利用單個發光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光分析用電腦程式的製作方法

2023-09-19 00:46:35

利用單個發光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光分析用電腦程式的製作方法
【專利摘要】提供了在使用利用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測量的掃描分子計數法中能夠將發光粒子的光的信號的檢測結果的偏差抑制得更小並能夠提高精度的、檢測樣本溶液中的發光粒子的光的光分析技術。本發明的光分析技術的特徵在於，通過變更顯微鏡的光學系統的光路來使光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內沿著規定路徑移動至少兩輪，在光檢測區域的位置沿著規定路徑移動多次的期間檢測來自光檢測區域的光來生成按時間序列的光強度數據，使用光檢測區域沿著規定路徑巡迴移動多次獲得的按時間序列的光強度數據來逐個檢測表示來自存在於規定路徑內的各個發光粒子的光的信號。
【專利說明】利用單個發光粒子檢測的光分析裝置、光分析方法以及光分析用電腦程式
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種光分析技術，能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統等能夠檢測來自溶液中的微小區域的光的光學系統，檢測來自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為「粒子」)、例如蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的對象物、或非生物學粒子的光，來獲取在分析或解析它們的狀態(相互作用、結合/離解狀態等)時有用的信息，更詳細地說，涉及一種能夠使用如上所述的光學系統逐個檢測來自單個發光粒子的光並進行各種光分析的光分析裝置、光分析方法以及光分析用電腦程式。此外，在本說明書中，發光的粒子(以下稱為「發光粒子」)可以是其自身發光的粒子、或附加了任意的發光標識或發光探針的粒子，從發光粒子發出的光可以是螢光、磷光、化學發光、生物發光、散射光等。
【背景技術】
[0002]由於近年來的光測量技術的發展，使用共焦顯微鏡的光學系統和還能夠進行光子計數(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術，能夠檢測/測量單光子或螢光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的測量技術對生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結合/離解反應進行檢測的裝置或方法。例如，在螢光相關光譜分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻 1-3、非專利文獻 1-3)中，利用雷射共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術，測量來自出入樣本溶液中的微小區域(被稱為顯微鏡的雷射會聚到的焦點區域-共焦區組織)內的螢光分子或被螢光標識的分子(螢光分子等)的螢光強度，根據由測量得到的該螢光強度的自相關函數的值所確定的在微小區域內的螢光分子等的平均滯留時間(平移擴散時間)和滯留分子的個數的平均值，獲取螢光分子等的運動的速度或大小、濃度之類的信息，或檢測分子的構造或大小的變化、分子的結合/離解反應或分散/聚合之類的各種現象。另外，在螢光強度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如專利文獻 4、非專利文獻4)、光子計數直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻5)中，生成與FCS同樣地測量出的出入共焦區組織內的螢光分子等的螢光強度的直方圖，使統計性的模型公式擬合該直方圖的分布，由此估算螢光分子等的固有的亮度的平均值和滯留在共焦區組織內的分子的個數的平均值，根據這些信息估計分子的構造或大小的變化、結合/離解狀態、分散/聚合狀態等。另外，除此以外，在專利文獻6、7中，提出了根據利用共焦顯微鏡的光學系統測量出的樣本溶液的螢光信號的時間經過來檢測螢光性物質的方法。專利文獻8提出了一種信號運算處理技術，其用於使用光子計數技術測量來自流通於流式細胞儀的螢光微粒子或固定在基板上的螢光微粒子的微弱光，來檢測流體中或基板上的螢光微粒子的存在。
[0003]特別是，根據FCS、FIDA等使用了利用共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術進行微小區域的螢光測量的技術的方法，進行測量所需要的樣本與以前相比可以是極低濃度且極微量(在一次測量中使用的量至多為幾十yL左右)，測量時間也大幅縮短(在一次測量中反覆多次進行秒級時間的測量。)。因而，期待這些技術特別是在對醫學、生物學的研究開發領域中經常使用的稀少或昂貴的樣本進行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質的篩選等檢測體數多的情況下，成為與以前的生物化學方法相比能夠廉價或迅速地執行實驗或檢查的強力工具。
[0004]專利文獻1:日本特開2005-098876
[0005]專利文獻2:日本特開2008-292371
[0006]專利文獻3:日本特開2009-281831
[0007]專利文獻4:日本專利第4023523號
[0008]專利文獻5:國際公開2008-080417
[0009]專利文獻6:日本特開2007-20565
[0010]專利文獻7:日本特開2008-116440
[0011]專利文獻8:日本特開平4-337446號公報
[0012]非專利文獻1:金城政孝，蛋白質核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438頁1999年
[0013]非專利文獻2:F.J.Meyer-Alms,突光相關譜(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 編,Springer,柏林,2000 年,204-224 頁
[0014]非專利文獻3:加藤則子及其他4名，遺傳醫學，Vol.6，N0.2，271-277頁
[0015]非專利文獻4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美國科學學院紀要，1999年，96卷，13756-13761 頁(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

【發明內容】

[0016]發明要解決的問題
[0017]在上述的FCS、FIDA等使用了共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術的光分析技術中，所測量的光是從螢光單分子或多分子發出的光，但在該光的分析中，執行時序地測量出的螢光強度數據的自相關函數的運算或對直方圖擬合之類的螢光強度的波動的計算等統計性的處理，並非逐個地參照或分析來自各個螢光分子等的光的信號。即，在這些光分析技術中，對來自多個螢光分子等的光的信號統計性地進行處理，針對螢光分子等檢測統計平均性的特性。因而，為了在這些光分析技術中得到統計上有意義的結果，需要樣本溶液中的作為觀測對象的螢光分子等的濃度或數密度在平衡狀態下為在一次的秒級長度的測量時間內能夠進行統計性的處理的個數的螢光分子等出入微小區域內的水平，優選的是在微小區域內始終存在一個左右的螢光分子等的水平。實際上，共焦區組織的體積為IfL左右，因此，在上述的光分析技術中使用的樣本溶液中的螢光分子等的濃度典型地是InM左右或其以上，在大幅低於InM時，產生在共焦區組織內不存在螢光分子等的時間而無法得到統計上有意義的分析結果。另一方面，在專利文獻6?8所記載的螢光分子等的檢測方法中，不包括螢光強度的波動的統計性的運算處理，即使樣本溶液中的螢光分子等小於InM也能夠檢測螢光分子等，但無法定量地計算在溶液中隨機運動的螢光分子等的濃度或數密度。
[0018]因此，本申請的 申請人:在日本特願2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基於新原理的光分析技術，能夠定量地觀測作為觀測對象的發光粒子的濃度或數密度低於利用FCS、FIDA等包含統計性處理的光分析技術進行處理的水平的樣本溶液中的發光粒子的狀態或特性。在所述新的光分析技術中，如果清楚地進行描述，則與FCS、FIDA等同樣地，在使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統等能夠檢測來自溶液中的微小區域的光的光學系統的情況下，一邊使作為光的檢測區域的微小區域(以下稱為「光檢測區域」。)的位置在樣本溶液內移動、即一邊通過光檢測區域對樣本溶液內進行掃描，一邊在光檢測區域包含在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子時檢測從該發光粒子發出的光，由此，能夠對樣本溶液中的發光粒子一個一個地逐個進行檢測，來獲取與發光粒子的計數、樣本溶液中的發光粒子的濃度或數密度有關的信息。根據該新的光分析技術(以下稱為「掃描分子計數法」。)，與FCS、FIDA等光分析技術同樣地，進行測量所需要的樣本可以是微量的(例如幾十μ L左右)，另外，測量時間短，並且與FCS、FIDA等光分析技術的情況相比，能夠檢測更低的濃度或數密度的發光粒子的存在，並定量地檢測其濃度、數密度或其它特性。
[0019]在上述掃描分子計數法中，將隨著光檢測區域的位置在樣本溶液內移動而逐次測量出的光強度值(或者光子計數值)記錄為按時間序列的光強度數據，在該數據上檢測表示從發光粒子發出的光的光強度值的增大(表示發光粒子的光的信號)。此時，如果使用該光強度值分析所述光的波長特性、偏振特性等各種特性，則能夠進行各個發光粒子的特性的檢測、種類的確定。例如通過將檢測光分割為多個波長頻帶並參照按每個波長頻帶檢測出的光強度值之比，能夠檢測發光粒子所釋放出的光的波長特性(參照日本特願2010-202995、日本特願2010-262267)。另外，通過將檢測光分割為偏振成分並參照按每個偏振成分檢測出的光強度值之比，能夠進行發光粒子所釋放出的光的偏振特性的檢測和發光粒子的運動特性的檢測(參照日本特願2010-234769)。
[0020]然而，在上述掃描分子計數法中測量出的光是螢光單分子或多分子水平的微弱光，並且一個發光粒子的光的測量時間是該發光粒子通過光檢測區域內的期間的短的時間。因而，存在如下情況:從檢測光獲得的光強度值低、或者光量或光子數少，因此在與發光粒子所釋放出的光的波長特性等有關的信息方面偏差變大而只能得到低精度的檢測結果。
[0021]因此，本發明的主要目的在於提供如下一種新的光分析技術:使根據通過上述掃描分子計數法測量出的光所獲得的、發光粒子所釋放出的光的波長特性等的檢測結果中的偏差變小，實現檢測結果的精度提高。
[0022]用於解決問題的方案
[0023]在本發明中，如果清楚地進行描述，則在如上所述的掃描分子計數法中，光檢測區域沿規定的路徑多次通過，在該期間重複測量同一發光粒子所釋放出的光，由此能夠抑制使用測量出的光強度的數據檢測各個發光粒子的存在和/或其特性的結果的偏差，提高檢測精度。
[0024]這樣，根據本發明的一個方式，通過光分析裝置達成上述課題，該光分析裝置使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析裝置的特徵在於，包括:光檢測區域移動部，其通過變更顯微鏡的光學系統的光路來使光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內沿著規定路徑移動；光檢測部，其檢測來自光檢測區域的光；以及信號處理部，其生成一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊由光檢測部檢測出的來自光檢測區域的光的按時間序列的光強度數據，在按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號，其中，光檢測區域移動部使光檢測區域的位置沿著規定路徑移動至少兩輪，信號處理部使用在光檢測區域的位置沿著規定路徑移動至少兩輪的期間獲得的按時間序列的光強度數據，來逐個檢測表示來自存在於規定路徑內的各個發光粒子的光的信號。
[0025]在所述結構中，「在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子」是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發出光的粒子，如果是不固定在基板等上而在溶液中自由地進行布朗運動的粒子，則可以是任意的粒子。所述發光粒子典型地是螢光性粒子，但也可以是通過磷光、化學發光、生物發光、光散射等來發出光的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統的「光檢測區域」是指這些顯微鏡中檢測光的微小區域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當於該照明光會聚到的區域(在共焦顯微鏡中，特別地根據物鏡和針孔之間的位置關係來確定。在發光粒子沒有照明光而發光的情況下，例如是通過化學發光或生物發光來發光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光。)。此外，在本說明書中，在稱為發光粒子的「信號」的情況下，只要沒有特別限定，是指表示來自發光粒子的光的信號。
[0026]如從上述理解的那樣，在作為本發明的基本結構的掃描分子計數法中，首先，一邊通過變更顯微鏡的光學系統的光路來使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動、即一邊通過光檢測區域對樣本溶液內進行掃描，一邊逐次進行光的檢測。這樣，可以期待在樣本溶液內移動的光檢測區域包含了隨機運動的發光粒子時檢測到來自發光粒子的光，由此檢測一個發光粒子的存在。因而，在逐次檢測出的光中逐個檢測來自發光粒子的光的信號，由此一個一個地逐個且逐次檢測粒子的存在，能夠獲取與粒子在溶液內的狀態有關的各種信息。此時，如已經記述的那樣，發光粒子的光是微弱的，只能夠在發光粒子進入到移動的光檢測區域起至離開為止的短的期間內檢測發光粒子的光，因此如果光檢測區域僅通過發光粒子的存在區域一次，則檢測出的光量或光子數比較少，因而從該光量或光子數獲得的信息有可能偏差大而精度低。因此，在本發明中，如上述那樣，光檢測區域移動部使光檢測區域的位置沿著規定路徑移動至少兩輪，通過使光檢測區域沿著規定路徑巡迴，來多次檢測來自存在於規定路徑內的各發光粒子的光，從各發光粒子獲取更多的光量或光子，由此能夠檢測發光粒子的存在(信號的檢測為發光粒子的存在的檢測。)以及縮小從該信號獲得的信息的偏差和提高精度。
[0027]可以通過任意的方式進行上述的通過變更顯微鏡的光學系統的光路進行的光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動。例如可以使用在雷射掃描型光學顯微鏡中所採用的檢電鏡(Galvano-miiror)等變更顯微鏡的光學系統的光路來變更光檢測區域的位置。上述的規定路徑可以是任意形狀的循環路徑(封閉的路徑)，例如可以從圓形、橢圓形、矩形中選擇即可。根據通過變更顯微鏡的光學系統的光路來變更光檢測區域的位置的方式，光檢測區域的移動迅速，並且在樣本溶液中實質上不發生機械振動、流體力學作用，因此作為檢測對象的發光粒子不會受到力學作用的影響而能夠在穩定的狀態下進行光的測量，在這點上是有利的。
[0028]另外，在上述本發明的裝置的結構中，如果在光檢測區域沿著規定路徑巡迴的期間隨機運動的發光粒子由於擴散運動而離開了規定路徑，則無法多次檢測來自發光粒子的光。因而，在本發明的裝置中，優選使光檢測區域的位置以比發光粒子由於擴散而離開規定路徑的擴散時間短的周期移動。關於該點，應該理解所述光檢測區域的位置的移動周期不僅依賴於光檢測區域的移動速度，還依賴於規定路徑的路徑長度。因而，可以適當地調整規定路徑的長度和光檢測區域的移動速度來使光檢測區域能夠以比要觀測的發光粒子離開規定路徑的擴散時間短的周期在規定路徑上循環。並且，優選的是，將光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動速度設定得比作為檢測對象的發光粒子的擴散移動速度(由布朗運動所引起的粒子的平均移動速度)高。這是因為如果光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動速度低於發光粒子的擴散移動速度，則存在發光粒子在被包含在光檢測區域的期間也由於布朗運動而位置隨機移動的情況，如果這樣，則發光粒子的光的強度隨機變化，導致光的檢測精度下降(檢測出的發光粒子的光的強度根據光檢測區域中的發光粒子的位置而變化。)。此外，在作為測量對象的發光粒子的擴散速度快，如果保持這種狀態則無法對各粒子進行兩次以上的觀察時，可以提高樣本溶液的粘性來降低粒子的平移擴散速度。能夠通過添加增稠劑、膠凝劑(高分子化合物、多糖類、矽酮類、甘油、PEG、葡聚糖、蔗糖、藻朊酸鈉、多晶矽、水溶性纖維素等)來調整樣本溶液的粘性。
[0029]並且，在上述本發明的裝置的結構中，優選的是，在光檢測區域的位置沿著規定路徑的規定輪數的巡迴移動結束的情況下，通過移動顯微鏡的臺等來移動樣本溶液，在樣本溶液內的其它場所，以上述方式執行從光檢測到生成時序光強度數據為止的處理，從而能夠檢測更多數量的發光粒子的信號。如已經提及的那樣，如果為了使光檢測區域的巡迴移動的周期比發光粒子由於擴散而離開規定路徑的擴散時間短而使規定路徑長度變短，則在一個位置處存在於規定路徑內的發光粒子的個數減少。而且，被檢測的發光粒子的個數越少，導致從發光粒子的信號獲得的信息的精度也越低。因此，在本發明的一個方式中，在樣本溶液的多個不同的位置進行如上所述的光檢測，使發光粒子的檢測數增多，由此能夠改善從發光粒子的信號獲得的信息的精度。這樣，本發明的裝置還可以在每次光檢測區域的位置沿著規定路徑的規定輪數的移動結束時，移動樣本溶液的位置，在移動後的樣本溶液的位置處重複進行通過由光檢測區域移動部變更光學系統的光路來進行的光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內沿著規定路徑的至少兩輪的移動、由光檢測部進行的來自光檢測區域的光的檢測以及由信號處理部進行的按時間序列的光強度數據的生成，針對樣本溶液移動後的每個位置執行按時間序列的光強度數據中的表示來自存在於規定路徑內的各個發光粒子的光的信號的逐個檢測。換言之，根據該方式，通過組合通過變更光學系統的光路進行的光檢測區域的巡迴運動和樣本溶液的間歇性移動，來執行更高精度的發光粒子的存在的檢測以及從其信號得到的信息的獲取。此外，關於樣本溶液的移動，優選的是，可以如已經提及的那樣，通過移動顯微鏡的臺等來移動每個樣本溶液的容器。在這種情況下，由於在溶液內不產生流動，因此認為降低了樣本溶液對發光粒子的影響。
[0030]在上述本發明的裝置中，可以通過大致兩個方式中的任一個方式來進行基於所生成的時序光強度數據的發光粒子的信號的檢測以及信號的特性的抽出。
[0031]在第一方式中，認為在光檢測區域沿規定路徑巡迴的期間測量出的光的強度數據(時序光強度數據)是將多次執行一個規定路徑中的光強度的測量得到的數據連接所得到的數據，在時序光強度數據中，按規定路徑上的每個位置，參照與各位置對應的多個光強度值來確定這些光強度值的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最頻值，生成由光強度值的代表值構成的時序光強度代表值數據。在此，通常設定成光檢測區域的移動速度是固定的，或者在光檢測區域的各巡迴中通過規定路徑上的同一位置時的移動速度相互相等，因此規定路徑上的位置對應於時序光強度數據中的各巡迴的距開始時刻的時間。因而，具體地說，可以按時序光強度數據中的各巡迴的距開始時刻的時間來確定光強度值的代表值，生成按時間序列將所述光強度值的代表值排列而成的時序光強度代表值數據。然後，在時序光強度代表值數據中，逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號並檢測該信號的特徵量(即，信號的特性)。
[0032]在發光粒子的信號的檢測以及信號的特性的抽出的第二方式中，在時序光強度數據中，首先逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號，分別檢測該信號的特徵量。在所檢測出的這些發光粒子的信號群中，存在於規定路徑內的發光粒子的信號被包含巡迴數次，因此按每個發光粒子參照所檢測出的信號來計算信號的特徵量的代表值。即，作為第二方式，信號處理部在按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號並檢測該信號的特徵量，按每個發光粒子計算信號的特徵量的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最頻值。
[0033]作為上述信號的特徵量，典型地可以是光強度或光子數，在作為檢測光被檢測出多個成分的情況下，信號的特徵量可以是基於多個成分的光強度或光子數之比得到的偏振度、旋轉擴散常數、發光頻譜等任意的表示發光粒子的特性的指標值。
[0034]在上述本發明的裝置的信號處理部的處理中，可以根據時序光強度數據中的信號的形狀，基於逐次來自光檢測部的檢測值的信號判斷是否一個發光粒子進入了光檢測區域。在實施方式中，典型地是，可以在檢測出具有大於規定閾值的強度的信號時，檢測為一個發光粒子進入了光檢測區域。更具體地說，如後面的實施方式一欄所說明的那樣，表示來自發光粒子的光的信號通常在光檢測部的按時間序列的檢測值、即光強度數據中表現為具有某程度以上的強度的吊鐘型的脈衝狀的信號，噪聲表現為不是吊鐘型的脈衝狀、或者強度小的信號。因此，本發明的裝置的信號處理部可以構成為將時序光強度數據(或時序光強度代表值數據)上具有超過規定閾值的強度的脈衝狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。「規定閾值」能夠通過實驗設定為適當的值。
[0035]並且，本發明的裝置的檢測對象是來自單個發光粒子的光，因此光強度非常微弱，在一個發光粒子是螢光單分子或多分子等的情況下，發光粒子所發出的光是概率性地釋放的，在微小的時間內可能產生信號值的缺失。而且，當產生這樣的缺失時，難以確定與一個發光粒子的存在對應的信號。因此，信號處理部可以構成為使時序光強度數據平滑化，在對數據進行加工以能夠忽略微小時間內的信號值的缺失之後，將在平滑化後的時序光強度數據中具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。
[0036]在上述本發明的一個實施方式中，可以對信號的個數進行計數來對包含在光檢測區域中的發光粒子的個數進行計數(粒子的計數)。在這種情況下，通過將所檢測出的發光粒子的個數和光檢測區域的位置的移動量組合，能夠獲得與樣本溶液中的被同定的發光粒子的數密度或濃度有關的信息。具體地說，例如可以計算多個樣本溶液的數密度或濃度之比，或者計算相對於作為濃度或數密度的基準的標準樣本溶液的相對的數密度或濃度之t匕，或者使用相對於作為濃度或數密度的基準的標準樣本溶液的相對的數密度或濃度之比來確定絕對的數密度值或濃度值。或者，如果通過任意的方法、例如以規定的速度移動光檢測區域的位置等能夠確定出光檢測區域的位置的移動軌跡的總體積，則能夠具體估算發光粒子的數密度或濃度。[0037]通過通用的計算機也能夠實現在上述本發明的裝置中一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊進行光檢測來逐個檢測來自各個發光粒子的信號、且使光檢測區域沿規定路徑巡迴移動來多次檢測來自規定路徑內的發光粒子的光而由此實現了發光粒子的存在的檢測和從其信號獲得的信息的偏差的縮小以及精度提高的光分析技術的處理。因而，根據本發明的另一個方式，提供一種光分析用電腦程式，用於使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析用電腦程式的特徵在於，使計算機執行以下步驟:光檢測區域巡迴移動步驟，通過變更顯微鏡的光學系統的光路來使光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內沿著規定路徑移動至少兩輪；時序光強度數據生成步驟，在光檢測區域的位置沿著規定路徑移動至少兩輪的期間，檢測來自光檢測區域的光來生成按時間序列的光強度數據；以及發光粒子信號檢測步驟，使用按時間序列的光強度數據逐個檢測表示來自存在於規定路徑內的各個發光粒子的光的信號。此外，電腦程式通過存儲在計算機可讀取的存儲介質中來提供。計算機通過讀出存儲在存儲介質中的程序來執行信息的加工、運算處理，由此實現上述步驟。在此，計算機可讀取的記錄介質可以是磁碟、磁光碟、CD-R0M、DVD_R0M、半導體存儲器等。並且，上述的程序也可以通過通信線路傳輸到計算機，使接受該傳輸的計算機來執行程序。
[0038]在所述的電腦程式中，優選的是，使光檢測區域的位置以比發光粒子通過擴散而離開規定路徑的擴散時間短的周期沿著規定路徑移動。在這種情況下，通過變更光學系統的光路所進行的光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動例如可以使用在雷射掃描型光學顯微鏡中採用的檢電鏡等變更顯微鏡的光學系統的光路來變更光檢測區域的位置，規定路徑例如可以從圓形、橢圓形、矩形等任意形狀的循環路徑中選擇即可。另外，優選的是，將光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動速度設定得比作為檢測對象的發光粒子的擴散移動速度高以防止發光粒子的光的強度的隨機變化。並且，在上述電腦程式中也同樣，優選包括以下步驟:在每次光檢測區域的位置沿著規定路徑的規定輪數的移動結束時，移動顯微鏡的臺等來移動樣本溶液的位置，其中，在移動後的樣本溶液的位置處重複進行光檢測區域巡迴移動步驟和時序光強度數據生成步驟，針對樣本溶液移動後的每個位置執行發光粒子信號檢測步驟，從而能夠檢測更多數量的關於發光粒子的信號。
[0039]在上述電腦程式中的信號處理中，與本發明的裝置的情況同樣地，可以執行以下步驟:生成由按時間序列的光強度數據中按規定路徑上的每個位置確定的光強度值的代表值構成的時序光強度代表值數據，其中，在發光粒子信號檢測步驟中，在該時序光強度代表值數據中逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號並檢測信號的特徵量(第一方式)，或者在發光粒子信號檢測步驟中，在按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號並檢測該信號的特徵量，按每個發光粒子計算信號的特徵量的代表值(第二方式)。作為信號的特徵量，可以是從由光強度、光子數、偏振度、旋轉擴散常數以及發光頻譜構成的群中選擇的至少一個。
[0040]另外，在上述電腦程式中也同樣地，可以根據按時間序列的信號的形狀來逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號。在實施方式中，典型地是，可以在檢測出具有大於規定閾值的強度的信號時，檢測為一個發光粒子進入了光檢測區域。具體地說，可以將光強度數據上具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號，優選的是，可以使時序光強度數據平滑化，將平滑化後的時序光強度數據中具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。
[0041]並且，在上述電腦程式中也同樣，可以包括以下步驟:對逐個檢測出的來自發光粒子的信號的個數進行計數來對在光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的發光粒子的個數進行計數；和/或根據檢測出的發光粒子的個數來確定樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
[0042]根據上述本發明的裝置或電腦程式，實現如下一種新的光分析方法:一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動，一邊進行各個發光粒子的光的檢測，該方法使光檢測區域沿著規定路徑巡迴移動來多次檢測來自規定路徑內的發光粒子的光，由此實現了發光粒子的存在的檢測和從其信號獲得的信息的偏差的縮小以及精度提高。這樣，根據本發明，還提供一種光分析方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析方法的特徵在於，包括以下過程:光檢測區域巡迴移動過程，通過變更顯微鏡的光學系統的光路來使光學系統的光檢測區域的位置在樣本溶液內沿著規定路徑移動至少兩輪；時序光強度數據生成過程，在光檢測區域的位置沿著規定路徑移動至少兩輪的期間，檢測來自光檢測區域的光來生成按時間序列的光強度數據；以及發光粒子信號檢測過程，使用按時間序列的光強度數據來逐個檢測表示來自存在於規定路徑內的各個發光粒子的光的信號。
[0043]在所述方法中也同樣地，規定路徑可以從例如圓形、橢圓形、矩形等任意形狀的循環路徑中選擇即可，典型地是，例如通過使用在雷射掃描型光學顯微鏡中採用的檢電鏡等，使光檢測區域的位置以比發光粒子通過擴散而離開規定路徑的擴散時間短的周期沿著規定路徑移動，特別地，優選的是，將光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動速度設定得比作為檢測對象的發光粒子的擴散移動速度高。另外，可以包括以下過程:在每次光檢測區域的位置沿著規定路徑的規定輪數的移動結束時，移動樣本溶液的位置，其中，在移動後的樣本溶液的位置處重複進行光檢測區域巡迴移動過程和時序光強度數據生成過程，針對樣本溶液移動後的每個位置執行發光粒子信號檢測過程，由此能夠檢測出更多數量的關於發光粒子的信號。
[0044]並且，關於信號處理，也與本發明的裝置的情況同樣地，可以生成由按時間序列的光強度數據中按規定路徑上的每個位置確定的光強度值的代表值構成的時序光強度代表值數據，其中，在發光粒子信號檢測過程中，在該時序光強度代表值數據中逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號並檢測信號的特徵量(第一方式)，或者在發光粒子信號檢測過程中，在按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號並檢測該信號的特徵量，按每個發光粒子計算信號的特徵量的代表值(第二方式)。而且，信號的特徵量可以是從由光強度、光子數、偏振度、旋轉擴散常數以及發光頻譜構成的群中選擇的至少一個。
[0045]並且，在上述方法中也同樣，可以根據按時間序列的信號的形狀來逐個檢測表示來自各個發光粒子的光的信號。在實施方式中，典型地是，可以在檢測出具有大於規定閾值的強度的信號時，檢測為一個發光粒子進入了光檢測區域。具體地說，可以將光強度數據上具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號，優選的是，可以使時序光強度數據平滑化，將平滑化後的時序光強度數據中具有超過規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個發光粒子的光的信號。[0046]並且，在上述方法中也同樣，可以包括以下過程:對逐個檢測出的來自發光粒子的信號的個數進行計數來對在光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的發光粒子的個數進行計數；和/或根據所檢測出的發光粒子的個數來確定樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
[0047]上述本發明的光分析技術典型地用於分析或解析蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的生物學對象物在溶液中的狀態的用途，但是也可以用於分析或解析非生物學粒子(例如原子、分子、絡合物、膠束(micelles)、金屬膠體、塑膠珠等)在溶液中的狀態，應該理解為這種情況也屬於本發明的範圍。
[0048]發明的效果
[0049]在作為本發明的對象的掃描分子計數法中，基本上通過在樣本溶液中移動的光檢測區域包含發光粒子時捕捉來自發光粒子的光，來進行發光粒子的存在和/或其特性的檢測。因而，由於難以追蹤一個發光粒子而持續檢測其光，且一個發光粒子的觀測時間短，因此具有來自發光粒子的光量或光子數少、從其獲得的信息的偏差大的傾向。然而，根據本發明，通過沿同一規定路徑巡迴，由此能夠多次測量來自一個發光粒子的光，因此能夠期待來自發光粒子的光量或光子數的檢測精度的提高和從其獲得的信息的偏差的降低。另外，如後述的實施例所示的那樣，根據本發明的一個方式，能夠相對地降低背景噪聲相對於發光粒子的信號的大小，改善S/N比。
[0050]通過本發明的以下優選實施方式的說明可清楚本發明的其它目的和優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1的(A)是執行本發明的掃描分子計數法的光分析裝置的內部結構的示意圖。圖1的(B)是共焦區組織(共焦顯微鏡的觀察區域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的機構的示意圖。圖1的(D)是移動微板的水平方向位置來移動樣本溶液的位置的機構的示意圖。
[0052]圖2的(A)、(B)分別是說明應用本發明的掃描分子計數法中的光檢測原理的示意圖以及所測量的光強度的時間變化的示意圖。圖2的(C)是說明本發明中的使光檢測區域的位置沿著一個掃描軌道(規定路徑)移動的方式的圖。圖2的(D)是說明樣本溶液的位置的移動方式的圖。
[0053]圖3是說明本發明中的時序光強度數據的信號處理方式的圖。(A)是如(B)那樣使光檢測區域在一個掃描軌道(規定路徑)上巡迴移動時的時序光強度數據的示意圖。(C)說明了在(A)的時序光強度數據中按距光檢測區域通過巡迴的起點sO的時刻(t0、t3、t6)的時間參照在各巡迴中獲得的時序光強度數據來如(D)那樣確定所參照的所有巡迴的數據中的代表值的方式。(E)說明了在(A)的時序光強度數據整體中首先檢測發光粒子信號、然後針對每個發光粒子(α、β)確定信號的代表值的方式。
[0054]圖4是以流程圖的形式表示依照本發明執行的掃描分子計數法的處理過程的圖。
(A)是在生成時序光強度代表值數據後進行信號的檢測時的處理過程，(B)是在進行信號的檢測後進行每個發光粒子的信號的代表值的計算時的處理過程。(C)是在時序光強度數據或時序光強度代表值數據中進行發光粒子信號的檢測的處理過程。[0055]圖5的(A)、(B)分別是表示發光粒子一邊進行布朗運動一邊橫穿光檢測區域時以及通過以比發光粒子的擴散移動速度快的速度使樣本溶液內的光檢測區域的位置移動而發光粒子橫穿光檢測區域時的粒子的運動方式的模型圖。圖5的(C)是說明用於依照掃描分子計數法根據所測量的時序光強度數據(光子計數的時間變化)檢測發光粒子的存在的處理過程中的檢測信號的信號處理過程的例子的圖。
[0056]圖6示出了所測量的光子計數數據的實測例子(直方圖表)、對數據進行平滑處理而得到的曲線(虛線)以及在脈衝存在區域擬合的高斯函數(實線)。在圖中，附加為「噪聲」的信號作為由噪聲或異物造成的信號而被忽略。
[0057]圖7示出了使用被螢光標識的質粒作為發光粒子、通過依照本發明執行的掃描分子計數法獲得的發光粒子信號的峰值強度的平均值(直方圖表)和CV值(誤差條)相對於光檢測區域在掃描軌道上的巡迴次數的變化。
[0058]圖8示出了在依照本發明執行的掃描分子計數法中時序光強度數據上的噪聲的量相對於光檢測區域在掃描軌道上的巡迴次數的變化。 [0059]圖9示出了通過依照本發明執行的掃描分子計數法獲得的發光粒子的偏振度的平均值(直方圖表)和標準偏差(誤差條)相對於光檢測區域在掃描軌道上的巡迴次數的變化。
[0060]圖10示出了使用各種發光粒子濃度的樣本溶液、通過掃描分子計數法獲得的發光粒子的信號的個數。?是在作為巡迴三次的時序光強度數據的平均值的時序光強度代表值數據上檢測出的粒子數，Λ是在巡迴一次的時序光強度數據上檢測出的粒子數。
[0061]圖11是在以往的計算螢光強度的波動的光分析技術中獲得的光子計數(光強度)的時間變化的例子，(A)是樣本內的粒子的濃度為能夠提供足夠的測量精度的程度的情況，
(B)是樣本內的粒子的濃度相比於(A)的情況大幅降低的情況。
[0062]附圖標記說明
[0063]1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖(single-mode opticalfiber) ； ；4:準直透鏡；5:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光鏡(condenser lens) ；13:針孔；14:屏蔽濾波器；14a:分色鏡或偏振分束器；15:多模光纖(mult1-mode optical fiber) ；16:光檢測器；17:反射鏡偏轉器；17a:臺位置變更裝置；18:計算機。
【具體實施方式】
[0064]下面，詳細說明本發明的優選實施方式。
_5] 光分析裝置的結構
[0066]實現本發明的光分析技術的光分析裝置可以是如下的裝置:在基本結構中，如圖1的(A)示意性地例示那樣，組合能夠執行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學系統和光檢測器而成。參照該圖，光分析裝置I由光學系統2~17以及用於控制光學系統的各部分的動作並且獲取並解析數據的計算機18構成。光分析裝置I的光學系統可以與普通的共焦顯微鏡的光學系統相同，在此，使從光源2發射並在單模光纖3內傳播的雷射(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA確定的角度發散的光而發射，通過準直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。典型地是在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 I μ L?幾十μ L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的雷射在樣本容器或皿10內的樣本溶液中聚焦，形成光強度強的區域(激勵區域)。在樣本溶液中分散或溶解有作為觀測對象物的發光粒子、典型地是螢光性粒子或附加有螢光色素等發光標識的粒子，當所述發光粒子進入激勵區域時，在其間發光粒子被激勵而釋放出光。所釋放的光(Em)通過物鏡8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過針孔13，透過屏蔽濾波器14 (在此，只選擇特定波長頻帶的光成分。)，被導入到多模光纖15，到達光檢測器16，在被變換為按時間序列的電信號之後輸入到計算機18，以後面說明的方式進行用於光分析的處理。此外，如本領域技術人員所了解的那樣，在上述結構中，針孔13配置在與物鏡8的焦點位置共軛的位置，由此僅從如圖1的(B)示意性地表示的雷射的焦點區域、即激勵區域內發出的光通過針孔13，來自激勵區域以外的光被遮斷。圖1的⑶所例示的雷射的焦點區域通常是具有IfL?IOfL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測區域(典型地是光強度以區域中心為頂點的高斯型分布。有效體積是以光強度Ι/e2的面為邊界的大致橢圓球體的體積。)，被稱為共焦區組織。另外，在本發明中，檢測來自一個發光粒子的光、例如來自一個螢光色素分子的微弱光，因此作為光檢測器16，優選的是使用能夠在光子計數中使用的超高靈敏度的光檢測器。在光的檢測是通過光子計數進行的情況下，以在規定時間內按每個規定的單位時間(BIN TIME)逐次測量來到光檢測器的光子的個數的方式執行光強度的測量。因而，在這種情況下，按時間序列的光強度數據是按時間序列的光子計數數據。另外，可以在顯微鏡的臺(未圖示)設置用於移動微板9的水平方向位置以變更要觀察的皿10的臺位置變更裝置17a。可以由計算機18控制臺位置變更裝置17a的動作。根據所述結構，在存在多個檢體的情況下也能夠達成迅速的測量。
[0067]並且，在上述的光分析裝置的光學系統中，設置有用於通過光檢測區域掃描樣本溶液內的、即用於使焦點區域即光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的機構。作為所述的用於使光檢測區域的位置移動的機構，例如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以採用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉器17 (變更光路來使光檢測區域的絕對位置移動的方式)。所述反射鏡偏轉器17可以與在通常的雷射掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同。另外，還如圖1的(D)所例示的那樣，使臺位置變更裝置17a進行動作以移動注入了樣本溶液的容器10(微板9)的水平方向的位置來使光檢測區域在樣本溶液內的相對位置移動(使樣本溶液的位置移動的方式)。如後面詳細說明的那樣，在本發明中，通過變更上述光路來使光檢測區域的絕對位置移動的方式，使光檢測區域沿著掃描軌道(規定路徑)巡迴移動，並且當所述巡迴次數達到規定的次數時，通過移動樣本溶液的位置的方式，來變更使樣本溶液中的光檢測區域進行巡迴移動的場所。無論在哪種方式的情況下，都在計算機18的控制下，與光檢測器16的光檢測協調地驅動反射鏡偏轉器17或臺位置變更裝置17a以達成所期望的光檢測區域的位置的移動圖案。可以從圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測區域的位置的移動軌跡(可以設為在計算機18中的程序中能夠選擇各種移動圖案。)。此外，雖然沒有圖示，但也可以通過使物鏡8或臺上下移動來使光檢測區域的位置在上下方向上移動。
[0068]在作為觀測對象物的發光粒子通過多光子吸收而發光的情況下，上述光學系統被用作多光子顯微鏡。在這種情況下，只在激勵光的焦點區域(光檢測區域)釋放光，因此可以去除針孔13。另外，在作為觀測對象物的發光粒子不通過激勵光而通過化學發光、生物發光現象發光的情況下，可以省略用於生成激勵光的光學系統2?5。在發光粒子通過磷光或散射而發光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學系統。並且，可以在光分析裝置I中如圖示那樣設置多個激勵光源2，可以設為能夠根據發光粒子的激勵波長而適當地選擇激勵光的波長。同樣地，可以在檢測光光路上插入分色鏡14a,將檢測光分割為多個波長頻帶，由多個光檢測器16分別進行檢測。根據所述結構，還能夠在檢測與發光粒子的發光波長特性(發光頻譜)有關的信息、包含有多種發光粒子的情況下，根據來自它們的光的波長分別檢測該光。並且，關於光的檢測，也可以使用向規定的方向偏振的光作為激勵光，分別檢測檢測光的與激勵光的偏振方向垂直的方向的成分，從而能夠檢測發光粒子的光的偏振特性。在這種情況下，在激勵光光路中插入偏振片(未圖示)，在檢測光光路中插入偏振分束器14a。(參照實施例3)。
[0069]計算機18具備CPU和存儲器，通過CPU執行各種運算處理來執行本發明的過程。此外，各過程也可以通過硬體構成。本實施方式所說明的處理的全部或一部分可以由計算機18使用存儲有實現這些處理的程序的計算機可讀取的存儲介質來執行。即，計算機18可以通過讀出存儲在存儲介質中的程序來執行信息的加工、運算處理，來實現本發明的處理過程。在此，計算機可讀取的記錄介質可以是磁碟、磁光碟、⑶-R0M、DVD-R0M、半導體存儲器等，或者也可以將上述程序通過通信線路傳輸到計算機，由接受該傳輸的計算機來執行程序。
[0070]本發明的光分析技術的原理
[0071]如「
【發明內容】
」 一欄所記載的那樣，如果清楚地進行描述，則在本發明的光分析技術中，在掃描分子計數法中，使光檢測區域沿著規定的路徑進行多次巡迴移動，在其期間重複測量同一發光粒子所釋放出的光，由此能夠抑制使用所測量出的光強度數據檢測各個發光粒子的存在和/或其特性時的偏差，提高檢測精度。下面，說明本發明的掃描分子計數法的原理、光檢測區域的巡迴移動方式以及所測量出的光強度數據的信號處理的概要。
[0072]1.掃描分子計數法的原理
[0073]FCS、FIDA等光譜分析技術與現有的生物化學的分析技術相比，其優點在於所需要的樣本量極少且能夠迅速地執行檢查。然而，在FCS、FIDA等光譜分析技術中，在原理上，根據螢光強度的波動來估算發光粒子的濃度、特性，因此為了得到高精度的測量結果，要求如圖11的(A)示意性地描繪的那樣，樣本溶液中的發光粒子的濃度或數密度為在螢光強度的測量過程中在光檢測區域CV內始終存在一個左右的發光粒子的水平，如該圖的右側所示那樣在測量時間中始終檢測到有意義的光強度(光子計數)。如果發光粒子的濃度或數密度低於此水平，例如圖11的(B)所描繪的那樣，在發光粒子為只是偶爾進入到光檢測區域CV內的水平的情況下，如該圖的右側所例示的那樣，只在測量時間的一部分出現有意義的光強度的信號(光子計數)，難以估算高精度的光強度的波動。另外，與在測量中在光檢測區域內始終存在一個左右的發光粒子的水平相比發光粒子的濃度大幅降低的情況下，在光強度的波動的運算中，容易受到背景的影響，為了得到足夠進行運算的量的有意義的光強度數據而測量時間變長。
[0074]因此，本申請的 申請人:在日本特願2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基於新原理的「掃描分子計數法」，即使發光粒子的濃度低於如上所述的在FCS、FIDA等光譜分析技術中要求的水平的情況下，也能夠檢測發光粒子的數密度或濃度等特性。[0075]作為在掃描分子計數法中執行的處理，如果清楚地描述，則驅動用於使光檢測區域的位置移動的機構(反射鏡偏轉器17)來變更光路，如圖2的(A)示意性地描繪的那樣，一邊使光檢測區域CV的位置在樣本溶液內移動、即一邊通過光檢測區域CV掃描樣本溶液內，一邊執行光檢測。這樣，例如在光檢測區域CV移動的期間(圖中為時間t0~t2)，在通過存在一個發光粒子的區域時(tl)，從發光粒子釋放出光，如在圖2的(B)中所描繪的那樣，在按時間序列的光強度數據上出現有意義的光強度(Em)的脈衝狀的信號。這樣，執行上述的光檢測區域CV的位置的移動和光檢測，一個一個地檢測其間出現的如圖2的(B)所例示的脈衝狀的信號(有意義的光強度)，由此逐個檢測發光粒子，並對其個數進行計數，從而能夠獲取在所測量的區域內存在的發光粒子的個數、或者與濃度或數密度有關的信息。另外，能夠根據信號的強度針對每個發光粒子檢測各種發光粒子的光的特性、發光粒子自身的特性。在所述的掃描分子計數法的原理中，不進行如螢光強度的波動的計算那樣的統計性的運算處理而是一個一個地檢測發光粒子，因此即使在要觀測的粒子的濃度低至通過FCS、FIDA等無法以足夠的精度進行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或數密度、特性有關的信息。
[0076]2.光檢測區域的巡迴移動
[0077]在上述掃描分子計數法中，典型地是，發光粒子所釋放出的光量是單分子~多分子程度的螢光色素所釋放出的光量的水平，因此非常微弱，另外，僅在樣本溶液內移動的光檢測區域包含發光粒子時檢測發光粒子的光，因此在一個發光粒子僅被光檢測區域包含一次的情況下，從該發光粒子獲得的光量或光子數非常低，因而有可能發光粒子的光的檢測精度變低、或者從發光粒子的光獲得的與波長特性有關的信息中的偏差變大。因此，在本發明中，如已經記述的那樣，嘗試一邊使光檢測區域在樣本溶液內沿著規定的路徑進行多次巡迴移動一邊進行上述光測量，從存在於規定的路徑內的同一發光粒子多次檢測出光而使來自一個發光粒子的光量增大，來提高發光粒子的存在的檢測以及發光粒子的光或發光粒子自身特性的檢測的精度。
[0078]圖2的(C)是示意性地表示使光檢測區域沿著掃描軌道(規定的路徑)進行多次巡迴移動的方式的圖。參照該圖，首先在本發明中，驅動圖1的反射鏡偏轉器17來變更光路，使光檢測區域的絕對位置沿著規定的路徑(掃描軌道)巡迴移動。在所述的光檢測區域巡迴移動的期間，如果掃描軌道內的發光粒子的位置幾乎不改變，則在每次光檢測區域通過該發光粒子的存在區域時都對該發光粒子的光進行測量，因而能夠從該發光粒子獲得更多的光量。而且，如果來自一個發光粒子的光量變多，則能夠期待提高發光粒子的存在的檢測和發光粒子的光或發光粒子自身特性的檢測的精度。
[0079]關於該點，為了在多次巡迴移動中檢測來自同一發光粒子的光，需要在該發光粒子通過擴散移動而離開掃描軌道之前完成期望次數的光檢測區域的巡迴移動。因而，在本發明中，優選的是，將光檢測區域的移動周期設定得比發光粒子通過擴散而離開掃描軌道的擴散時間短。具體地說，在時間t時擴散係數D的發光粒子因平移擴散而產生的平均平方位移通過下式給出，
[0080]= 6Dt...(I)
[0081]因此，該發光粒子離開半徑r的光檢測區域的時間大致為
[0082]t ~4r2/6D…(2)。[0083]因而，應該將光檢測區域的移動周期τ設定成使
[0084]τ < t ~4r2/6D...(3)
[0085]充分成立。即，例如當設掃描軌道為半徑R的圓時，移動速度V被確定為
[0086]V = 2 31 R/ τ > 2 n R/ (4r2/6D)…⑷。
[0087]光檢測區域的半徑通常為0.2 μ m~30 μ m，因此在是擴散係數D為2X 10_1(l[m2/s]~10X10_n[m2/s]的發光粒子的情況下，移動周期τ短於6s即可。另外，在光檢測區域的直徑為1.6 μ m、發光粒子的擴散係數為1.7X10_1(l[m2/S]的情況下，移動周期τ需要小於10ms。這樣，實際上以不超過根據發光粒子的擴散係數D與光檢測區域的半徑r或根據掃描軌道的半徑R而確定的光檢測區域的移動周期的上限的方式選擇光檢測區域的移動速度V和掃描軌道的路徑長度(或掃描軌道的半徑R)。 [0088]此外，如上述那樣，在發光粒子離開掃描軌道之前使光檢測區域在一個掃描軌道上巡迴的方式中，被檢測的發光粒子被限制為掃描軌道內的發光粒子。因而，掃描軌道的路徑長度越短，被檢測的發光粒子的個數越少，發光粒子的個數越少，從發光粒子信號獲得的與各種特性有關的檢測值的偏差越大，精度也越低。因此，為了使被檢測的發光粒子的個數增多，可以在每次光檢測區域沿著掃描軌道的巡迴達到規定次數時，例如都如圖2的(D)示意性地描繪的那樣驅動臺位置變更裝置17a來移動樣本溶液的位置，在移動後的位置處重複進行光檢測區域的巡迴移動。此時的移動距離只要移動得比光檢測區域的直徑長即可，因此典型地是I μ m以上。另外，樣本溶液的位置的路徑也可以是循環路徑，在這種情況下，可以將其周期設定得比發光粒子通過擴散而離開掃描軌道的擴散時間長(這是為了能夠檢測與已經測量過光的發光粒子不同的發光粒子的光。)。
[0089]3.光強度數據的信號處理
[0090]在掃描分子計數法中，當一邊使光檢測區域移動一邊進行光測量時，生成按時間序列的光強度數據。而且，通過後面詳細說明的方式，在時序光強度數據上，逐個地檢測表示發光粒子的光的信號。關於該點，如上述那樣，在將光檢測區域的巡迴移動的周期設定得比發光粒子通過擴散而離開掃描軌道的擴散時間短的情況下，時序光強度數據如圖3的(A)所示那樣示出在光檢測區域周期性地通過掃描軌道時所檢測出的光強度或光子數。即，在圖3的㈧的例子的情況下，區間Ι、Π、ΙΙΙ分別是第一輪、第二輪、第三輪的光檢測區域沿著掃描軌道巡迴移動時的光強度或光子數。而且，在光檢測區域巡迴移動時的速度固定時，或者在掃描軌道上的相同部位處始終相同時，時序光強度數據的時間周期性地對應掃描軌道上的位置。在圖示的例子的情況下，時序光強度數據中的時間t0、t3、t6、t9對應圖3的(B)中的掃描軌道的位置s0，時序光強度數據中的時間tl、t4、t5對應掃描軌道的位置Si，時序光強度數據中的時間t2、t5、t8對應掃描軌道的位置s2。因而，能夠假定掃描軌道上的發光粒子的光在時序光強度數據中大致周期性地在與掃描軌道的同一位置對應的時間出現。考慮到該情形，可以依照如下兩種方式中的任一個方式來執行基於光檢測區域在掃描軌道上巡迴移動所獲得的時序光強度數據進行的發光粒子的信號的檢測。
[0091]作為第一方式，如圖3的(C)示意性地描繪的那樣，按光檢測區域的移動周期對如圖3的(A)那樣的時序光強度數據進行劃分，按各分區的距起點的時間參照各分區的對應的時間處的光強度或光子數，來計算或確定它們的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最頻值，如圖3的(D)所例示的那樣生成將光強度或光子數的代表值按時間序列排列得到的時序光強度代表值數據。換言之，時序光強度代表值數據是由光檢測區域沿掃描軌道巡迴時的掃描軌道上的每個位置的光強度或光子數的代表值構成的時序數據。而且，當生成時序光強度代表值數據時，以後述的方式，在時序光強度代表值數據上通過吊鐘型函數的擬合(FC)等處理來檢測發光粒子的信號，使用從時序光強度代表值數據獲得的發光粒子的信號，來估算或確定發光粒子的光的特性或發光粒子自身的特性。此外，在該方式的情況下，能夠得到相對於發光粒子的信號相對降低噪聲水平這樣的效果。一般地，噪聲不依據掃描軌道上的位置而隨機地產生，與此相對地，發光粒子的信號始終在與掃描軌道上的大致相同的位置對應的時間處產生，因此在確定光強度的代表值的過程中，噪聲的強度相對於發光粒子的信號的強度相對地降低。
[0092]作為第二方式，如圖3的(E)所例示的那樣，在使光檢測區域在掃描軌道上巡迴移動而獲得的時序光強度數據中，首先執行發光粒子的信號的檢測。這樣，如已經記述的那樣，掃描軌道上的各發光粒子的信號(圖中為α、β)大致周期性地在與掃描軌道上的同一位置對應的時間處出現，因此參照每個發光粒子的信號來計算各發光粒子的信號的代表值、例如平均值、中央值、最小值、最大值或最頻值，根據所述代表值來估算或確定發光粒子的光的特性或發光粒子自身的特性。
[0093]掃描分子計數法的處理操作過程
[0094]在依照使用了圖1的(A)所例示的光分析裝置I的本發明的掃描分子計數法的實施方式中，具體地說，執行以下的處理:(1)包含發光粒子的樣本溶液的調製，⑵樣本溶液的光強度的測量處理以及(3)測量出的光強度的分析處理。圖4示出了以流程圖的形式表示的本實施方式中的處理。此外，(A)是在生成時序光強度代表值數據後進行發光粒子的信號的檢測時的處理，(B)示出了在發光粒子的信號的檢測之後確定信號的代表值時的處理。另外，(C)示出了發光粒子的信號的檢測處理的例子。
[0095](I)樣本溶液的調製
[0096]作為本發明的光分析技術的觀測對象物的粒子，如果是溶解的分子等在樣本溶液中分散並在溶液中隨機運動的粒子，則可以是任意的，例如可以是蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞、或金屬膠體、其它非生物學分子等。在作為觀測對象物的粒子不是發光的粒子的情況下，使用以任意的方式對作為觀測對象物的粒子附加了發光標識(螢光分子、磷光分子、化學、生物發光分子)的粒子。樣本溶液典型地是水溶液，但是不限定於此，可以是有機溶劑及其它任意的液體。
[0097](2)樣本溶液的光強度的測量(圖3的(A)、⑶-步驟100)
[0098]本實施方式的利用掃描分子計數法的光分析中的光強度的測量除了在測量過程中驅動反射鏡偏轉器17和臺位置變更裝置17a來進行光檢測區域的位置在樣本溶液內的移動(樣本溶液內的掃描)和樣本溶液的移動以外，可以通過與FCS或FIDA中的光強度的測量過程相同的方式執行。在操作處理中，典型地是，在向微板9的皿10注入樣本溶液並載置在顯微鏡的臺上後，在使用者向計算機18輸入開始測量的指示時，計算機18依照存儲在存儲裝置(未圖示)中的程序(使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的過程和在光檢測區域的位置的移動過程中檢測來自光檢測區域的光並生成按時間序列的光強度數據的過程)，開始樣本溶液內的光檢測區域中的激勵光的照射以及光強度的測量。在所述測量中，在依照計算機18的程序的處理動作的控制下，首先，反射鏡偏轉器17驅動反射鏡7 (檢電鏡)，來執行皿10內沿著掃描軌道的光檢測區域的位置的巡迴移動，與此同時地，光檢測器16將逐次檢測出的光變換為電信號並發送到計算機18，在計算機18中，通過任意的方式，根據所發送的信號生成按時間序列的光強度數據並保存。然後，當光檢測區域的位置的規定次數的巡迴移動結束時，臺位置變更裝置17a移動顯微鏡的臺上的微板9的位置，再次執行沿著掃描軌道的光檢測區域的位置的巡迴移動，同時進行按時間序列的光強度數據的生成和保存。這樣，重複進行任意次數的這些處理，結束一次測量。此外，典型地是，光檢測器16是能夠檢測單光子的到來的超高靈敏度光檢測器，因此在通過光子計數進行光的檢測的情況下，時序光強度數據可以是按時間序列的光子計數數據。
[0099]在光強度的測量過程中光檢測區域的位置沿著掃描軌道巡迴移動時的移動速度可以是任意設定、例如通過實驗或為符合分析目的而設定的規定的速度。在根據檢測出的發光粒子的個數來獲取與其數密度或濃度有關的信息的情況下，需要光檢測區域通過的區域的大小或體積，因此以能夠掌握移動距離的方式執行光檢測區域的位置的移動。此外，由於測量中的經過時間與光檢測區域的位置的移動距離具有比例關係更容易解釋測量結果，因此優選的是移動速度基本上是固定速度，但是不限定於此。
[0100]另外，優選的是，光檢測區域的位置的移動速度滿足上述式(3)的光檢測區域的移動周期τ的條件，並且為了定量地高精度地執行基於測量出的按時間序列的光強度數據的發光粒子的逐個檢測、或者發光粒子的個數的計數，而將光檢測區域的位置的移動速度設定為比發光粒子的隨機運動、即布朗運動所引起的移動速度快的值。本發明的光分析技術的觀測對象粒子是在溶液中分散或溶解並自由且隨機運動的粒子，因此由於布朗運動，位置隨著時間而移動。因而，在光檢測區域的位置的移動速度比粒子的布朗運動所引起的移動慢的情況下，如圖5的(A)示意性地描繪的那樣，粒子在區域內隨機地移動，由此光強度隨機地變化(如已經提及的那樣，光檢測區域的激勵光強度以區域的中心為頂點向外方降低。)，難以確定與各個發光粒子對應的有意義的光強度的變化。因此，優選的是將光檢測區域的位置的移動速度設定得比粒子因布朗運動引起的平均移動速度(擴散移動速度)快，使得如圖5的(B)所描繪的那樣粒子大致直線地橫穿光檢測區域，由此在按時間序列的光強度數據中，如圖5的(C)最上部所例示的那樣與各個發光粒子對應的光強度的變化的輪廓大致一致(在發光粒子大致直線地通過光檢測區域的情況下，光強度的變化的輪廓為與激勵光強度分布大致相同的 吊鐘型。)，從而能夠容易地確定各個發光粒子與光強度之間的對應。
[0101]具體地說，具有擴散係數D的發光粒子由於布朗運動而通過半徑Wo的光檢測區域(共焦區組織)時所需要的時間根據 以下的平均平方位移的關係式，
[0102](2ffo)2 = 6D.At— (5)
[0103]成為
[0104]At = (2ffo)2/6D— (6),
[0105]因此，發光粒子因布朗運動而移動的速度(擴散移動速度)Vdif大致為
[0106]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(7)。
[0107]因此，光檢測區域的位置的移動速度可以參照所述Vdif而設定為與其相比充分快的值。例如在預想觀測對象粒子的擴散係數是D=2.0X l(Tlclm2/s左右的情況下，在設Wo為0.62 μ m左右時，Vdif為1.0X 10_3m/s，因此，可以將光檢測區域的位置的移動速度設定為其10倍以上的15mm/s等。此外，在觀測對象粒子的擴散係數未知的情況下，可以設定各種光檢測區域的位置的移動速度，反覆執行用於找到使光強度的變化的輪廓為預想的輪廓(典型地是與激勵光強度分布大致相同)的條件的預備實驗，來確定適合的光檢測區域的位置的移動速度。
[0108](3)光強度的分析
[0109]當通過上述處理得到時序光強度數據時，在計算機18中，通過依照存儲在存儲裝置中的程序的處理，執行發光粒子的信號的檢測、發光粒子的計數、濃度計算等各種分析。另外，如已經記述的那樣，特別地，在本發明中，通過在發光粒子的信號的檢測之前在時序光強度數據中確定光強度的代表值的第一方式以及在發光粒子的信號的檢測之後確定所檢測出的信號的代表值的第二方式中的任一個方式來進行信號處理。下面，分別說明(i)在發光粒子的信號的檢測之前生成時序光強度代表值數據的情況(圖4的(A))以及(ii)在發光粒子的信號的檢測之後確定檢測信號的代表值的情況(圖4的(B))。
[0110]⑴在發光粒子的信號的檢測之前生成時序光強度代表值數據的情況
[0111](a)時序光強度代表值數據的生成處理(圖4的(A)的步驟20)
[0112]在時序光強度代表值數據的生成處理中，如與圖3的(C)相關聯的說明中所記述的那樣，按光檢測區域的移動周期τ對時序光強度數據進行劃分，以各分區的起點的時間tsi(i為分區的編號)為基準，按各分區的距起點的時間tsi(i為分區的編號)的時間[t1-1Xtsi]來從各分區 的數據讀出光強度值(光子數)，計算或確定這些被讀出的所有分區的時間[t1-1Xtsi]處的光強度的代表值、即平均值、中央值、最小值、最大值或最頻值。這樣，當確定光強度的代表值直到到達了分區的終點的時間tei時，生成將分區的從起點的時間ts至終點的時間te為止的光強度的代表值按時間序列排列而構成的時序光強度代表值數據。
[0113](b)發光粒子的信號的逐個檢測(參照圖4的㈧的步驟30、圖4的(C))
[0114]當通過上述處理生成時序光強度代表值數據時，在所述光強度數據上執行逐個檢測發光粒子的信號的處理。如已經提及的那樣，在一個發光粒子通過光檢測區域時的軌跡如圖5的(B)所示那樣是大致直線狀的情況下，與該粒子對應的信號在光強度數據上的光強度的變化具有反映由光學系統決定的光檢測區域內的光強度分布的大致吊鐘狀的輪廓。因而，在掃描分子計數法中，基本上可以在光強度數據上超過適當設定的閾值Ith的光強度值所持續的時間寬度△ τ處於規定的範圍時，判斷為具有該光強度的輪廓的信號與一個粒子通過光檢測區域的情況對應，進行一個發光粒子的檢測。而且，光強度超過閾值或者時間寬度△ τ不在規定的範圍內的信號被判斷為噪聲或異物的信號。另外，在能夠將光檢測區域的光強度分布假定為高斯分布，即
[0115]= A.eXp (_2t2/a2)...(8)
[0116]時，在使式(8)擬合有意義的光強度的輪廓(能夠明確地判斷為不是背景的輪廓)而計算出的強度A和寬度a處於規定的範圍內時，可以將該光強度的輪廓判斷為與一個粒子通過光檢測區域的情況對應，進行一個發光粒子的檢測。(強度A和寬度a處於規定的範圍外的信號被判斷為噪聲或異物的信號，在其後的分析等中可以忽略。)
[0117]在光強度數據上的信號的檢測處理的一個例子中，首先，對光強度數據(圖5的
(C)、最上部「檢測結果(未處理)」)進行平滑(平滑化)處理(圖4的(C)-步驟110、圖5的(C)的中上部「平滑」)。發光粒子所發出的光是概率性地釋放的，在微小的時間內可能產生數據值的缺失，因此通過所述平滑處理，能夠忽略如上所述的數據值的缺失。例如可以通過移動平均法進行平滑處理。此外，可以根據獲取光強度數據時的光檢測區域的位置的移動速度(掃描速度)、BIN --ΜΕ，適當地設定執行平滑處理時的參數、例如在移動平均法中進行一次平均的數據個數、移動平均的次數等。
[0118]接著，在平滑處理後的光強度數據中，為了檢測有意義的脈衝狀的信號(以下稱為「脈衝信號」)所存在的時間區域(脈衝存在區域)，對平滑處理後的光強度數據的時間運算一次微分值(步驟120)。光強度數據的時間微分值如圖5的(C)的中下部「時間微分」所例示的那樣，在信號值變化的時刻值的變化大，因此通過參照所述時間微分值，能夠有利地確定有意義的信號的起點和終點。
[0119]然後，在光強度數據上逐次檢測有意義的脈衝信號(步驟130~160)。具體地說，首先在光強度數據的時間微分值數據上，參照時間微分值逐次搜索並確定一個脈衝信號的起點和終點，確定脈衝存在區域(步驟130)。當確定了一個脈衝存在區域時，針對該脈衝存在區域中的平滑後的時序光強度數據進行吊鐘型函數的擬合(圖5的(C)的下部「吊鐘型函數擬合」)，計算吊鐘型函數的脈衝的峰值(最大值)的強度Ipeak、脈衝寬度(半峰全寬)Wpeak、擬合時的(最小二乘法的)相關係數等參數(步驟140)。此外，擬合的吊鐘型函數典型地是高斯函數，但也可以是洛侖茲型函數。然後，判斷計算出的吊鐘型函數的參數是否處於對針對一個發光粒子通過光檢測區域時檢測出的脈衝信號所描繪的吊鐘型輪廓的參數所設想的範圍內，即脈衝的峰值強度、脈衝寬度、相關係數是否分別處於規定範圍內等(步驟150)。這樣，如圖6的左邊所示那樣，將被判斷為計算出的吊鐘型函數的參數處於針對與一個發光粒子對應的信號設想的範圍內的信號判斷為是與一個發光粒子對應的信號，由此，檢測出一個發光粒子。另一方面，如圖6的右邊所示那樣，計算出的吊鐘型函數的參數不在設想的範圍內的脈衝信號作為噪聲而被忽略。此外，可以與發光粒子的信號的檢測同時地執行信號數的計數、即發光粒子的計數。
[0120]可以在光`強度數據的整個區域中反覆執行上述步驟130~150的處理中的脈衝信號的搜索和判斷(步驟160)。此外，根據光強度數據逐個檢測發光粒子的信號的處理不限於上述的過程，可以通過任意的方法執行。
[0121](ii)在發光粒子的信號的檢測之後確定檢測信號的代表值的情況
[0122]如圖4的(B)所示那樣，在發光粒子的信號的檢測處理(步驟20)之後計算或確定所檢測出的發光粒子信號的代表值(步驟30)的情況下，首先，在通過步驟10獲得的時序光強度數據中，例如直接依照式(8)的擬合或圖4的(C)所示的處理，與上述同樣地執行發光粒子的信號的檢測。此時，可以與發光粒子的信號的檢測同時地執行信號數的計數、即發光粒子的計數。然後，如圖3的(E)示意性地描繪的那樣，按各周期對時序光強度數據進行劃分，針對每個發光粒子，從各分區的數據中挑出信號的強度值(例如峰值強度)，來計算或確定它們的代表值、即平均值、中央值、最小值、最大值或最頻值。
[0123](iii)發光粒子濃度的確定
[0124]在對檢測出的發光粒子的信號的個數進行計數來確定發光粒子的個數的情況下，如果通過任意的方法能夠估算出光檢測區域所通過的區域的總體積，則能夠根據其體積值和發光粒子的個數來確定樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度(步驟40)。[0125]光檢測區域所通過的區域的總體積可以根據激勵光或檢測光的波長、透鏡的數值孔徑、光學系統的調整狀態在理論上進行估算，但是也可以如下這樣確定:進行實驗，例如針對發光粒子的濃度已知的溶液(對照溶液)以與要檢查的樣本溶液的測量相同的條件進行上述所說明的光強度的測量、發光粒子的檢測以及計數，根據通過實驗所檢測出的發光粒子的個數和對照溶液的發光粒子的濃度來確定。具體地說，例如當針對發光粒子的濃度C的對照溶液，將對照溶液的發光粒子的檢測數設為N時，光檢測區域所通過的區域的總體積Vt通過下式給出。
[0126]Vt = N/C...(9)
[0127]另外，可以準備發光粒子的濃度不同的多個溶液作為對照溶液，針對多個溶液分別執行測量，採用計算出的Vt的平均值作為光檢測區域所通過的區域的總體積vt。而且，當給出Vt時，發光粒子的計數結果為η的樣本溶液的發光粒子的濃度C通過下式給出。
[0128]c = n/Vt …(10)
[0129]此外，可以不依據上述的方法而通過任意的方法、例如通過利用FCS、FIDA等給出光檢測區域的體積、光檢測區域所通過的區域的總體積。另外，在本實施方式的光分析裝置中，對於所設想的光檢測區域的移動圖案，可以將關於各種標準的發光粒子的濃度C與發光粒子的個數N之間的關係(式(9))的信息預先存儲到計算機18的存儲裝置中，在裝置的使用者實施光分析時能夠適當地利用所存儲的關係的信息。
[0130](iv)各種特性的確定
[0131]當進行發光粒子信號的檢測時，除了發光粒子濃度以外還能夠使用信號的強度值獲得各種與發光 粒子的光的特性、發光粒子自身的特性有關的信息(信號的特徵量)。例如在檢測光的測量中，按偏振方向分別測量檢測光，在按偏振方向生成了光強度數據的情況下，能夠根據基於這些光強度數據分別獲得的信號的強度值來計算表示偏振度、偏振各向異性等偏振特性的任意指標值，根據所述指標值進一步計算發光粒子的旋轉擴散特性的指標值。另外，在檢測光的測量中，針對檢測光分別測量多個波長頻帶的成分，在按波長頻帶生成了光強度數據的情況下，能夠根據基於這些光強度數據分別獲得的信號的強度值來獲得與發光粒子的發光波長頻譜有關的信息(例如多個波長處的強度比)。在此，應該理解的一點在於在作為本發明的對象的掃描分子計數法中，能夠針對每個發光粒子確定如上所述的與發光粒子的光的特性、發光粒子自身的特性有關的信息。另外，在本發明中，針對每一個發光粒子獲得通過多次測量得到的光強度值並確定它們的代表值，因此能夠期待(與對每一個發光粒子都只執行一次測量的情況相比)降低與發光粒子的光的特性、發光粒子自身的特性有關的信息的偏差，改善檢測精度。
[0132]這樣，根據上述本發明，在掃描分子計數法中，光檢測區域多次通過規定的路徑而在該期間重複測量同一發光粒子所釋放出的光，由此能夠抑制使用所測量出的光強度數據檢測各個發光粒子的存在和/或其特性時的偏差，提高檢測精度。
[0133]為了驗證上述所說明的本發明的有效性而進行了如下的實驗。此外，下面的實施例例示本發明的有效性，應該理解不是限定本發明的範圍。
[0134]實施例1
[0135]依照上述掃描分子計數法，從光檢測區域沿著規定路徑巡迴移動的期間通過光測量獲得的時序光強度數據中檢測發光粒子的信號，對發光粒子信號的峰值強度的偏差與光檢測區域的巡迴次數的關係進行了評價。
[0136]作為樣本溶液，調製出在磷酸緩衝液(包含0.05%Tween20)中溶解IOnM的螢光色素 SYTOX Orange (Invitrogen 公司、Cat.N0.S-11368)和 IpM 的質粒 pbr322 (takara-bio株式會社、Cat.N0.3035)得到的溶液。SYTOX Orange是DNA嵌入劑色素，當與DNA結合時，螢光強度增大500倍左右。在光的測量中，作為光分析裝置，利用具備共焦螢光顯微鏡的光學系統和光子計數系統的單分子螢光測量裝置MF20 (奧林巴斯株式會社)，依照在上述的「 (2)樣本溶液的光強度的測量」中所說明的方式，針對上述樣本溶液獲取了時序光強度數據(光子計數數據)。此時，激勵光使用633nm的雷射，利用帶通濾波器測量660nm-710nm的波長頻帶的光。將樣本溶液中的光檢測區域的位置的掃描軌道設為半徑為大約24μ m的圓，移動速度設為15mm/秒，巡迴移動的周期設為IOms (=6000rpm) JfBIN --ΜΕ設為10 μ s，進行了兩秒鐘的測量。
[0137]在光測量後的數據處理中，依照與圖3的(C)相關聯地說明的在檢測發光粒子的信號之前生成時序光強度代表值數據的方式，按作為移動周期的IOms對時序光強度數據進行劃分，按各分區的距起點的時間(按BIN TIME)計算光子計數值的平均值，生成按時間序列的光子計數值的代表值數據。然後，在所述代表值數據中進行發光粒子的信號的逐個檢測。發光粒子的信號的檢測依照「(b)發光粒子的信號的逐個檢測」和圖4的(C)的步驟110~160所記載的要領，對時序光子計數代表值數據實施平滑處理，在平滑後的數據中確定脈衝信號的起點和終點，之後通過最小二乘法使高斯函數擬合各脈衝信號，確定(高斯函數中的)峰值強度、脈衝寬度(半峰全寬)、相關係數。然後，只抽出滿足下述的條件的脈衝信號作為發光粒子的信號，
[0138]20 μ s< 脈衝寬度〈400 μ S
[0139]峰值強度>1 [pc/ΙΟ μ s]...(A)`[0140]相關係數>0.95
[0141]計算所抽出的發光粒子信號的峰值強度(峰值強度是信號的特徵量之一。)的平均值和CV值。
[0142]圖7示出在變更生成時序光子計數代表值數據(按時間序列的平均值數據)時的數據的分區數、即光檢測區域在一個掃描軌道中的巡迴次數的情況下(在時序光子計數代表值數據上)檢測出的發光粒子信號的峰值強度的平均值和CV值的變化。如從圖中理解的那樣，峰值強度的平均值本身在巡迴次數I~9中看不到太大的變化，但是當巡迴次數增加時，作為值的偏差的指標值的CV值下降。特別地，相對於巡迴次數為一次時的CV值為110%，巡迴次數為17次時的CV值下降到55%，值的偏差得到抑制。[當巡迴次數增加時峰值強度的平均值下降，考慮是因為發光粒子的位置逐漸移動而光子計數值分散在之前或之後的時間中。]其結果，示出了根據本發明的方法，發光粒子信號的特徵量的偏差被進一步降低、檢測精度得到改善。
[0143]實施例2
[0144]作為樣本溶液，使用實施例1的磷酸緩衝液(不包含發光粒子)，在通過與實施例1相同的方式進行光檢測和時序光子計數代表值數據的調製之後，作為背景噪聲的大小的指標值，計算對代表值數據的整個區域的光子數的平均值加上其標準偏差的3倍的值而得到的參照值(噪聲水平)。圖8示出變更生成時序光子計數代表值數據時的數據的分區數、即光檢測區域在一個掃描軌道中的巡迴次數的情況下的上述噪聲水平的變化。如參照該圖理解的那樣，巡迴次數越多，噪聲水平越降低。如已經提及的那樣，背景噪聲不依據光檢測區域在掃描軌道上的位置而隨機地產生。即，背景噪聲在與掃描軌道上的同一位置對應的時間處重複產生的可能性極低，因此認為在生成時序光子計數代表值數據時進行參照的分區數越多，相比於在與掃描軌道上的大致同一位置對應的時間處產生的發光粒子的信號的強度，背景噪聲的強度越是相對地降低。通過圖8的結果確認出該情形。
[0145]實施例3
[0146]在光分析裝置中，在激勵光光路上插入偏振片來使激勵光向一個方向偏振，在檢測光光路上插入偏振分束器，作為檢測光而分別檢測與激勵光的偏振方向垂直的方向的成分Iv和平行的方向的成分IH，除此之外，以與實施例1相同的條件進行光測量、數據處理，進行了發光粒子的信號的檢測。然後，使用獲得的發光粒子的信號，針對每個發光粒子計算偏振度(Iv-1h) / (Iv+Ih)，並計算出其平均值和CV值。
[0147]圖9示出變更了生成時序光子計數代表值數據時的數據的分區數、即光檢測區域在一個掃描軌道中的巡迴次數的情況下的發光粒子信號的偏振度的平均值和CV值的變化。如從圖中理解的那樣，偏振度的平均值本身在巡迴次數I~17中看不到太大的變化，但是當巡迴次數增加時，作為值的偏差的指標值的CV值下降。特別地，相對於巡迴次數為一次時的CV值為35%，巡迴次數為17次時的CV值下降到16%，值的偏差得到抑制。其結果，示出了根據本發明的方法，發光粒子信號的特徵量的偏差被進一步降低、檢測精度得到改善。
[0148]實施例4
[0149]將各種濃度的熒 光色素溶液作為樣本溶液，依照本發明通過掃描分子計數法執行發光粒子的信號的檢測，確認了能夠通過本發明的掃描分子計數法確定的發光粒子濃度的下限。
[0150]作為樣本溶液，調製出在磷酸緩衝液(包含0.05%Tween20)中包含IaM~IOpM的螢光色素ATT0647N(Sigma-Aldrich)的溶液。在光的測量中，作為光分析裝置，利用具備共焦螢光顯微鏡的光學系統和光子計數系統的單分子螢光測量裝置MF20 (奧林巴斯株式會社)，依照上述的「(2)樣本溶液的光強度的測量」中所說明的方式，針對上述的包含螢光色素的色素溶液和不包含螢光色素的緩衝液分別獲取了時序光強度數據(光子計數數據)。此時，激勵光使用633nm的雷射,利用帶通濾波器測量660nm-700nm的波長頻帶的光,生成時序光子計數數據。樣本溶液中的光檢測區域的位置的掃描軌道設為半徑為大約72 μ m的圓，移動速度設為90mm/s，巡迴移動的周期設為5ms (=12000rpm)，將BIN --ΜΕ設為10 μ s，進行了 600秒鐘的測量。
[0151]在光測量後的數據處理中，依照與圖3的(C)相關聯地說明的在檢測發光粒子的信號之前生成時序光強度代表值數據的方式，按作為移動周期的5ms對時序光強度數據進行劃分，按各分區的距起點的時間(按BIN TIME)計算巡迴三次的數據的光子計數值的平均值，生成了按時間序列的光子計數值的代表值數據。然後，在所述代表值數據中，與實施例I的情況同樣地進行發光粒子的信號的逐個檢測，對檢測出的發光粒子信號的個數進行了計數。
[0152]圖10示出使用各濃度(橫軸)的色素溶液時的發光粒子信號的檢測數(縱軸)。圖中分別對在通過三次600秒鐘的測量得到的巡迴三次的數據的平均值數據中檢測出的粒子數(有重疊處理.)和在巡迴一次的數據中檢測出的粒子數(無重疊處理Λ)進行了繪製。參照該圖，在無重疊處理的情況下，在IfM以下失去了檢測粒子數與色素濃度的線性，與此相對地，在有重疊處理的情況下，直到IOOaM位置能夠獲得檢測粒子數與色素濃度的線性。由此，示出了根據本發明，容易對發光粒子信號和噪聲信號進行識別，測量靈敏度得到改善。
[0153]這樣，如從上述實施例的結果理解的那樣，依照本發明的教導，在使光檢測區域沿著同一規定路徑巡迴來多次測量來自一個發光粒子的光的情況下，發光粒子信號的特徵量的偏差降低，由此檢測精度得到提高。另外，在生成時序光強度代表值數據的情況下，背景噪聲相對地降低，能夠期待S/N比的改善。
【權利要求】
1.一種光分析裝置，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析裝置的特徵在於，包括: 光檢測區域移動部，其通過變更上述光學系統的光路來使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內沿著規定路徑移動； 光檢測部，其檢測來自上述光檢測區域的光；以及 信號處理部，其生成一邊使上述光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動一邊由上述光檢測部檢測出的來自上述光檢測區域的光的按時間序列的光強度數據，在上述按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號， 其中，上述光檢測區域移動部使上述光檢測區域的位置沿著上述規定路徑移動至少兩輪，上述信號處理部使用在上述光檢測區域的位置沿著上述規定路徑移動上述至少兩輪的期間獲得的上述按時間序列的光強度數據，來逐個檢測表示來自存在於上述規定路徑內的各個發光粒子的光的信號。
2.根據權利要求1所述的光分析裝置，其特徵在於， 在每次上述光檢測區域的位置沿著上述規定路徑的規定輪數的移動結束時，移動上述樣本溶液的位置，在移動後的上述樣本溶液的位置處重複進行通過由上述光檢測區域移動部變更上述光學系統的光路來進行的上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內沿著規定路徑的至少兩輪的移動、由上述光檢測部進行的來自上述光檢測區域的光的檢測以及由上述信號處理部進行的上述按時間序列的光強度數據的生成，針對上述樣本溶液移動後的每個位置執行上述按時間序列的光強度數據中的表示來自存在於上述規定路徑內的各個發光粒子的光的信號的逐個檢測。
3.根據權利要求1或2所述的光分析裝置，其特徵在於， 使上述光檢測區域的位置以比上述發光粒子通過擴散而離開上述規定路徑的擴散時間短的周期沿著上述規定路徑移動。
4.根據權利要求1至3中的任一項所述的光分析裝置，其特徵在於， 上述信號處理部生成由上述按時間序列的光強度數據中按上述規定路徑上的每個位置確定的光強度值的代表值構成的時序光強度代表值數據，在該時序光強度代表值數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號並檢測信號的特徵量。
5.根據權利要求1至3中的任一項所述的光分析裝置，其特徵在於， 上述信號處理部在上述按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號並檢測該信號的特徵量，按每個發光粒子計算上述信號的特徵量的代表值。
6.根據權利要求4或5所述的光分析裝置，其特徵在於， 上述信號的特徵量是從由光強度、光子數、偏振度、旋轉擴散常數以及發光頻譜構成的群中選擇的至少一個。
7.根據權利要求1至6中的任一項所述的光分析裝置，其特徵在於， 上述信號處理部對逐個檢測出的表示來自上述發光粒子的光的信號的個數進行計數來對在上述光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的上述發光粒子的個數進行計數。
8.根據權利要求1至7中的任一項所述的光分析裝置，其特徵在於， 上述信號處理部在檢測出表不具有大於規定閾值的強度的光的信號時檢測為一個發光粒子進入了上述光檢測區域。
9.根據權利要求1至8中的任一項所述的光分析裝置，其特徵在於， 上述信號處理部使上述按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化後的上述按時間序列的光強度數據中具有超過上述規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個上述發光粒子的光的信號。
10.根據權利要求1至9中的任一項所述的光分析裝置，其特徵在於， 上述信號處理部根據所檢測出的上述發光粒子的個數來確定上述樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
11.一種光分析方法，使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析方法的特徵在於，包括以下過程: 光檢測區域巡迴移動過程，通過變更上述光學系統的光路來使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內沿著規定路徑移動至少兩輪； 時序光強度數據生成過程，在上述光檢測區域的位置沿著上述規定路徑移動上述至少兩輪的期間，檢測來自上述光檢測區域的光來生成按時間序列的光強度數據；以及 發光粒子信號檢測過程，使用上述按時間序列的光強度數據來逐個檢測表示來自存在於上述規定路徑內的各個發光粒子的光的信號。
12.根據權利要求11所述的光分析方法，其特徵在於， 還包括以下過程:在每次上述光檢測區域的位置沿著上述規定路徑的規定輪數的移動結束時，移動上述樣本溶液的位置， 其中，在移動後的上述樣本溶液的位置處重複進行上述光檢測區域巡迴移動過程和上述時序光強度數據生成過程，針對上述樣本溶液移動後的每個位置執行上述發光粒子信號檢測過程。
13.根據權利要求11或12所述的光分析方法，其特徵在於， 使上述光檢測區域的位置以比上述發光粒子通過擴散而離開上述規定路徑的擴散時間短的周期沿著上述規定路徑移動。
14.根據權利要求11至13中的任一項所述的光分析方法，其特徵在於， 還包括以下過程:生成由上述按時間序列的光強度數據中按上述規定路徑上的每個位置確定的光強度值的代表值構成的時序光強度代表值數據， 其中，在上述發光粒子信號檢測過程中，在該時序光強度代表值數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號並檢測信號的特徵量。
15.根據權利要求11至13中的任一項所述的光分析方法，其特徵在於， 在上述發光粒子信號檢測過程中，在上述按時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號並檢測該信號的特徵量，按每個發光粒子計算上述信號的特徵量的代表值。
16.根據權利要求14或15所述的光分析方法，其特徵在於， 上述信號的特徵量是從由光強度、光子數、偏振度、旋轉擴散常數以及發光頻譜構成的群中選擇的至少一個。
17.根據權利要求11至16中的任一項所述的光分析方法，其特徵在於， 還包括以下過程:對逐個檢測出的表示來自上述發光粒子的光的信號的個數進行計數來對在上述光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的上述發光粒子的個數進行計數。
18.根據權利要求11至17中的任一項所述的光分析方法，其特徵在於， 在上述發光粒子信號檢測過程中，在檢測出表示具有大於規定閾值的強度的光的信號時檢測為一個發光粒子進入了上述光檢測區域。
19.根據權利要求11至18中的任一項所述的光分析方法，其特徵在於， 在上述發光粒子信號檢測過程中，使上述按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化後的上述按時間序列的光強度數據中具有超過上述規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個上述發光粒子的光的信號。
20.根據權利要求11至19中的任一項所述的光分析方法，其特徵在於， 還包括以下過程:根據所檢測出的上述發光粒子的個數來確定上述樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
21.一種光分析用電腦程式，用於使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，該光分析用電腦程式的特徵在於，使計算機執行以下步驟: 光檢測區域巡迴移動步驟，通過變更上述光學系統的光路來使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內沿著規定路徑移動至少兩輪； 時序光強度數據生成步驟，在上述光檢測區域的位置沿著上述規定路徑移動上述至少兩輪的期間，檢測來自上述光檢測區域的光來生成按時間序列的光強度數據；以及 發光粒子信號檢測步驟，使用上述按時間序列的光強度數據逐個檢測表示來自存在於上述規定路徑內的各個發光粒子的光的信號。
22.根據權利要求21所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 還包括以下步驟:在每次上述光檢測區域的位置沿著上述規定路徑的規定輪數的移動結束時，移動上述樣本溶液的位置， 其中，在移動後的上述樣本溶液的位置處重複進行上述光檢測區域巡迴移動步驟和上述時序光強度數據生成步驟，針對上述樣本溶液移動後的每個位置執行上述發光粒子信號檢測步驟。
23.根據權利要求21或22所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 使上述光檢測區域的位置以比上述發光粒子通過擴散而離開上述規定路徑的擴散時間短的周期沿著上述規定路徑移動。
24.根據權利要求21至23中的任一項所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 還包括以下步驟:生成由上述按時間序列的光強度數據中按上述規定路徑上的每個位置確定的光強度值的代表值構成的時序光強度代表值數據， 其中，在上述發光粒子信號檢測步驟中，在該時序光強度代表值數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號並檢測信號的特徵量。
25.根據權利要求21至23中的任一項所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 在上述發光粒子信號檢測步驟中，在上述按 時間序列的光強度數據中逐個檢測表示來自各個上述發光粒子的光的信號並檢測該信號的特徵量，按每個發光粒子計算上述信號的特徵量的代表值。
26.根據權利要求24或25所述的光分析用電腦程式，其特徵在於，上述信號的特徵量是從由光強度、光子數、偏振度、旋轉擴散常數以及發光頻譜構成的群中選擇的至少一個。
27.根據權利要求21至26中的任一項所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 還使計算機執行以下步驟:對逐個檢測出的表示來自上述發光粒子的光的信號的個數進行計數來對在上述光檢測區域的位置的移動過程中檢測出的上述發光粒子的個數進行計數。
28.根據權利要求21至27中的任一項所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 在上述發光粒子信號檢測步驟中，在檢測出表示具有大於規定閾值的強度的光的信號時檢測為一個發光粒子進入了上述光檢測區域。
29.根據權利要求21至28中的任一項所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 在上述發光粒子信號檢測步驟中，使上述按時間序列的光強度數據平滑化，將平滑化後的上述按時間序列的光強度數據中具有超過上述規定閾值的強度的吊鐘型的脈衝狀信號檢測為表示來自單個上述發光粒子的光的信號。
30.根據權利要求21 至29中的任一項所述的光分析用電腦程式，其特徵在於， 還使計算機執行以下步驟:根據所檢測出的上述發光粒子的個數來確定上述樣本溶液中的發光粒子的數密度或濃度。
【文檔編號】G01N21/64GK103765196SQ201280041770
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年7月26日 優先權日:2011年8月26日
【發明者】田邊哲也, 山口光城 申請人:奧林巴斯株式會社