單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度的測定方法

2023-09-21 17:04:30

專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑盒及單胺氧化酶活性濃度的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定 單胺氧化酶活性濃度的測定方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
單胺氧化酶(MAO)測定可分為化學分光光度法、螢光法、免疫 抑制法及現在申請專利的酶法。 一般多用化學分光光度法，單胺氧化 酶反應底物以苄胺(Benzylamine)和對苯甲胺-P -偶氮萘酚，也可應 用單胺氧化酶催化胺類釋放出的HA氧化發色劑，如10-N-甲基氨基甲 醯基-3， 7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪(MCDP)。除此之外，單胺氧化酶 反應底物還有丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine)、 e-苯乙 基胺(b-phenylethylamine)、酪胺(tyramine: 3-對羥基苯乙胺 3-parahdroxyphenylethylamine)、 5-羥色胺(5-hydroxytrypt腿ine) 等，丁基胺、戊基胺、P -苯乙基胺約為3-對羥基苯乙胺活性的30%， 通常應用苯甲胺作為底物比其他底物的單胺氧化酶活性要高。目前單 胺氧化酶測定多用苄胺和對苯甲胺-P -偶氮萘酚為底物，但對苯甲胺-e-偶氮萘酚苄胺法需要用環乙垸提取，限制了該方法的實用性，且不 能應用全自動生化儀分析；苄胺法的原理是苄胺在單胺氧化酶的作用 下生成苄醛，然後在強鹼性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生 成醛苯腙，在生化儀上測定也較困難。
螢光法檢測單胺氧化酶是以e -苯乙胺作為底物，其在1(Tl00mg
時Km最大，高於苄胺和5-羥色胺的Km值。
免疫學方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發生反應，作用
後進行單胺氧化酶同工酶測定。目前應用較多的單克隆抗體是 MAO-A3C9、 MAO-A4F10、 MA0-A7B10、 MAO-A7E10和MAO-B1C2等。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法
(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯法(Couple Reaction)技術，計量還原型煙醯胺輔酶 (還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶 活性濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的單胺氧化 酶診斷試劑盒，釆用該試劑盒不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全 自動生化分析儀上進行單胺氧化酶活性濃度的測定，而且測定速度快、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明單胺氧化酶活性濃度測定方法原理如下
胺類化合物+ 2水+氧單胺氧化酶相應醛類產物+
氨離子+過氧化氫+ 2 OH— 氨離子+ a-酮戊二酸+還原型輔酶穀氨酸脫氫酶穀氨酸
+輔酶+水
穀氨酸+水+氧穀氨酸氧化酶氨離子+ a-酮戊二酸+
過氧化氫
胺類化合物可以是苄胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊 基胺、3-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺等或其衍生物。
這種方法應用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase EC 1.4.3.4、EC 1.4.3.6)將胺類化合物酶解產生氨。
穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1,4.1.3 或EC 1.4.1.4)及穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)作為循環酶穀氨酸脫氫酶的酶促作用產生穀氨酸；谷 氨酸氧化酶再將穀氨酸再次變回氨及a-酮戊二酸，使氨不斷地被 重複循環利用。
穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3 或EC 1.4丄4)作為顯色酶，使還原型輔酶(在340nm處有吸收 峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測 定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處 吸光度下降的速度，可以測算出單胺氧化酶活性濃度。 實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明單胺氧化酶 試劑盒較為理想
緩衝液 lOOmmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
穀氨酸脫氫酶 50000 U/L
穀氨酸氧化酶 10000 U/L
a-酮戊二酸 16 mmol/L
本發明的單胺氧化酶診斷試劑盒可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、穀氨酸脫氮酶、穀氨 酸氧化酶。
試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸。 試劑2
緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸。 試劑2
緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶。 試劑3
緩衝液、穩定劑、穀氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶 解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定單胺氧化酶活性濃度的方 法，其還原型輔酵可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為單試劑，包括-
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
穀氨酸脫氫酶 50000 U/L
穀氨酸氧化酶 10000 U/L
a-酮戊二酸 16 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；
使用前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間IO分鐘，起
始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測樣
品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，檢測方
法為速率法，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 .加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生
化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺
氧化酶活性濃度的大小。
實施例二
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
還原型輔酶
a-酮戊二酸
0.25薩ol/L 12 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑
穀氨酸脫氫
穀氨酸氧化l
50 mmol/L
40000 U/L
15000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測樣品 與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)， 檢測方法為速率法，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧 化酶活性的濃度大小。 實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液
穩定劑
還原型輔酶
a-酮戊二酸
10O蘭ol/L 50 mmol/L
0.25腿ol/L 10 mmol/L
試劑2
100腿ol/L 50 mmol/L 20000 U/L
100腿ol/L 50 mmol/L 60000 U/L
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑
穀氨酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 穩定劑
穀氨酸氧化酶
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度
37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，
測試副波長405nm，被測樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為
4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，檢測方法為速率法，延遲
時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化
分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出單胺氧
化酶活性濃度的大小。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化
分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好、不受內外
源物質的汙染，便於推廣應用。
權利要求
1.一種酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method)的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法原理如下胺類化合物+2水+氧 單胺氧化酶 相應醛類產物+ 氨離子+過氧化氫+2 OH-氨離子+α-酮戊二酸+還原型輔酶 穀氨酸脫氫酶 穀氨酸 +輔酶+水穀氨酸+水+氧 穀氨酸氧化酶 氨離子+α-酮戊二酸+ 過氧化氫胺類化合物可以是苄胺、對苯甲胺-β-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺等或其衍生物。將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出單胺氧化酶活性濃度大小測定結果。單胺氧化酶(Monoamine Oxidase EC 1.4.3.4、EC 1.4.3.6)作為作用酶，功能為將胺類化合物酶解產生氨。穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作為循環酶穀氨酸脫氫酶的酶促作用產生穀氨酸；穀氨酸氧化酶再將穀氨酸再次變回氨及α-酮戊二酸，使氨不斷地被重複循環利用。穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)作為顯色酶，使還原型輔酶變成為輔酶，在340nm波長下發生吸光度下降，從而可以測算出單胺氧化酶活性濃度。還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一種。
2. —種單胺氧化酶診斷試劑盒，主要成分包括-緩衝液 40——500 mmol/L穩定劑 1——50mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L穀氨酸脫氫酶 2000——500000 U/L 穀氨酸氧化酶 2000——500000 U/L a-酮戊二酸 2——20 mmol/L其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、、穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷 氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)組成單劑 .試劑。
4. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、穀氨酸脫氫酶 (glutamate dehydrogenase EC 1,4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、 穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)組成雙 劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸組 成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、穀氨酸氧化酶、穀氨酸脫氫酶組 成。a-酮戊二酸、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸、穀氨酸脫氫酶 (glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、 穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)組成多 劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、a-酮戊二酸組 成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶組成；試劑3，由 緩衝液、穩定劑、穀氨酸氧化酶組成。a-酮戊二酸、穀氨酸脫氫酶、 穀氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷試劑盒，其特徵在於還包 括穩定劑1--4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method)的單胺氧化酶診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、α-酮戊二酸、穀氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC1.4.1.4)、穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC 1.4.3.11)、還原型輔酶及穩定劑，這些成分可以配成單劑試劑盒、雙劑試劑盒及三劑試劑盒；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶(偶)促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度大小，從而測算出單胺氧化酶活性的濃度。採用本發明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，便於推廣應用。
文檔編號G01N33/50GK101097202SQ200610085589
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優先權日2006年6月26日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司