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金絲桃素提純方法

2023-09-18 17:31:55 2

專利名稱:金絲桃素提純方法
技術領域:
本發明涉及金絲桃素製備技術,尤其是指一種金絲桃素提純方法。
背景技術:
金絲桃素在貫葉金絲桃全草中的含量只有萬分之幾,市場上貫葉金絲桃提取物中 金絲桃素含量也僅有0. 3%左右。目前,對金絲桃素的研究主要集中在其提取工藝上,而對 高純度的金絲桃素提純工藝研究較少。現有的高純度金絲桃素的分離過程中主要利用大孔 樹脂、聚醯胺、矽膠等常規分離介質來製備金絲桃素,這種方式不僅工藝繁雜、金絲桃素純 度低、得率不高,而且生產過程中需使用大量具有較高毒性的有機溶劑而不夠環保,並且易 造成對成品的汙染。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是,提供一種金絲桃素提純方法,以便從貫葉金絲桃 浸膏中分離純化高純度金絲桃素。為解決上述技術問題,本發明採用如下技術方案一種金絲桃素提純方法,包括如 下步驟
準備步驟將貫葉金絲桃浸膏粉碎,並加入乙醇溶液溶解後進行超聲提取獲得提取液, 然後在提取液中加入明膠溶液除鞣,製得貫葉金絲桃浸膏除鞣液;
PEK微球層析步驟將PEK微球與蒸餾水混懸,轉入層析柱,待PEK微球沉降完全後, 以蒸餾水平衡柱床,取適量貫葉金絲桃浸膏除鞣液溼法上樣於PEK微球層析柱頂部,再用 水-乙醇溶液體系進行梯度洗脫,並收集最後一次洗脫的洗脫液,濃縮製得金絲桃素粗品; PDCX微球層析步驟將PDCX微球與丙酮溶液混懸,轉入層析柱,待PDCX微球沉降完全 後,以丙酮溶液平衡柱床,取以上製得的金絲桃素粗品以丙酮溶液充分溶解後取適量溼法 上樣於PDCX微球柱頂部,再用丙酮溶液進行梯度洗脫,並收集最後一次洗脫的洗脫液,濃 縮並調整PH值至2 3,低溫下靜置12 士0.釙後離心分取沉澱,上清液再置於低溫下靜置 12士0. 5h,隨後再離心得沉澱,合併沉澱得金絲桃素精品;
ODS層析步驟將反相矽膠填料與色譜純甲醇混懸,轉入層析柱,待反相矽膠微球沉降 完全後,以甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液平衡柱床,取以上製得的金絲桃素精品以甲醇充分溶 解後取適量上樣於層析柱頂部,以甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液洗脫,分步收集洗脫液,HPLC檢 測後合併相同的成分,獲得金絲桃素提純物。進一步地,準備步驟中,用於與貫葉金絲桃浸膏的粉碎物溶解的乙醇溶液為體積 百分比濃度為60%的乙醇溶液,貫葉金絲桃浸膏與乙醇溶液的配比比例為每1克貫葉金絲 桃浸膏使用6 8mL60%的乙醇溶液,且溶解後超聲提取的時間為30士2分鐘。進一步地,準備步驟中,加入的明膠溶液為10%明膠溶液,加入量為超聲提取液的 1/5 1/4。進一步地,在加入明膠溶液後再調整溶液中乙醇的體積濃度至75% 80%,避光靜置12士0. 5h後,過濾濃縮後即製得貫葉金絲桃浸膏除鞣液。進一步地,PEK微球層析步驟中,PEK微球的粒徑為35 45 μ m,層析柱徑高比 1:10 3. 5。進一步地,PEK微球層析步驟中,梯度洗脫時所用的試劑依次分別為1 2. 5倍柱 體積的水、1 3倍柱體積的10%乙醇溶液、1. 5 6倍柱體積的30%乙醇溶液、1. 5 4倍 柱體積的40%乙醇溶液、4 8倍柱體積的60%乙醇溶液。進一步地,PDCX微球層析步驟中,PDCX微球的粒徑為25 35 μ m。進一步地,PDCX微球層析步驟中,分別用於與PDCX微球混懸、平衡柱床以及溶解 金絲桃素粗品的丙酮溶液均為30%丙酮溶液。進一步地,PDCX微球層析步驟中,梯度洗脫所用的丙酮溶液依次分別為1 2倍 柱體積的30%丙酮溶液、1 1. 5倍柱體積的50%丙酮溶液、3 8倍柱體積的70%丙酮溶液。進一步地,PDCX微球層析步驟中,使用鹽酸將濃縮液的PH值調至2 3 ;而在 ODS層析步驟中所使用的甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液中甲醇與磷酸氫二鈉的體積比比值為 87. 5/12. 5,且甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液預先以磷酸將PH值調至6. 5。本發明的有益效果如下本發明利用納米微球材料來分離純化金絲桃素,其中, PEK微球具有機械強度高,化學穩定性好,可耐受較寬的PH和多種有機溶劑,對金絲桃素的 吸附量較大,解吸附率高,金絲桃素回收率達到90. 0%以上;而PDCX微球化學穩定性好,可 耐受較寬的PH和多種有機溶劑,具有較高的分離度,適用於金絲桃素的精純。相對於諸如 矽膠、大孔樹脂等傳統的層析填料,納米微球材料吸附量大,金絲桃素回收率高,最終產品 中金絲桃素含量可達90%以上;此外,本發明方法步驟簡便、主要使用乙醇、丙酮等低毒性 有機溶劑,且用量少,填料可重複使用,具有經濟、環保的優點。


圖1是本發明金絲桃素提純方法的流程示意圖。
具體實施例方式如圖1所示,本發明提供一種金絲桃素提純方法,包括如下步驟
準備步驟將從市場上購買的貫葉金絲桃浸膏粉碎後,按1:6 8的比例加入60%( V/ V,體積百分比)的乙醇溶液超聲提取30min後,加入提取液體積1/5 1/4的10%(V/V,體積 百分比)明膠溶液,調乙醇濃度達75% 80%,避光靜置12 士0. 5h,過濾濃縮至原體積1/5 1/4製得貫葉金絲桃浸膏除鞣液,本步驟中的貫葉金絲桃浸膏可直接從市場上購買獲得,本 發明實施方式中採用的是寧波神馬公司生產的貫葉金絲桃浸膏,其金絲桃素3 0. 3%。PEK微球層析步驟PEK微球為甲基丙烯酸酯型聚合物微球,粒徑為35 45 μ m, PEK微球與蒸餾水混懸,轉入層析柱,該層析柱的徑高比為1 10 3. 5,待PEK微球沉降完 全後,以1 2倍柱體積的蒸餾水平衡柱床,取貫葉金絲桃浸膏除鞣液1 1. 25倍層析柱 體積,溼法上樣於PEK微球層析柱頂部,再使用水-乙醇溶液體系進行梯度洗脫,收集最後 一次洗脫的洗脫液,濃縮製得金絲桃素粗品,即富集的總金絲桃素溶液。PDCX微球層析步驟PDCX微球為苯乙烯型聚合物微球,粒徑為25 35 μ m,將PDCX微球與丙酮溶液混懸,轉入層析柱,待PDCX微球沉降完全後,以1 2倍柱體積的丙酮 溶液平衡柱床,取以上製得的金絲桃素粗品以丙酮溶液溶解後溼法上樣於PDCX微球柱頂 部,上樣體積為1/4 1/3倍柱體積,再使用丙酮溶液進行梯度洗脫,收集最後一次洗脫的 洗脫液,濃縮至原體積1/6 1/4,以鹽酸調pH值至2 3,4°C靜置12 士0. 5h,離心分取沉 澱,上清液再置於4°C靜置12士0. 5h,離心得沉澱,合併沉澱製得金絲桃素精品。ODS層析步驟0DS即為反相矽膠填料,通常採用十八烷基矽烷鍵合矽膠聚合 物,將反相矽膠填料與色譜純甲醇混懸,轉入層析柱,待反相矽膠微球沉降完全後,以 87.5/12.5 (體積比)的甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液平衡柱床,該甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液預 先以磷酸將PH值調至6. 5,取以上製得的金絲桃素精品以甲醇溶液溶解後上樣,上樣體積 1/4 1/3柱體積,87. 5/12. 5的甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液洗脫,分步收集洗脫液,經HPLC (即高效液相色譜法)檢測後合併相同的成分,獲得金絲桃素提純物。上述PEK微球層析步驟中,洗脫所採用的試劑分別依次為1 2. 5倍柱體積的 水、1 3倍柱體積的10%乙醇、1. 5 6倍柱體積的30%乙醇、1. 5 4倍柱體積的40%乙 醇、4 8倍柱體積的60%乙醇。 而在PDCX微球層析步驟中,洗脫時採用的丙酮溶液分別為1 2倍柱體積的30% 丙酮、1 1. 5倍柱體積的50%丙酮、3 8倍柱體積的70%丙酮。以下通過幾個實施例來詳細說明本發明的具體實施過程。實施例1
步驟(1)稱取IOOg貫葉金絲桃浸膏粉碎,以60%的乙醇600mL溶解後超聲提取30min, 加入10%明膠溶液120mL,調乙醇濃度達80%,靜置10h,濃縮過濾得貫葉金絲桃浸膏除鞣液 350mLo步驟(2) :PEK微球層析將PEK微球與蒸餾水混懸,重力沉降法裝成規格為 01cmX IOcm層析柱,待PEK微球沉降完全後,以15mL蒸餾水平衡柱床,取(1)製得的貫葉金 絲桃除鞣液8mL,上樣,分別以水,10%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、60%乙醇以流速1. 5mL/min 依次洗脫16mL、24mL、48mL、20mL、56mL,收集60%乙醇洗脫液,濃縮得金絲桃素粗品,HPLC測
得金絲桃素含量為3. m。步驟(3):PDCX微球層析將PDCX微球與30%丙酮溶液混懸,重力沉降法裝成規格 01cmX IOcm層析柱,待PDCX微球沉降完全後,15mL30%丙酮溶液平衡柱床,取以上製得的金 絲桃素粗品30mg,2mL50%丙酮溶液溶解後溼法上樣於PDCX微球柱頂部,以30%丙酮溶液、 50%丙酮溶液、70%丙酮溶液以流速1. 5mL/min依次洗脫16mL、12mL、24mL,收集70%丙酮溶 液洗脫液,濃縮,鹽酸調PH2 3,4°C靜置12士0. 5h,離心分取沉澱,上清液再置於4°C靜置 12士0.證,離心分取沉澱,合併沉澱,低溫凍幹,製得金絲桃素精品。HPLC測得金絲桃素含量 為 33. 0%。步驟(4) =ODS層析0DS填料甲醇混懸,重力沉降法裝成規格01cmX IOcm層析柱, 待ODS微球沉降完全後,將(3)所得樣品以甲醇溶液溶解之後上樣,87. 5/12. 5 (體積比)的 甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液溶液洗脫,1. 5mL/min流速,分部收集洗脫液,HPLC檢測合併相同 部分,金絲桃素含量達91.6%。實施例2
步驟(1)稱取IOOg貫葉金絲桃浸膏粉碎,以60%的乙醇溶液SOOmL溶解後超聲提取30min,加入10%明膠溶液200mL,調乙醇濃度達80%,靜置10h,濃縮過濾得貫葉金絲桃浸膏 除鞣液450mL。步驟(2) :PEK微球層析將PEK微球與蒸餾水混懸,重力沉降法裝成規格為 01cmX IOcm層析柱,待PEK微球沉降完全後,15mL蒸餾水平衡柱床,取步驟(1)製得的貫葉 金絲桃除鞣液6mL,上樣,分別以水,10%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、60%乙醇以流速1. 5mL/ min依次洗脫12mL、20mL、40mL、16mL、42mL,收集60%乙醇洗脫液,濃縮得金絲桃素粗品, HPLC測得金絲桃素含量為3. 1%。步驟(3):PDCX微球層析將PDCX微球以30%丙酮溶液混懸,重力沉降法裝成規格 01cmX IOcm層析柱,待PDCX微球沉降完全後,15mL30%丙酮溶液平衡柱床,取以上製得的金 絲桃素粗品20mg,2mL50%丙酮溶液溶解後溼法上樣於PDCX微球柱頂部,以30%丙酮溶液、 50%丙酮溶液、70%丙酮溶液以流速1. 5mL/min依次洗脫12mL、8mL、18mL,收集70%丙酮溶 液洗脫液,濃縮,鹽酸調PH2 3,4°C靜置12士0. 5h,離心分取沉澱,上清液再置於4°C靜置 12士0.證,離心分取沉澱,合併沉澱,低溫凍幹,製得金絲桃素精品。HPLC測得金絲桃素含量 為 33. 0%。步驟(4) =ODS層析0DS填料甲醇混懸,重力沉降法裝成規格01cmX IOcm層析柱, 待ODS微球沉降完全後,將步驟(3)所得樣品以甲醇溶液溶解之後上樣,以87. 5/12. 5 (體 積比)的甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液洗脫,1.5mL/min流速,分部收集洗脫液,HPLC檢測合併 相同部分,金絲桃素含量達91. 6%。 實施例3
步驟(1)稱取IOOOg貫葉金絲桃浸膏粉碎,以60%的乙醇溶液6000mL溶解後超聲提 取30min,加入10%明膠溶液1200mL,調乙醇濃度達75%,靜置10h,過濾濃縮得貫葉金絲桃 浸膏除鞣液2500mL。步驟(2) :PEK微球層析將PEK微球與蒸餾水混懸,重力沉降法裝成規格為 05cmX18cm層析柱,待PEK微球沉降完全後,以700mL蒸餾水平衡柱床,取步驟(1)製得的 貫葉金絲桃浸膏除鞣液350mL,上樣,水,10%乙醇溶液、30%乙醇溶液、40%乙醇溶液、60%乙 醇溶液以流速10mL/min依次洗脫525mL、700mL、875mL、525mL、1400mL,取60%乙醇溶液洗 脫液,濃縮至無醇味後,濃鹽酸調PH2 3,4°C靜置12士0. 5h,離心分取沉澱,上清液再置於 4°C靜置12士0.證,離心分取沉澱,合併兩次沉澱,低溫凍幹,得金絲桃素粗品,HPLC測得金 絲桃素含量為3. 0%。步驟(3) =PDCX微球層析將PDCX微球與30%丙酮溶液混懸,重力沉降法裝成規 格05cmX 18cm層析柱,待PDCX微球沉降完全後,以700mL的30%丙酮平衡柱床,取步驟(2) 製得的金絲桃素粗品1. 2g,80mL50%丙酮溶解後上樣,30%丙酮、50%丙酮、70%丙酮以IOmL/ min流速依次洗脫350mL、350mL、2800mL,70%丙酮洗脫液濃縮至200mL,濃鹽酸調pH2 3, 4°C靜置12士0. 5h,離心分取沉澱,上清液再置於4°C靜置12士0. 5h,離心分取沉澱,合併沉 澱,低溫凍幹,製得金絲桃素精品,HPLC測得金絲桃素含量為32. 6%。步驟(4):0DS層析0DS填料色譜純甲醇混懸,重力沉降法裝成規格01cmX IOcm層 析柱,待ODS微球沉降完全後,將步驟(3)所得樣品以甲醇溶液溶解之後上樣,以87. 5/12. 5 (體積比)的甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液洗脫,1.5mL/min流速,分部收集洗脫液,HPLC檢測合併相同部分,HPLC檢測合併相同部分,金絲桃素含量達90. 3%。
權利要求
1.一種金絲桃素提純方法,其特徵在於,包括如下步驟準備步驟將貫葉金絲桃浸膏粉碎,並加入乙醇溶液溶解後進行超聲提取獲得提取液, 然後在提取液中加入明膠溶液除鞣,製得貫葉金絲桃浸膏除鞣液;PEK微球層析步驟將PEK微球與蒸餾水混懸,轉入層析柱,待PEK微球沉降完全後, 以蒸餾水平衡柱床,取適量貫葉金絲桃浸膏除鞣液溼法上樣於PEK微球層析柱頂部,再用 水-乙醇溶液體系進行梯度洗脫,並收集最後一次洗脫的洗脫液,濃縮製得金絲桃素粗品;PDCX微球層析步驟將PDCX微球與丙酮溶液混懸,轉入層析柱,待PDCX微球沉降完全 後,以丙酮溶液平衡柱床,取以上製得的金絲桃素粗品以丙酮溶液充分溶解後取適量溼法 上樣於PDCX微球柱頂部,再用丙酮溶液進行梯度洗脫,並收集最後一次洗脫的洗脫液,濃 縮並調整PH值至2 3,低溫下靜置12 士0.釙後離心分取沉澱,上清液再置於低溫下靜置 12士0. 5h,隨後再離心得沉澱,合併沉澱得金絲桃素精品;ODS層析步驟將反相矽膠填料與色譜純甲醇混懸,轉入層析柱,待反相矽膠微球沉降 完全後,以甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液平衡柱床,取以上製得的金絲桃素精品以甲醇充分溶 解後取適量上樣於層析柱頂部,以甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液洗脫,分步收集洗脫液,HPLC檢 測後合併相同的成分,獲得金絲桃素提純物。
2.如權利要求1所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於準備步驟中,用於與貫葉金絲 桃浸膏的粉碎物溶解的乙醇溶液為體積百分比濃度為60%的乙醇溶液,貫葉金絲桃浸膏與 乙醇溶液的配比比例為每1克貫葉金絲桃浸膏使用6 8mL60%的乙醇溶液,且溶解後超 聲提取的時間為30士2分鐘。
3.如權利要求1所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於準備步驟中,加入的明膠溶液 為10%明膠溶液,加入量為超聲提取液的1/5 1/4。
4.如權利要求1或3所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於在加入明膠溶液後再調 整溶液中乙醇的體積濃度至75% 80%,避光靜置12士0.證後,過濾濃縮後即製得貫葉金絲 桃浸膏除鞣液。
5.如權利要求1所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於PEK微球層析步驟中,PEK微 球的粒徑為35 45 μ m,層析柱徑高比1:10 3. 5。
6.如權利要求1或5所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於PEK微球層析步驟中,梯 度洗脫時所用的試劑依次分別為1 2. 5倍柱體積的水、1 3倍柱體積的10%乙醇溶液、 1. 5 6倍柱體積的30%乙醇溶液、1. 5 4倍柱體積的40%乙醇溶液、4 8倍柱體積的 60%乙醇溶液。
7.如權利要求1所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於PDCX微球層析步驟中,PDCX 微球的粒徑為25 35 μ m。
8.如權利要求1所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於PDCX微球層析步驟中,分別用 於與PDCX微球混懸、平衡柱床以及溶解金絲桃素粗品的丙酮溶液均為30%丙酮溶液。
9.如權利要求1所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於PDCX微球層析步驟中,梯度洗 脫所用的丙酮溶液依次分別為1 2倍柱體積的30%丙酮溶液、1 1. 5倍柱體積的50% 丙酮溶液、3 8倍柱體積的70%丙酮溶液。
10.如權利要求1所述的金絲桃素提純方法,其特徵在於PDCX微球層析步驟中,使用 鹽酸將濃縮液的PH值調至2 3 ;而在ODS層析步驟中所使用的甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液中甲醇與磷酸氫二鈉的體積比比值為87. 5/12. 5,且甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液預先以磷酸 將PH值調至6. 5。
全文摘要
一種金絲桃素提純方法,包括將貫葉金絲桃浸膏粉碎,與乙醇溶液溶解後超聲提取,加明膠溶液除鞣得貫葉金絲桃浸膏除鞣液;將PEK微球與蒸餾水混懸,轉入層析柱,取貫葉金絲桃浸膏除鞣液溼法上樣,用水-乙醇溶液體系梯度洗脫,濃縮洗脫液得金絲桃素粗品;將PDCX微球與丙酮溶液混懸,轉入層析柱,取金絲桃素粗品以丙酮溶液充分溶解後溼法上樣,用丙酮溶液梯度洗脫,處理洗脫液得金絲桃素精品;將反相矽膠填料與色譜純甲醇混懸,轉入層析柱,取金絲桃素精品以甲醇充分溶解後上樣,以甲醇-磷酸氫二鈉緩衝液洗脫,HPLC檢測洗脫液後合併相同成分,得金絲桃素提純物。本發明利用PEK微球、PDCX微球等納米微球材料分離純化金絲桃素,產品金絲桃素含量在90%以上。
文檔編號C07C50/36GK102079696SQ20111000813
公開日2011年6月1日 申請日期2011年1月15日 優先權日2011年1月15日
發明者張俊松, 王曉利, 王金林 申請人:深圳職業技術學院

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