志賀氏菌檢測方法及其金標快速診斷試劑盒和製備方法

2023-09-10 12:57:15

專利名稱：志賀氏菌檢測方法及其金標快速診斷試劑盒和製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測志賀氏菌的方法。以及用於該方法的志賀氏菌金標快速 診斷試劑盒和其製備方法。
背景技術：
志賀氏菌屬(Shigella)的細菌通稱是痢疾桿菌，是細菌性痢疾的病原菌。臨床上 能引起痢疾症狀的病原微生物很多，有志賀氏菌、沙門氏菌、變形桿菌、大腸桿菌等，此外， 阿米巴原蟲、鞭毛蟲以及病毒等亦可引起人類痢疾，其中以志賀氏菌引起的細菌性痢疾最 為常見。人類對痢疾桿菌有很高的易感性。在幼兒中可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。志賀氏菌屬細菌的形態與一般腸道桿菌無明顯區別，為革蘭氏陰性桿菌，長約 2-3 μ m，寬0.5-0. 7 μ m。不形成芽孢，無莢膜，無鞭毛，有菌毛。DNA的G+C含量為49-53% 克每分子(Tm法)。該菌好氧或兼性厭氧，且營養要求不高，能在普通培養基上生長，最適生 長溫度為37°C，最適pH為6. 4-7. 8。37°C培養18- 小時後菌落呈圓形、微凸、光滑溼潤、 無色、半透明、邊緣整齊，直徑約2nm，宋內氏菌菌落一般較大，不透明，而且經常出現扁平的 粗糙型菌落。在液體培養基中呈均勻渾濁生長，無菌膜形成。此菌屬都能分解葡萄糖，產酸 不產氣。大多不發酵乳糖，僅宋氏菌遲緩發酵乳糖。靛基質產生不定，甲基紅陽性，VP實驗 陰性，不分解尿素，不產生對甘露醇的分解和產生吲哚的能力因菌種而異。根據生化反 應可進行初步分類。抗原構造與分型志賀氏菌屬細菌的抗原結構由菌體抗原(0)及表面抗原(K)組 成。主要抗原有以下三種型特異性抗原型多糖抗原為菌體抗原的一種，是光滑型菌株所含有的重要抗原。 當菌株變為粗糙型時，此抗原也常隨之消失。各菌型所含的型抗原不同，可用於區別菌種的 型別。群特異性抗原為光滑型菌株的次要抗原，也是菌體抗原的一種。特異性較低，常 在數種近似的菌內出現。在福氏菌株中，由於所含群抗原不同，可將某些菌型分為多種亞 型，如福氏菌2型，根據群抗原不同，可分成2a、2b兩個亞型。表面抗原(K抗原)在新分離的某些菌株菌體表面含有此種抗原。耐熱性差，加熱 100°C 1小時即被破壞。具有此種抗原的菌株，可阻止菌體抗原與相應免疫血清發生凝集。人和靈長類是志賀氏菌的適宜宿主，細菌經口感染，且感染僅限於胃腸道，很少侵 入血流。營養不良的幼兒、老人及免疫缺陷者更為易感。據報導，每年約有14000例志賀氏 菌病，但估計發病人數為30萬。據FDA統計，1997年美國加州等5個州食源性疾病共為8051例，其中志賀氏菌引 起的為1263例。志賀氏菌病常見為食物爆發型或經水傳播。志賀氏菌病相關的食品包括色拉(土 豆、金槍魚、蝦、通心粉、雞)，生的蔬菜，奶和奶製品，禽，水果，麵包製品，漢堡包及鰭魚類 等。志賀氏菌在擁擠和不衛生條件下可迅速傳播。經常發現於人員大量集中的地方，如餐廳、食堂等處。食源性志賀氏菌流行的最主要原因是從事食品加工行業人員患菌痢或帶菌 者汙染食品。食品接觸人員個人衛生差，存放已汙染的食品，或食品存放溫度不適當等。志賀氏菌感染具有傳染源廣、傳播速度快等特點，同時該菌的自然來源非常廣 泛。目前對其致病機制還不是很清楚。雖然近年來相關檢測技術取得了很大的進展，但仍 然存在一些缺陷。所以，進一步研究該菌的快速、準確、靈敏的檢測方法對食源性致病菌感 染的控制、疾病的診斷和流行病學調查非常重要。本發明採用志賀氏菌免疫家兔或羊，製備多表位抗體。免疫BALB/c小鼠製備單克 隆抗體。研製一種可適用於現場操作的金標快速診斷試劑盒，本試劑盒可快速(5-20分鐘 出檢測結果)特異性的檢測志賀氏菌，而且快速(5-20分鐘出結果)，可用於發病現場快速 診斷。本發明的公開本發明的第一目的是提供一種志賀氏菌的檢測方法。該方法為一步法檢測，反應 速度快、靈敏度高、特異性強，操作簡便，無需專門設備，適用於臨床檢測、流行病學調查和 場地檢疫等多種場合。本發明的第二目的是提供一種志賀氏菌金標快速診斷試劑盒。該試劑盒針對志賀 氏菌檢測提供一種簡便而且直接的一步法檢測。利用該試劑盒檢測志賀氏菌的反應速度 快，靈敏度高，特異性強，操作簡便，無需專門設施。本發明的第三目的是提供一種志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法。該方 法簡便、穩定性好、重複性好。本發明的第一目的可通過如下措施來實現一種志賀氏菌檢測方法包括以下步驟(1)將膠體金標記的抗志賀氏菌抗體載於 玻璃纖維或無紡布載體上，將膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被志賀氏菌抗體形 成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴於膠體金標記抗體 的載體上，如果上述樣品稀釋液含有志賀氏菌，則在檢測載體上形成紫紅色檢測線和控制 線雙線，則檢測結果判定為陽性，若僅有一條紅色的質控線，則檢測結果為陰性。本發明的第二目的可通過如下措施來實現一種志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的構成為內設志賀氏菌金標檢測卡組成。檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡內。所述的志賀氏菌金標 檢測條是在襯板上設有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和加樣端吸水層 之間設有金標誌賀氏菌抗體層，在檢測層上包被有由志賀氏菌抗體形成的檢測線和由羊、 兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。本發明的第三目的可通過如下措施來實現一種志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法主要包括首先製備金標抗體層和 檢測層的控制線和檢測線包被，然後再襯板上組合志賀氏菌金標測試條和檢測板。所述的金標抗體層的製備方法包括下述步驟i膠體金的製備，在濃度為 0. 008-0. 012% mg/ml的氯金酸中加入其體積的1. 4-2%、濃度為1-3% mg/ml的檸檬酸三 鈉，煮沸10-20分鐘，可得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記抗志賀氏菌抗體，在 膠體金溶液中用0. 2M碳酸鉀溶液調pH7. 8-8. 8，按l-6mg/100ml加入志賀氏菌抗體，攪拌 後，再在溶液中按0. 1-0. 6g/100ml加入動物血清蛋白，4°C靜置2_4小時；iii將上述膠體金溶液經2000轉/分鐘離心10-15分鐘，棄沉澱物，得上清液；iv將上清液經10000轉/分 鍾離心60-80分鐘，離心得沉澱物；ν將沉澱物按4-10ml的體積溶於0. 02M、pH7. 4Tris_HCI 緩衝液，最後得膠體金溶液，該緩衝液中含0. 2-0. 6%的動物血清蛋白和0. 01-0. 06% mg/ ml疊氮鈉；vi將玻璃纖維或無紡布浸入膠體金溶液至液體開始滲出為止，37°C乾燥過夜 形成金標抗體層。所述的檢測層的製備，是在纖維素膜上設有志賀氏菌抗體構成的檢測線 和有羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。其製備方法是在濃度為l_2mg/ml的或抗體溶液 中加入體積比為1-3%的固定劑，再利用噴膜機將抗體噴在纖維素膜上，噴膜後37V乾燥， 再用0. 01mlpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在37°C下封閉30分鐘，0. 01mlpH7. 0的PBS漂 洗，37°C乾燥。所述的固定劑選用甲醛、丙酮中的一種。本發明相比現有技術具有如下優點1、本發明檢測、診斷志賀氏菌的方法為一步法具有較高的特異性和靈敏性，且操 作簡便，無需專門設施和設備。2、本發明的診斷試劑盒檢測志賀氏菌時具有較高的特異性和靈敏性，檢測過程操 作迅速、快捷、方便，適用於臨床檢驗。流行病學調查和場地檢疫等多種場合。3、本發明的診斷試劑盒的製備方法簡便、穩定性好、重複性好。圖面說明

圖1是發明檢測板的外觀結構示意圖1-檢測板 2-加樣孔 3-觀察孔圖2是本發明檢測板的內部結構示意圖4-加樣端吸水層 5-金標抗體層 6-控制線7-檢測線8-檢測層 9-吸水端吸水層 10-襯板本發明的實施方式本發明還將結合實例作進一步詳述實施例一一種志賀氏菌檢測方法包括下述步驟(1)將膠體金標記的抗志賀氏菌抗體載於 玻璃纖維或無紡布載體上，並與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被志賀氏菌抗體 形成的檢測線，和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴於膠體金標記 的載體上。如果上述稀釋液含有志賀氏菌則在檢測載體上形成紫紅色檢測線和控制線雙 線，則檢測結果判定為陽性，若僅有一條紅色控制線而無檢測線出現，則檢測結果判定為陰 性。參照圖1，一種志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的組成為內設志賀氏菌金標檢測 卡1。參照圖2，所述的志賀氏菌金標檢測卡1是在襯板10上設有加樣端吸水層4、檢測 層8和吸水端吸水層9。在檢測層和加樣端吸水層9之間設有金標誌賀氏菌抗體層5。在 檢測層8上包被有檢測線7和控制線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層濾 紙製成；檢測層8為纖維素膜，該纖維素膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；金標抗體層為 玻璃纖維或無紡布浸取膠體金抗體製成。
一種志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法主要包括製備金標抗體層(5)和 檢測層(8)、控制線(6)和檢測線(7)的包被，然後再襯板(10)上組合志賀氏菌金標測試條 和檢測卡(1)。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣端吸水層4和吸水端吸水層9 ；在其中 段粘貼包被檢測線和控制線的纖維素膜層8。在加樣端吸水層4與纖維素膜層8的交接部 位。夾貼含金標抗體5的玻璃纖維。玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水層4中間，1/5部分 在纖維素膜層8上，然後按4毫米寬、8釐米長規格切條，在組裝於金標檢測盒內。盒蓋上加 樣孔2正對測試條的加樣端吸水層4，觀察孔3正對纖維素膜的檢測層8。本權利要求書中所述的金標抗體層5的製備方法包括下述步驟i膠體金的製備， 稱取0. Img氯金酸溶於IOOOml三蒸水中，加入15ml、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸15分 鍾，冷卻後得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記志賀氏菌抗體，取IOOml膠體金溶 液，用0. 2M碳酸鉀溶液調pH8. 5，加入^ig志賀氏菌抗體，攪拌20分鐘，再加入MOmg牛血 清白蛋白，繼續攪拌5分鐘，4°C靜置2-4小時；iii將上述膠體金溶液經2000轉/分鐘離心 10分鐘，棄沉澱物，得上清液；iv將上清液經10000轉/分鐘離心60分鐘離心得沉澱物；V 將沉澱物按4-10ml/100ml的體積比溶於0. 02M、pH7. 4Tris_HCI緩衝液得膠體金溶液，該緩 衝液中含有0. 25% mg/ml的牛血清白蛋白和0. 02% mg/ml疊氮鈉；vi用膠體金溶液浸沒 玻璃纖維或無紡布，至其上有膠體金液體滲出為止。在37°C下乾燥2小時，即形成金標抗體 層5。所述膠體金標記抗體為羊、兔抗志賀氏菌抗體。所述的檢測層8是在硝酸纖維素膜上設有志賀氏菌抗體構成的檢測線7和由羊或 兔抗鼠IgG抗體形成的控制線6。其製備方法是取志賀氏菌抗體，調濃度至lmg/ml，加入 2%的甲酸，用噴膜機在纖維素膜中段噴檢測線7 ；再取羊或兔抗鼠IgG調濃度為2mg/ml，加 入2%的甲醛，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0. 5cm處，噴控制線6，按20ul/10cm設 置噴膜量，噴膜後置於37°C乾燥2小時，再用0. 01mol/lpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在 37°C下封閉30分鐘，0. 01mlpH7. 0的PBS漂洗，37 °C乾燥。實施例二 志賀氏菌檢測方法及其金標快速診斷試劑盒與例一同。該試劑盒的製備方法除製備膠體金標記的抗體為抗志賀氏菌單克隆抗體外，其他 條件與例一同。
權利要求
1.一種志賀氏菌檢測方法，其特徵在於(1)將膠體金標記的志賀氏菌抗體(多抗和單 抗)載於玻璃纖維或無紡布載體上，並與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被抗志 賀氏菌抗體(多抗或單抗)形成的檢測線和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。(2)取 檢測樣本稀釋液滴於膠體金標記抗體的載體上，如果上述樣本中含有志賀氏菌則在檢測載 體上形成紫紅色的檢測線和控制線兩條線，則檢測結果判定為陽性；若僅控制線顯色，則結 果判定為陰性。
2.一種志賀氏菌金標記快速診斷試劑盒，其特徵在於該試劑盒內設志賀氏菌金標檢測 卡，檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡盒內。
3.如權利要求2所述的志賀氏菌金標快速診斷試劑卡，其特徵在於所述的志賀氏菌金 標檢測卡(1)是在襯板(10)上設有加樣端吸水層G)、檢測層(8)和吸水端吸水層(9)，在 檢測層⑶和加樣端吸水層⑷之間設有金標誌賀氏菌抗體層(5)，在檢測層⑶上包被有 檢測線(7)和控制線(6)。
4.如權利要求2所述的志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於製備金 標抗體層(5)和檢測層(8)的控制線(6)、檢測線(7)的包被，然後在襯板(10)上組合志賀 氏菌金標測試條和檢測卡(1)。
5.如權利要求4所述的志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的 金標抗體層(5)的製備方法包括下述步驟i膠體金的製備，在濃度為0. 008 0. 012%的 氯金酸中加入其體積的1. 4 2%、濃度為1 3%的檸檬酸三鈉，煮沸10 20分鐘，可得 到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標記抗志賀氏菌單克隆抗體，在膠體金溶液中用 0. an碳酸鉀溶液調pH7. 8 8. 8，按1 6mg/100ml加入抗志賀氏菌單克隆抗體，攪拌後，再 在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入動物血清蛋白，4°C靜置2_4小時；iii將上述膠體金溶 液經2000轉/分鐘離心10 15分鐘，棄沉澱物，得上清液；iv將上清液經10000轉/分鐘 離心60 80分鐘離心得沉澱物；ν將沉澱物按4-10ml/100ml溶於0. 02M、pH7. 4Tris_HCI 緩衝液得膠體金溶液，該緩衝液中含0. 2-0. 6%的動物血清蛋白和0. 01-0. 06%疊氮鈉；vi 將上述膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止，37°C乾燥過濾形成金標抗 體層。
6.如權利要求4或5所述的志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所 述膠體金標記抗體為羊或兔抗志賀氏菌抗體或志賀氏菌單克隆抗體。
7.如權利要求4所述的志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的 檢測層(8)是在纖維素膜上設有羊或兔志賀氏菌抗體或志賀氏菌單克隆抗體構成的檢測 線⑵和由抗羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
8.如權利要求7所述的志賀氏菌金標快速診斷試劑盒的製備方法，其特徵在於所述的 固定劑為甲醛或丙酮。
全文摘要
本發明涉及一種用於檢測志賀氏菌的方法，以及用於該方法的金標快速診斷試劑盒和其製備方法，其檢測方法包括(1)將膠體金標記的抗志賀氏菌抗體載於玻璃纖維或無紡布載體上，並在與膠體金標記抗體載體相連的檢測載體上包被抗志賀氏菌抗體形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；(2)取樣品稀釋液滴於膠體金標記抗體的載體上，如上述稀釋液含有志賀氏菌，則在檢測載體上形成檢測線和控制線雙線，結果判定為陽性；僅控制線顯色，結果判定為陰性。該試劑盒由檢測卡組成，檢測卡由檢測條和塑料卡盒組成，檢測條安裝在塑料卡內，檢測條是在襯板上設有加樣端吸水層、檢測層和吸水端吸水層，在檢測層和加樣端吸水層之間設有金標誌賀氏菌抗體層，在檢測層上包被有由抗志賀氏菌單抗形成的檢測線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。
文檔編號G01N33/558GK102135537SQ201010272888
公開日2011年7月27日 申請日期2010年9月3日 優先權日2010年9月3日
發明者周海飛, 張遠興, 李克生, 李志遠, 杜惠芬, 鄭悅, 馬國榮 申請人:李克生