具溶膠-凝膠轉變特性的溫敏型三嵌段共聚物及製備方法

2023-09-11 04:05:40 2

專利名稱：：具溶膠-凝膠轉變特性的溫敏型三嵌段共聚物及製備方法
技術領域：
：本發明涉及醫藥用高分子材料領域，具體涉及一種溫度敏感的，具有溶膠-凝膠轉變特性且可生物降解的三嵌段共聚物及其製備方法和用途。技術背景近年來，可生物降解環境敏感性水凝膠由於其良好的敏感性、生物降解性和生物相容性受到了國內外學者的廣泛關注。環境敏感性水凝膠又被稱為智能水凝膠，是指自身能感知外界環境(如溫度、pH值、光、電、壓力等)的變化或刺激，並能產生相應的物理結構和化學性質變化的一類高分子水凝膠。其中，溫度敏感性物理水凝膠由於其在藥物控制釋放系統、細胞包埋和組織修復等領域方面具有廣闊的應用前景而備受關注。目前，文獻和專利中報導的隨著溫度升高具有溶膠-凝膠轉變特徵的生物醫用高分子材料包括殼聚糖/甘油磷酸、泊洛沙姆(Pluronic)、聚乙二醇-聚乙丙交酯-聚乙二醇(PEG-PLGA-PEG)三嵌段共聚物，但目前這些材料由於自身分子結構的原因而存在各種的缺陷。如泊洛沙姆不可降解且凝膠強度低；殼聚糖/甘油磷酸水凝膠降解速度難以控制；PEG-PLGA-PEG水凝膠強度低且價格昂貴。由於良好的生物相容性和環境變化敏感性，泊洛沙姆(PluronicorPoloxamer，PEG-PPG-PEG)作為一種藥物控制釋放體系被廣泛研究。但是，泊洛沙姆的臨界凝膠濃度較高，凝膠強度較弱，並且不能生物降解，這些缺點限制了泊洛沙姆在生物醫學領域的廣泛應用。申請號為03100434.2的中國專利申請中公開了一類聚乙二醇(PEG)嵌段修飾的聚己內酯(PCL)共聚物，其中具體公開了由相對分子質量為2000、4000的PCL和相對分子質量為2000、4000的PEG合成的PEG(2000、4000)-PCL(8000、4000)-PEG(2000、4000)兩親性三嵌段共聚物，相對分子質量大，該發明中公開的聚乙二醇(PEG)嵌段修飾的聚己內酯(PCL)共聚物用有機溶劑配製成溶液，再在水中自組裝成納米粒子或膠束，該納米粒能夠在體內降解，降解產物無毒無害，其納米粒能夠在水中分散形成穩定分散液，"是開發疏水性藥物長效緩釋製劑的優良輔料"，缺點在於該PEG-PCL-PEG共聚物在水中不溶解。
發明內容本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種嵌段共聚物。該嵌段共聚物是PCL修飾嵌段共聚物，其相對分子質量為10006000，其中PCL鏈段的總相對分子質量與PEG鏈段的總相對分子質量的比值為l.42.6。優選的，上述嵌段共聚物中PCL的相對分子質量與PEG的相對分子質量的比值優選為1.752.25。更優選的，上述嵌段共聚物中PCL的相對分子質量與PEG的相對分子質量的比值為2。優選的，上述嵌段共聚物的相對分子質量為15005000。上述嵌段共聚物能夠溶解於水中，其水溶液隨著溫度升高而發生Sol相Gel相的相轉變，相轉變溫度在25。C35。C。進一步的，上述嵌段共聚物為E5so-C2000-E550、E55o-C2200-E550、E75o-C2200-E750、E750-C3000-E750;其中的E表示PEG，C表示PCL，下標分別表示相應各鏈段的相對分子質量。本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種製備上述的PEG-PCL-PEG共聚物的方法。該方法包括下述步驟a、以辛酸亞錫為催化劑，採用MPEG在130-15(TC加熱反應3-12小時引發己內酯開環聚合，得到MPEG-PCL二嵌段共聚物；b、將步驟a所得MPEG-PCL二嵌段共聚物該共聚物用二異氰酸酯做交聯劑在真空狀態下繼續反應O.5-2小時，得到PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物；c、將步驟b所得PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物材料在氮氣保護下冷卻至室溫，提純後在室溫下冷凍乾燥後保存備用。其中，上述的製備溫度敏感型PEG-PCL-PEG共聚物的方法中所述的二異氰酸酯為甲苯二異氰酸酯、1，6-己二異氰酸酯、二苯基甲烷-4，4'-二異氰酸酯、異佛爾酮二異氰酸酯中的至少一種。本發明所要解決的第三個技術問題是提供上述嵌段共聚物在藥物在製備藥物釋放控制體系、組織工程材料、可降解水凝膠中的用途。本發明嵌段共聚物特別適合用於製備局部釋放控制藥物體系、溫度敏感性栓塞材料、可注射且可降解組織工程支架材料等領域。本發明所要解決的第四個技術問題是提供一種藥物組合物。該藥物組合物是上述的嵌段共聚物裝載藥物活性成分製備而成的。本發明PEG-PCL-PEG(可表示為PECE)嵌段共聚物正常條件下是固體或粘稠液體，可溶於水，其水溶液具有25'C35'C的臨界凝膠溫度(CGT)。也就是說在其水溶液中，當其濃度等於或大於臨界凝膠濃度(CGC)的情況下，當溫度升高到臨界凝膠溫度(CGT)以上時，會發生溶膠(Sol)相向凝膠(Gel)相的相轉變。本發明嵌段共聚物所製備成的水凝膠的凝膠強度可以在滿足上述對臨界凝膠溫度(CGT)的要求的情況下，通過調整PCL和PEG段的長度和相對比例進行調節。一般情況下，採取本領域的常規措施，可增加其凝膠強度，以滿足在溫度敏感性栓塞材料及組織工程支架材料等領域的應用需要。本發明三嵌段共聚物所製備成的水凝膠的降解速度可以在滿足上述對臨界凝膠溫度(CGT)的要求的情況下，通過調整PCL和PEG段的長度和相對比例進行調節，以滿足對降解速度有特殊要求的相關應用領域的需要。一般情況下，採取本領域的常規措施可以調節其降解速度，從而達到一定程度的定時緩控釋要求。本發明創造性地提供了具有溫度敏感型的PEG-PCL-PEG嵌段共聚物，其具有25'C35'C的臨界凝膠溫度(CGT)、降解速度可調、凝膠強度可調、生物相容性好、可能以粉末形式保存、製備凝膠不需要使用有毒的溶劑等優異的特性，而這些特性決定了本發明溫度敏感型三嵌段共聚物在藥物釋放控制體系、組織工程領域、可降解水凝膠及生物醫用高分子材料等應用領域具有極好的應用前景，為需要使用溫度敏感型共聚物的領域提供了一種新的選擇。本發明方法操作簡便，產物得率高、純度高、性質可控，適合於大規模生產應用。圖1為二嵌段PCL-PEG共聚物(A)與三嵌段PEG-PCL-PEG共聚物(B)的紅外光譜對比圖。圖2為PEG-PCL-PEG共聚物的核磁測試圖譜。圖3為E550-C2，-E55o水凝膠在3(TC(a)與在37。C(b)時的示意圖。圖4為VB^從VB^/PECE(E55o-C22oo-E55o)複合物中的藥物釋放行為。其中A表示水凝膠的濃度對藥物釋放行為的影響，其VB^含量是0.8毫克；B表示VB^的含量對藥物釋放行為的影響，其凝膠濃度為30%。圖5和厚樸酚從和厚樸酚/PECE(E550-C2，-E55o)水凝膠複合物中的釋放行為，其凝膠濃度為30%。圖6為BSA從BSA/PECE(E550-C2，-E550)水凝膠複合物中的釋放行為。其中A表示BSA初始含量對其釋放行為的影響，其凝膠濃度為30%;B表示水凝膠濃度對藥物釋放行為的影響。其BSA含量是4毫克。圖7表示將PEG-PCL-PEG共聚物(PECE)、F127分別注射入老鼠皮下後的水凝膠形成及降解。其中A、B、C、D分別是PECE水凝膠注射入老鼠皮下後1天、3天、7天、14天；E、F分別是泊洛沙姆F127在注射入老鼠皮下2小時、4小時。圖8表示PECE水凝膠的相轉變曲線。其中A表示PCL鏈段分子量對相轉變曲線的影響，B表示水凝膠總分子量對相轉變曲線的影響。下面結合附圖通過具體實施方式進一步描述但不限制本發明。具體實施例方式本發明實施例使用的主要試劑和儀器己內酯(e-CL，AlfaAesar公司，分析純)聚乙二醇單甲醚(MPEG，Mn=550，750，1000，Aldrich公司，分析純)辛酸亞錫(Stannousoctoate，Sigma公司，分析純)異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI，Aldrich公司，分析純)Varian400型核磁共振儀(美國Varian公司)200SXV型傅立葉紅外光譜儀(Nicolet公司)實施例一本發明PEG-PCL-PEG共聚物的合成和驗證1)本發明PEG-PCL-PEG共聚物的合成本發明PEG-PCL-PEG共聚物的簡要合成路線如下所示formulaseeoriginaldocumentpage8其中的X、Y均為正整數。根據上式的合成路線，在裝有攪拌器的三口燒瓶中加入一定量的聚乙二醇單甲醚(MPEG)和己內酯(e-CL)，以辛酸亞錫為催化劑，在13(TC、氮氣保護的條件下反應6小時，降溫至8(TC，加入交聯劑異氟爾酮二異氰酸酯(IPDI)再繼續反應6小時後得到產物，冷卻至室溫提純，烘乾。此外，適合的二異氰酸酯還包括甲苯二異氰酸酯、1，6-己二異氰酸酯、二苯基甲烷-4，4'-二異氰酸酯等。根據上述方法，合成了E550—C20OO—E550、E55O—C22OO—Es50、E75O—C2200—E750、E750-C3000-E750等具符合要求的共聚物(見表l)。表1本專利所合成的PECE共聚物tableseeoriginaldocumentpage10a根據投料比計算出來的理論值b根據核磁共振氬譜測試結杲計算出來的數值；o'根據凝膠滲透色譜分析結杲計算出來的數值，PDI為分子量分布。200810300757.7勢溢也被7/ll:a;2、本發明PEG-PCL-PEG共聚物的驗證(1)、本發明PEG-PCL-PEG共聚物的表徵方法用傅立葉紅外光譜儀(FTIR)(200SXV，Nicolet)，採用KBr壓片法對合成的共聚物進行紅外光譜分析。4-NMR用核磁共振儀(Varian400，Varian)測量，在400腿Z下，溶劑為CDC13，以四甲基矽烷為內標。(2)、本發明PEG-PCL-PEG共聚物的驗證與表徵在本試驗中，PEG-PCL-PEG共聚物表示成Ey-C2X-EY，其中2X和Y分別代表共聚物中PCL和PEG的分子量。傅立葉紅外光譜(見圖l)和核磁共振氫譜(見圖2)用來檢測共聚物的結構和分子量。結果表明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物成功合成。圖1是對E750-d5(k)二嵌段共聚物和E750-C3000-E750三嵌段共聚物的紅外光譜的分析比較。從圖中可以看出，PEG的特徵峰在兩圖中均出現，在1105cm—工處的吸收峰是PEG中C-0-C的特徵峰。在1734cm—工處的強吸收峰是反應後得到的二嵌段共聚物中酯鍵的特徵峰，可見二嵌段共聚物成功合成。在B圖中，在2250-2270cm—工處未出現吸收峰，說明交聯劑異氟爾酮二異氰酸酯中的-NCO基團已經完全反應掉。而在1525cm—工處的吸收峰，則是反應後產生的一NHCO—的特徵吸收峰。所以，PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物成功合成。在圖2的4-NMR圖譜中，在3.60和3.38卯m處的尖峰分別代表了MPEG中-CH2CH20-禾口-0CH3基團的氫原子。而在1.35、1.62、2.30和4.06ppm處的峰則分別代表了PCL中-(CH2)3-，-0CCH2-和-CH200C-基團中的氫原子。在4.20和3.82卯m處兩個較弱的峰分別代表了與PCL相連的PEG中-0-CH2-CH2-兩個亞甲基上的氫原子。在O.96和1.11ppm處的峰則分別代表了IPDI中-CH3和-CH2-基團的氫原子。3、本發明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的結構和分子量的進一步確定為了進一步確定PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的結構和分子量，對樣品進行了核磁共振氫譜檢測。實施例一中合成的各種PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的分子量和PEG與PCL的嵌段比例根據核磁共振氫譜檢測來確定。根據上述試驗結果可以得出結論本實施例已經成功地合成了理論值為E550-。2000-E550、E55O-C22OO-Es50、E75O-。2200-E750、E75O-。3000-E75o等的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物。實施例二本發明PEG-PCL-PEG共聚物的溶膠-凝膠轉變特性研究在本發明中，採用試管法測試凝膠-溶膠轉變溫度。當體系處於流動液體狀態時，稱之為溶膠態(Sol);當體系處於不流動固體狀態時，稱之為凝膠態(Gel);當體系處於乳白色懸濁狀態時，稱之為懸濁態(Sus);當體系中水相與聚合物相分離時，稱之為沉澱態(Pr印)。1、本發明PEG-PCL-PEG共聚物水溶液的製備稱取上述實施例一製備的不同分子量的PEG-PCL-PEG共聚物，按重量百分比分別是10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%的不同濃度加入到二次蒸餾水(即雙蒸水)中充分均勻溶解，定容4ml。在4'C的條件下保存備用。2、本發明PEG-PCL-PEG凝膠溫度響應特性圖3為E55『C2扁-E55o三嵌段共聚物溶液分別在3(TC和37。C時狀態示意圖。可以看到，當溫度低于于體溫時(30°C)，PEG-PCL-PEG水溶液顯透明狀態，具有流動性；在溫度為37。C時，PEG-PCL-PEG水溶液顯透明固體態，失去流動性。溫度的變化造成了系統的溶膠-凝膠轉變。3、本發明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物凝膠-溶膠轉變溫度的影響因素實驗本發明PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物是一種兩親性的聚合物，它的水溶液隨著溫度升高表現出特有的溶膠-凝膠轉變特性。這種轉變主要受到聚合物分子結構中親水鏈段和疏水鏈段比例和長度的影響(見圖8)，同時也受到水凝膠的熱歷史，測試時的體積，冷藏儲存時間以及共聚物溶於水形成凝膠時的溫度等因素的影響。同時還考察了保持共聚物中親水鏈段PEG和疏水鏈段PCL的比例不變，增加總分子量對凝膠-溶膠轉變相圖的影響(見圖8)。實驗結果表明，PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的凝膠-溶膠轉變相圖不僅受到分子內親水疏水鏈段比例的影響，也部分受到親水疏水鏈段長度的影響。實驗結果表明，在試管法測試溶膠-凝膠轉變時，凝膠體系的體積和共聚物溶於水形成凝膠時的溫度是比較重要的參數，不同參數可以得到有一定差異的測試結果。由上述實驗可知，除了共聚物的分子組成外，許多其他因素都對本發明共聚物水凝膠體系的溶膠-凝膠轉變溫度有著一定影響。通過對這些參數的微調，水凝膠系統的溶膠-凝膠轉變溫度可以在一個比較確定範圍內調節，這有助於本發明PEG-PCL-PEG共聚物的水凝膠作為可注射藥物控制釋放系統的應用。實施例三PEG-PCL-PEG共聚物一藥物複合物的製備和釋放實驗在本實施例中，使用上述實施例製備的共聚物分別裝載了3種藥物製備成PEG-PCL-PEG共聚物一藥物複合物，包括大分子蛋白藥物(模型藥物為牛血清蛋白BSA)、小分子親水藥物(模型藥物為VB^)、小分子疏水藥物(模型藥物為和厚樸酚Honokiol)。1、小分子親水藥物(維生素B^)的PEG-PCL-PEG複合物製備和藥物釋放行為首先配製200微升的PEG-PCL-PEG(E55o-C22oo-E55o)的水溶液(PEG-PCL-PEG重量含量為30。/。wt或20。/。wt)，然後在PEG-PCL-PEG水溶液中分別加入O.8毫克、2毫克的小分子親水藥物VB12，混合均勻。接著將所得溶液加入到5毫升的EP管中，在37。C保持12小時製成凝膠，然後將所得凝膠中加入2毫升的磷酸鹽緩衝溶液PBS(pH=7.4)，在空氣浴搖床中進行藥物釋放實驗，在時間丁=0.5h，lh，2h，4h，8h，12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h和168h時分別取樣。採用紫外可見分光光度計測定VB^的濃度(波長為362nm)，從而研究其藥物釋放行為。VB^的累計釋放量根據下列公式計算得到其中的Q為累計釋放量，Cn為時間t時VB^的濃度，Vt溶劑體積(Vt=2mL)，Vs為從上清液中移除的溶液體積(Vs=lmL)。檢測結果見圖4。2、小分子疏水藥物(和厚樸酚)的PEG-PCL-PEG複合物製備和藥物釋放行為使用和厚樸酚研究小分子疏水性藥物和本發明PEG-PCL-PEG共聚物組成的複合體系在體外的釋放行為。複合體系的製備方法和試驗方法基本同上，只是複合物載藥量改為用200yl共聚物分別裝載lmg和2mg和厚樸酚，檢測改為用HPLC系統(WatersAlliance2695)檢測和厚樸酚的濃度。進樣系統加裝有加熱恆溫裝置和自動進樣器，使用Waters2996檢測器檢測信號。色譜柱為反相C18柱(4.6X150mm-5um，SunfireAnalysis產品)，柱溫保持在28°C，使用乙腈/水(60/40，v/v)系統洗脫，流速為lmL/min。標準曲線方程為H=105000*X+4680(H:峰面積;X:和厚樸酚的濃度)，相關係數為O.999994。檢測結果見圖53、大分子蛋白藥物(牛血清蛋白BSA)的PEG-PCL-PEG複合物的製備和藥物釋放行為將牛血清蛋白BSA作為一種模式蛋白藥物用來研究本發明PECE水凝膠裝載的蛋白或多肽類藥物在體外的釋放行為。製備試驗過程同上，初始的藥物裝載量分別為4mg和10mg.溶出的BSA總量用BCA蛋白分析試劑盒(PIERCE公司，USA)進行檢測.然後用SDS-PAGE確定BSA的穩定性，結果見圖6。上述試驗結果表明，本發明PEG-PCL-PEG複合物能夠分別裝載大分子蛋白藥物(牛血清蛋白BSA)、小分子親水藥物(VB12)、小分子疏水藥物(和厚樸酚Honokiol)作為活性成分製成藥物複合物，並在磷酸鹽緩衝溶液PBS(pH=7.4)中實現較長時間的緩釋作用。實施例四本發明藥物組合物體內相轉變、降解及安全性試驗將實施例一製備的E550—C2ooo—E550、E550—C2200—E5550、E75o—C2200—E575o或E750-C3000-E75o溶解於生理鹽水(或葡萄糖注射液)中，在低於2(TC的溫度下配製成一定濃度的水溶液，皮下注射入小鼠體內，約30秒鐘後，在小鼠皮下形成凝膠塊，14天後該凝膠塊消失。同時用泊洛沙姆(泊洛沙姆F127，美國Fluka公司產品)作為對照，在注射入老鼠皮下4小時後，泊洛沙姆F127形成的凝膠塊消失(見圖7)。另外，按照注射用藥的安全性試驗要求，分別用本發明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物水凝膠進行了皮下、胸腔、腹腔注射實驗，沒有明顯不良反應出現，然後檢測實驗組的心肌，肝，脾，肺腎，胃，腸等組織，與空白對照組相比沒有明顯差異，結果表明本發明試驗結果表明PEG-PCL-PEG共聚物安全性良好，符合用藥要求。上述實驗結果表明，本發明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物能夠在體內生物慢速降解，且降解產物無毒無害，是一種優良的藥物釋放載體，是藥物緩釋製劑和局部釋放製劑的新載體。上述實例表明，本發明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物具有25。C35。C的臨界凝膠溫度(CGT)、降解速度可調、凝膠強度可調、生物相容性好、能以粉末的形式保存、製備凝膠不需要用有毒的溶劑等優秀的特性，而這些特性決定了本發明溫度敏感型三嵌段共聚物在藥物釋放控制體系、組織工程領域、可降解水凝膠及生物醫用高分子材料等應用領域具有極好的應用前景，為需要使用溫度敏感型共聚物的領域提供了一種新的選擇。權利要求1.一種嵌段共聚物，其特徵在於為PEG-PCL-PEG共聚物，其相對分子質量為1000～6000，其中PCL鏈段的總相對分子質量與PEG鏈段的總相對分子質量的比值為1.4～2.6。全文摘要本發明涉及醫藥用高分子材料領域，具體涉及一種溫度敏感的，具有溶膠-凝膠轉變特性且可生物降解的三嵌段共聚物及其製備方法和用途。該三嵌段共聚物為PEG-PCL-PEG共聚物，隨溫度升高而從Sol～Gel相轉變，轉變溫度在25℃～35℃。實驗結果表明，本發明PEG-PCL-PEG嵌段共聚物具有多種優良特性，為需要使用溫度敏感型共聚物的領域提供了一種新的選擇。文檔編號A61L31/06GK101255235SQ20081030075公開日2008年9月3日申請日期2008年3月28日優先權日2007年3月28日發明者霞趙,錢志勇,魏於全申請人:四川大學