一種抗大豆胰蛋白酶抑制劑抗體、製備方法及其用途的製作方法
2023-09-21 21:13:25 1
專利名稱：一種抗大豆胰蛋白酶抑制劑抗體、製備方法及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗體領域，特別是涉及抗大豆胰蛋白酶抑制劑抗體、製備方法及其用途。
背景技術：
近年來，我國漁業生產發展迅速，其中，水產品加工業已成為我國漁業生產中發展速度最快、經濟社會效益十分顯著的支柱產業。在水產加工品中，魚糜製品因其食用方便、衛生、營養價值高等特點而廣受消費者的青睞。但是，隨著魚糜製品生產企業的不斷增加，產品良莠不齊的情況已開始出現。最值得關注的是在魚漿原料中添加過量大豆蛋白替代魚肉蛋白，以次充好，損害消費者權益的情況已開始出現。由於大豆蛋白中存在未完全滅活的大豆胰蛋白酶抑制劑、致敏蛋白等成分，對人體健康存在 一定危害，因此有必要對魚糜製品中大豆蛋白的添加量進行明確而有效的控制和規範。對大豆蛋白添加量的規範依賴於準確的定量檢測方法。但目前國內尚無檢測魚糜製品原料及產品中大豆蛋白含量的方法。這是由於，一方麵食品生產監管單位和魚糜製品生產企業尚未認識到該項工作的重要性和必要性；另一方面，魚糜製品加工過程中多種蛋白的混合以及高溫處理會改變蛋白的結構及理化特性，增加了檢測的難度。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種抗大豆胰蛋白酶抑制劑特異性抗體。為實現上述目的，提供一種製備方法:將純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過高溫處理後免疫BALB/c小鼠，優選純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過100-120 0C處理10-30 min ;經細胞融合，篩選獲得能分泌抗大豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的細胞株，經細胞培養獲得抗體。還包括將獲得的單克隆抗體通過Protein G Sepharose親和柱進行純化的步驟。本發明的另外一個目的是提供一種抗大豆胰蛋白酶抑制劑抗體的製備方法。包括如下步驟:將純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過高溫處理後免疫BALB/c小鼠，優選純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過100-120 °C處理10-30 min ;經細胞融合，篩選獲得能分泌抗大豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的細胞株，經細胞培養獲得抗體。還包括將獲得的單克隆抗體通過Protein G Sepharose親和柱進行純化的步驟。本發明另一個目的是提供一種抗大豆胰蛋白酶抑制劑抗體的用途。一種用於檢測魚糜製品中大豆蛋白的方法，其特徵在於，包括如下步驟:將待檢樣品用提取液抽提後，以製備的生物素標記的所述抗STI單克隆抗體進行Western blot檢測分析。所述提取液為含有 0.1 mmol/L DTT 的 6-8 mol/L 尿素。所述生物素標記的所述抗STI單克隆抗體是將所述抗STI單克隆抗體經脫鹽處理後，與生物素混勻，於冰上孵育得到。在大豆蛋白中，大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean Trypsin Inhibitor, STI)佔大豆總蛋白含量的6 %左右，STI由於其良好的熱穩定性和在大豆蛋白中所佔的高比例，將其作為一個檢測魚糜製品中大豆蛋白添加量的標誌物是切實可行的。本發明的其中一個實施例用於驗證本發明抗STI抗體用於魚糜製品中大豆蛋白檢測的聞靈敏度。說明本發明檢測方法的靈敏度聞，可實現對0.025 %及以上的大 蛋白添加量的準確檢出。同時，另外一個實施例驗證了本發明的抗STI抗體用於市售魚糜製品中大豆蛋白的檢測，驗證了本發明的抗STI抗體用於魚糜製品中大豆蛋白檢測的準確性。本發明的抗STI抗體用於檢測魚糜製品中大豆蛋白含量，靈敏度高，特異性好，準確性高，方法簡便快捷。
圖1Α.純化STI的SDS-PAGE電泳圖，圖1B抗STI單克隆抗體的特異性分析電泳 圖2.純化的STI對胰蛋白酶的抑制效果 圖3.抗STI單克隆抗體的純化電泳 圖4.不同大豆蛋白含量的魚糜製品中大豆蛋白檢測的免疫印跡結果 圖5.市售魚糜製品中大豆蛋白檢測的免疫印跡結果圖。
具體實施例方式下面通過具 體實施方式對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1:大豆蛋白STI標準品的製備
用高速藥物粉碎機將大豆磨成粉末，並過60目篩，稱取100 g粉末，加入300 mL丙酮攪拌2 h,絹布過濾,棄去丙酮層。殘留物用80 %的乙醇洗漆,8000 g離心20 min,棄上清，如此重複4次。將所得沉澱浸泡於0.08 mol/L H2SO4中30 min, 6000 g離心15 min，棄上清，沉澱再重懸於0.125 mol/L H2SO4*，攪拌4 h,8000 g離心20 min,絹布過濾,棄沉澱。上清液用I mol/L的NaOH調pH至4.7，靜置0.5 h,8000 g離心20 min，棄沉澱。上清液加Λ 70 %飽和度的(NH4)2SO4,4 °C放置 2 h，8000 g離心 20 min，沉澱用 20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)的緩衝液溶解，透析過夜。將透析後的樣品上樣於預先用20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)的緩衝液平衡好的DEAE-Sephacel層析柱，經0-0.5 mol/L NaCl線性洗脫、收集對胰蛋白酶抑制活性峰部分，於20 mmol/L的HAc-NaAc (pH 4.0)緩衝液中透析21 h，期間分別間隔1、2、4、6 h更換一次緩衝液，。透析後樣品進一步上樣於SP-Sepharose離子交換層析柱,經20 mmol/LHAc-NaAc (pH 4.0_6.0)的緩衝液洗脫，得到純化的大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)。蛋白的純化效果如圖1A和圖1B，其中泳道M為蛋白標準分子量，泳道I為純化的STI ;從圖中可以看出泳道I除了 STI條帶外，不存在其它條帶，即經過一系列的分離純化，得到了高度純化的STI。純化的STI抑制活性採用螢光底物進行鑑定。即取50 μ L純化的STI加入850UL 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)緩衝液中，再加入50 μ L適量濃度的豬胰蛋白酶(Sigma公司)混勻，常溫孵育 10 min 後，加入 10 μ mol/L 突光底物 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (PeptideInstitute公司，日本)50 μ L於37 °C反應10 min,用1.5 mL終止液(甲醇:異丙醇:水=35:30:35 v:v:v)終止反應。反應釋放的產物 7-amino-4-methylcoumarin (AMC)用突光分光光度計(FP-6200，JASC0，日本)，在激發波長380 nm和發射波長450 nm下進行測定。所得到的值即STI的抑制活力用Ti表示。對照(胰蛋白酶酶活力)的測定方法類似，即將50 μ L的緩衝液代替50 μ L純化的STI反應，所測得的值用T表示。抑制活力單位(Unit)定義為將絲氨酸蛋白酶活性降低I個活力單位的抑制活性，其中絲氨酸蛋白酶的活力單位定義為每分鐘釋放I nmol AMC所需要的酶量。抑制率採用百分數I (%)表示，計算公式如下:1 (%) = ( (T-Ti)/T) X IOOo結果如圖2所示,橫坐標表示純化的STI的濃度,縱坐標表示抑制率I (%)，從圖中可以看出，當純化的STI濃度為1/64000 mg/mL (15.6 ng/mL)時，對胰蛋白酶仍然有10 %左右的抑制活性，純化STI的JCki (導致絲氨酸蛋白酶活力下降50 %的抑制劑濃度)為1/32000 mg/mL即31.3 ng/mL，說明純化的STI對胰蛋白酶具有強烈的抑制效果。實施例2抗大豆蛋白STI單克隆抗體的製備
選擇5隻雌性、6 8周齡的BALB/c小鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司)，將實施例1得到純化的大豆蛋白STI經110 °C，處理30 min後(100 μ L)與等體積的弗氏完全佐劑(Sigma)混勻所得即為抗原，每隻小鼠100 μ g抗原的劑量進行腹腔注射；之後每隔2周以相同劑量的抗原加強免疫；免疫3次後，對小鼠進行尾部取血，利用間接ELISA法檢測小鼠血清效價，即抗原以2 yg/mL的濃度包被酶標板，4 1:包被過夜，以200 μ L/孔TBST洗滌5遍，經5 %的脫脂奶37 °C條件下溫育1.5 h，以200 μ L/孔TBST洗滌2遍，將小鼠抗血清以 1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000、1:240000 的稀釋度稀釋，50 μ L/孔加樣，37 °C條件下溫育I h，用TBST以200 μ L/孔洗滌2遍，HRP標記的羊抗鼠二次抗體1:5000稀釋使用，以100 μ L/孔加樣，37 °C條件下溫育I h，用TBST以200 μ L/孔洗漆 3 遍,加 100 μ L/ 孔 TMB (3，3』，5, 5』 -Tetramethylbenzidine 3, 3』，5，5』 -四甲基聯苯胺)顯色液，反應20 min後，加入50 μ L/孔的H2SO4終止反應，酶標儀測定OD450 nm讀數，選擇抗體滴度最高的一隻小鼠(血清稀釋度為1:10000時，OD45tl nm為1.294)在細胞融合前4天，進行強化免疫I次。免疫量仍然為每隻小鼠100 μ g抗原。分離強化免疫的小鼠脾臟淋巴細胞，將其與SP2/0骨髓瘤細胞(中國科學院細胞庫)在聚乙二醇(Sigma)的介導下進行融合；融合後的細胞在含有I % HAT (Sigma)和20%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640 (Invitrogen)培養基中37 °C培養；雜交瘤細胞通過ELISA法進行篩選(方法同之前提供的間接ELISA法)。篩選出的陽性細胞採用有限稀釋法進行克隆化培養，該操作重複3次以保證篩選出能分泌抗STI抗體的單克隆陽性細胞株。篩選的能分泌抗STI單克隆抗體的陽性細胞株進行擴大培養，收集培養上清，在1500 g離心10 m in，取上清即得抗STI單克隆抗體。將得到的單克隆抗體與平衡緩衝液(20mmol/L的PBS，pH 7.0)混合後，上樣於預先用20 mmol/L的PBS (pH 7.0)平衡的ProteinG Sepharose親和層析柱(Amersham Biosciences),收集該部分樣品(未吸附部分);繼續用平衡緩衝液流洗至A28tl nm為基線，然後以0.1 mol/L glycine (甘氨酸)-HCl (pH 2.7)進行洗脫至A28tlnm為基線，收集時先在離心管中預先加入100 μ L lmol/L Tris-HCKpH 9.0)的緩衝液，每管收集I mL，洗脫部分所得樣品稱為吸附部分。分別將細胞培養上清、未吸附部分及吸附部分的蛋白峰經SDS化後(樣品:上樣緩衝液=3:1，v:v)，進行SDS-PAGE電泳分析,結果如圖3泳道1、2、3所示。說明經Protein G Sepharose親和層析柱的純化,去除了雜蛋白，得到了高度純化的抗STI單克隆抗體，如泳道3所示(吸附部分)，在還原條件下(力口入β-巰基乙醇)分別顯示出50 kDa左右的重鏈和25 kDa左右的輕鏈。將得到的單克隆抗體進行特異性分析，結果見圖1A和B，其中泳道M為蛋白分子量標準，泳道I為純化的STI ；泳道2為空白對照(魚肉+澱粉)；泳道3為大豆分離蛋白，圖1A的SDS-PAGE電泳所示，除純化的STI，空白對照及大豆分離蛋白均含有許多雜蛋白，但圖1B (抗STI單克隆單克隆抗體的Western blot分析)結果顯示,大豆分離蛋白及純化的STI只在STI處存在免疫反應，空白對照(魚肉+澱粉)則沒有任何反應條帶。說明製備的抗STI單克隆抗體具有較好的特異性，除大豆蛋白STI外，不與大豆及魚肉澱粉中的其它雜蛋白發生免疫反應。抗大豆蛋白STI單克隆抗體的生物素標記:將純化的抗大豆蛋白STI單克隆抗體經脫鹽柱(thermo)處理，使抗體緩衝液置換成含有0.15 mol/L NaCl的0.1 mol/L PBSCpH
7.2)。標記前預先將生物素(Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce，美國)回溫至室溫，配置成10mmol/L生物素溶液，並將10 mmol/L生物素和脫鹽處理後的抗大豆蛋白STI單克隆抗體以80:1 (摩爾比)的比例混勻，於冰上孵育2 h，再通過脫鹽柱(thermo)去除未結合的生物素。由於生物素與親和素特異性的相互作用可使檢測信號有效放大，大大提高本發明檢測體系的靈敏度。
實施例3靈敏度檢測試驗
魚丸的製備:以鮮活的鰱魚為原料。用10 1:左右的低溫水衝洗乾淨，除去表面附著的黏液和汙物，然後去鱗、去頭、去內臟，用低溫水漂洗3次。分離魚肉,剔除魚骨、魚皮。將魚肉切成薄片，用3 10 °C的冰水漂洗(魚:水=1:5，w: V)，先慢速攪拌10 min，使水溶性蛋白等成分充分溶出，然後靜置，使魚肉充分沉澱，棄去上清液，如此重複3次。漂洗後的魚肉脫水後，充分絞碎。將絞碎的魚肉置於預先冷卻好的研缽中，進行擂潰，擂潰分三階段進行:空擂10 15 min ;鹽擂20 30 min ;然後按照魚肉:澱粉=5:1 (w:w)的比例,添加玉米澱粉進行充分擂潰後，分組製備含(O %、0.01 %、0.0125 %、0.025 %、0.05 %、0.I %、0.5 %)(w:w)大豆蛋白的魚丸，每組製備100 g,(例如:製備含0.5 %大豆蛋白的魚丸，即稱取0.5g的大豆蛋白粉末加入99.5 g (魚肉+澱粉),繼續擂潰10 min。),該工序整個過程中溫度不超過10 °C。用手工成丸，將水溫控制在40 °C左右，定型20 min，之後在水溫85 95°C水煮。待魚丸全部漂起，即可撈出，採用水冷的方法將魚丸冷卻。將含不同大豆蛋白的自製魚丸分別取100 g剁碎後，取20 g加入120 mL含有0.1mmol/L DTT (Dithiothreitol) (二硫蘇糖醇)的7 mol/L尿素提取液中，組織搗碎後,4000g離心20 min，所得上清即為自製魚丸粗提液。將自製魚丸粗提液進行SDS-PAGE電泳後，轉移到硝酸纖維素膜，採用生物素標記的抗STI單克隆抗體(實施例2所得)為一抗、辣根過氧化物酶標記的親和素(Sigma)為二抗，以 ECL (Enhanced chemiluminescence method增強化學發光法)化學發光顯色液(Thermo)進行Western blot分析。結果如圖4所示，其中泳道I為空白對照；泳道2-7為自製魚丸樣品，大豆蛋白的添加量分別為0.01 %、0.0125%、0.025 %、0.05 %、0.1 %和0.5 %。從圖4可以看出，大豆蛋白的添加量為0.025%及更高含量時條帶清晰，說明本發明檢測方法的靈敏度高，可實現對0.025 %及以上的大豆蛋白添加量的準確檢出。實施例4市售魚糜製品中大豆蛋白的檢測
購買6種不同的魚糜製品，分別取100 g剁碎後，取20 g加入120 mL含有0.1 mmol/L DTT的7 mol/L尿素提取液中，組織搗碎後，4000 g離心20 min，所得上清即市售魚丸粗提液。對粗提液進行Western blot法進行分析(同實施例3步驟)。結果如圖5所示，其中泳道I為空白對照；泳道2-7為市售的不同魚糜製品；泳道8為陽性對照即自製魚丸樣品(大豆蛋白的添加量為2 %)。從圖中可以看出，空白對照沒有條帶，陽性對照的目的條帶清晰，檢測的6種市售魚糜製品中均含有大豆蛋 白，與陽性對照(含有2 %大豆蛋白的自製魚丸)的條帶粗細相比可知，檢測的魚糜製品中，泳道2和3所代表的魚糜製品中含有的大豆蛋白含量最高，泳道4-6所代表的魚糜製品中含有的大豆蛋白含量次之，泳道7所代表的魚糜製品中含有的大豆蛋白含量較少，條帶較淡。以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明。所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，並不用於限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種抗STI單克隆抗體，其特徵在於，其製備方法為:將純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過高溫處理後免疫BALB/c小鼠，優選純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過100-1200C處理10-30 min ;經細胞融合，篩選獲得能分泌抗STI單克隆抗體的細胞株，經細胞培養獲得。
2.權利要求1所述的抗STI單克隆抗體,還包括將獲得的單克隆抗體通過ProteinGSepharose親和柱進行純化的步驟。
3.權利要求1或2所述的抗STI單克隆抗體的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟:將純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過高溫處理後免疫BALB/c小鼠，優選純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過100-120 °C處理10-30 min ;經細胞融合，篩選獲得能分泌抗大豆胰蛋白酶抑制劑單克隆抗體的細胞株，經細胞培養獲得抗體。
4.權利要求3所述抗STI單克隆抗體的製備方法，還包括將獲得的單克隆抗體通過Protein G Sepharose親和柱進行純化的步驟。
5.權利要求1或2所述抗STI單克隆抗體的用途。
6.權利要求5的用於檢測魚糜製品中大豆蛋白的用途。
7.一種用於檢測魚糜製品中大豆蛋白的方法，其特徵在於，包括如下步驟: 將待檢樣品用提取液抽提後，以製備的生物素標記的權利要求1或2所述抗STI單克隆抗體進行Western blot檢測分析。
8.權利要求7所述方法，其特徵在於，所述提取液為含有0.1 mmol/L DTT的6_8 mol/L尿素。
9.權利要求7所述方法，其特徵在於，所述生物素標記的權利要求1或2所述抗STI單克隆抗體是將權利要求1或2所述抗STI單克隆抗體經脫鹽處理後，與生物素混勻，於冰上孵育得到。
全文摘要
本發明涉及一種抗大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybeantrypsininhibitor,STI)抗體、製備方法及其用途。抗大豆胰蛋白酶抑制劑抗體製備方法為將純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過高溫處理後免疫BALB/c小鼠，優選純化的大豆胰蛋白酶抑制劑STI經過100-120oC處理10-30min；經細胞融合，篩選獲得能分泌抗STI單克隆抗體的細胞株，經細胞培養獲得。還包括將獲得的單克隆抗體通過ProteinGSepharose親和柱進行純化的步驟。本發明所得到的抗STI抗體還可用於檢測魚糜製品中大豆蛋白的添加。該檢測方法的靈敏度高，特異性好，準確性高，簡便快捷。
文檔編號G01N33/68GK103102413SQ20131001958
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者蔡秋鳳, 曹敏傑, 江韜玲, 沈建東, 劉光明, 蘇文金 申請人:集美大學