei/xhoi酶切後，分別插入商業化的表達載體pet22b(novagen公司生產)。昆蟲細胞密碼子優化的嵌合蛋白基因經ecori/xbai酶切後，分別插入商業化表達載體pfastbac1(invitrogen公司生產)中。得到包含嵌合蛋白基因的表達載體，分別為：pet22b-16l1de136-137/33de，pet22b-16l1de136-137/33des，et22b-16l1de135-138/33de，pet22b-16l1de135-138/33des，pet22b-16l1h4/33de，pet22b-16l1h4/33des，pfastbac1-16l1δcde136-137/33de，pfastbac1-16l1δcde136-137/33des，pfastbac1-16l1δcde135-138/33de，pfastbac1-16l1δcde135-138/33des，pfastbac1-16l1δch4/33de，pfastbac1-16l1δch4/33des。上述酶切、連接及克隆構建的方法都是公知的，例如專利cn101293918b。實施例2：嵌合l1蛋白的基因的重組bacmid及重組杆狀病毒的構建分別使用包含嵌合l1基因的重組表達載體pfastbac1-16l1δcde136-137/33de，pfastbac1-16l1δcde136-137/33des，pfastbac1-16l1δcde135-138/33de，pfastbac1-16l1δcde135-138/33des，pfastbac1-16l1δch4/33de，pfastbac1-16l1δch4/33des轉化大腸桿菌dh10bac感受態，篩選獲得重組bacmid，然後用重組bacmid轉染昆蟲細胞sf9，在sf9內擴增重組杆狀病毒。重組bacmid的篩選及重組杆狀病毒的擴增方法都是公知的，例如專利cn101148661b。實施例3：嵌合l1蛋白的基因在sf9細胞中的表達sf9細胞分別接種6種嵌合l1基因的重組杆狀病毒，進行嵌合l1蛋白的表達，27℃培養約88h後收發酵液，3000rpm離心15min，棄上清，用pbs洗滌細胞後，用於表達鑑定及純化。感染表達的方法是公開的，例如專利cn101148661b。實施例4：嵌合l1蛋白的基因在大腸桿菌中的表達分別使用包含嵌合l1基因的重組表達載體pet22b-16l1de136-137/33de，pet22b-16l1de136-137/33des，pet22b-16l1de135-138/33de，pet22b-16l1de135-138/33des，pet22b-16l1h4/33de，pet22b-16l1h4/33des轉化大腸桿菌bl21(de3)。挑單克隆接種到3ml含氨苄青黴素的lb培養基中，37℃培養過夜。將過夜培養的菌液按1：100的比例加入lb培養基中，37℃培養3h左右，待od600達到0.8-1.0之間，加iptg至終濃度0.5μm，16℃培養約12h，收取菌液。實施例5：嵌合l1蛋白的表達鑑定取實施例3及實施例4中所述表達不同嵌合l1蛋白的細胞各1×106個，重懸於200μlpbs溶液中，加入6×loadingbuffer50μl，75℃變性8分鐘，分別取10μl進行sds-page電泳及westernblot鑑定。結果如圖1所示，12種嵌合l1蛋白均可在昆蟲細胞或原核表達系統中高水平表達，其中hpv16l1de136-137/33de、hpv16l1de136-137/33des、hpv16l1de135-138/33de、hpv16l1de135-138/33des、hpv16l1h4/33de、hpv16l1h4/33des大小約55kda，其餘6種蛋白大小約50kda。sds-page電泳及westernblot鑑定的方法是公開的，例如專利cn101148661b。實施例6：嵌合l1蛋白的純化及動態光散射粒徑分析取嵌合l1的細胞發酵液適量，使用10mlpbs重懸細胞，加pmsf至終濃度1mg/ml，超聲破碎(寧波新芝超聲破碎儀，6#探頭，200w，超聲5s，間隔7s，總時間10min)，取破碎上清進行純化，純化步驟在室溫進行。在裂解液中加入4％β-巰基乙醇(w/w)對vlp進行解聚，然後使用0.22μm濾器過濾樣品，依次 使用dmae陰離子交換層析或cm陽離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)、tmae陰離子交換層析或q陽離子交換層析(20mmtris,180mmnacl,4％β-me,ph7.9洗脫)及羥基磷灰石層析(100mmnah2po4，30mmnacl，4％β-me，ph6.0洗脫)純化。純化產物採用planova超濾系統進行濃縮，並更換緩衝液(20mmnah2po4，500mmnacl，ph6.0)促使vlp組裝。以上純化方法均是公開的，例如專利cn101293918b、cn1976718a等。取純化後的嵌合蛋白溶液進行dls粒徑分析(zetasizernanozs90動態光散射儀，malvern公司)，結果如表1所示，其中hpv16l1δcde135-138/33de及hpv16l1δcde135-138/33des的dls分析圖如圖2所示。表1嵌合l1蛋白dls分析蛋白名稱水力學直徑(nm)pdihpv16l1de136-137/33de92.50.131hpv16l1de136-137/33des98.40.142hpv16l1de135-138/33de91.40.133hpv16l1de135-138/33des95.20.142hpv16l1h4/33de89.40.176hpv16l1h4/33des82.60.188hpv16l1δcde136-137/33de99.40.142hpv16l1δcde136-137/33des98.80.136hpv16l1δcde135-138/33de91.60.177hpv16l1δcde135-138/33des97.90.143hpv16l1δch4/33de88.60.144hpv16l1δch4/33des90.80.152實施例7：嵌合vlp的透射電鏡觀察按實施例6所述的層析純化方法，對嵌合vlp分別進行純化，使用透析後的vlp製備銅網，並用1％醋酸鈾進行染色，充分乾燥後使用jem-1400電鏡(奧林巴斯)進行觀察。結果如圖3所示，昆蟲細胞表達的在de區嵌合l2抗原多肽的cvlp直徑約為50nm，在h4區域嵌合l2抗原的多肽的cvlp直徑約35-40nm。原核表達的cvlp與昆蟲細胞表達的cvlp大小規律一致，在de區嵌合l2抗原多肽的cvlp直徑約為50nm，在h4區域嵌合l2抗原多肽的cvlp直徑約35-40nm。銅網製備及電鏡觀察的方法均是公開的，例如專利cn101148661b。實施例8：嵌合vlp的小鼠免疫及中和抗體滴度測定取4-6周齡的balb/c小鼠，隨機分組，每組5隻，用cvlp10μg，al(oh)350μg及pika佐劑50μg免疫小鼠。皮下注射，於第0，2，4，6周免疫，共4次。第4次免疫後2周尾靜脈採血，分離血清。使用12種hpv假病毒對免疫血清的中和抗體滴度進行檢測，結果如表2所示，結果顯示大腸桿菌及昆蟲細胞表達體系生產的cvlp免疫小鼠後均可有效誘發交叉中和抗體，中和範圍廣。其中hpv16l1δcde136-137/33de等昆蟲細胞表達的cvlp免疫血清可中和至少12個型別的假病毒。假病毒製備及假病毒中和實驗的方法均是公開的，例如專利cn104418942a。此外，本發明包括的在de區域或h4區域採用其他柔性連接子連接l2蛋白的多肽構建的嵌合蛋白，均能形成的cvlp，採用上述策略免疫小鼠後，誘發的交叉中和抗體水平與表2所示的cvlp相比沒有差異。由前述12種嵌合l1蛋白分別構成的五聚體，採用上述策略免疫小鼠後，也可誘發交叉中和抗體。表2不同cvlp在小鼠中誘發的中和抗體滴度當前第1頁12