利用單個發光粒子檢測的光分析方法

2023-09-19 00:56:20 1

專利名稱：利用單個發光粒子檢測的光分析方法
技術領域：
本發明涉及一種光分析方法，其能夠使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統等可檢測來自溶液中的微小區域的光的光學系統，檢測來自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它們的聚合體(以下將它們稱為「粒子」)、例如蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的對象物、或非生物學粒子的光，來獲取在分析或解析它們的狀態(相互作用、結合/離解狀態等)時有用的信息，更詳細地說，涉及一種能夠使用如上所述的光學系統個別檢測來自單個的發光的粒子的光並進行各種光分析的方法。此外，在本說明書中，發光的粒子(以下稱為「發光粒子」)可以是其自身發光的粒子、或附加了任意的發光標識或發光探針的粒子中的任意一個，從發光粒子發出的光可以是螢光、磷光、化學發光、生物發光、散射光等。
背景技術：
由於近年來的光計量技術的發展，使用共焦顯微鏡的光學系統和還能夠進行光子計數(單光子檢測)的超高靈敏度的光檢測技術，能夠檢測/測量單光子或螢光單分子水平的微弱光。因此，提出了各種使用這樣的微弱光的計量技術對生物體分子等的特性、分子間相互作用、或結合/離解反應進行檢測的裝置或方法。例如，在螢光相關分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如參照專利文獻 1-3、非專利文獻 1-3)中，利用雷射共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術，測量來自出入樣本溶液中的微小區域(被稱為顯微鏡的雷射會聚的焦點區域-共焦區組織)內的螢光分子或被螢光標識的分子(螢光分子等)的螢光強度，根據由該測量得到的螢光強度的自相關函數的值所確定的在微小區域內螢光分子等的平均滯留時間(平移擴散時間)和滯留的分子的個數的平均值，獲取螢光分子等的運動的速度或大小、濃度之類的信息，或檢測分子的構造或大小的變化、分子的結合/離解反應或分散/聚合之類的各種現象。另外，在螢光強度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如專利文獻 4、非專利文獻4)、光子計數直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如專利文獻5)中，生成與FCS同樣地計量出的出入共焦區組織內的螢光分子等的螢光強度的直方圖，使統計性的模型公式擬合該直方圖的分布，由此估算螢光分子等的固有的亮度的平均值和滯留在共焦區組織內的分子的個數的平均值，根據這些信息估計分子的構造或大小的變化、結合/離解狀態、分散/聚合狀態等。另外，除此以外，在專利文獻6、7中，提出了根據利用共焦顯微鏡的光學系統計量出的樣本溶液的螢光信號的時間經過來檢測螢光性物質的方法。專利文獻8提出了一種信號運算處理技術，其用於使用光子計數技術計量來自流通於流式細胞儀的螢光微粒子或固定在基板上的螢光微粒子的微弱光，來檢測流體中或基板上的螢光微粒子的存在。特別是，根據FCS、FIDA等使用了利用共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術進行微小區域的螢光測量的技術的方法，需要測量的樣本與以前相比可以是極低濃度且極微量(在一次測量中使用的量至多為幾十UL左右)，測量時間也大幅縮短(在一次測量中多次反覆進行秒級時間的計量)。因而，這些技術特別是在對醫學、生物學的研究開發領域中經常使用的稀少或昂貴的樣本進行分析的情況下，或在疾病的臨床診斷、生理活性物質的篩選等檢測體數多的情況下，期待成為與以前的生物化學方法相比能夠廉價或迅速地執行實驗或檢查的強力工具。專利文獻1:日本特開2005-098876專利文獻2:日本特開2008-292371專利文獻3:日本特開2009-281831專利文獻4:專利第4023523號專利文獻5:國際公開2008-080417專利文獻6:日本特開2007-20565專利文獻7:日本特開2008-116440專利文獻8:日本特開平4-337446號公報非專利文獻1:金城政孝、蛋白質核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438頁1999年非專利文獻2:F.J.Meyer-Alms> 突光相關譜(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler 編、Springer、柏林、2000 年、204-224 頁非專利文獻3:加藤則子及其它4名、遺傳醫學、Vol.6、N0.2,271-277頁非專利文獻4:卡斯柯(Kask)及其它3名、美國科學學院紀要、1999年、96卷、13756-13761 頁(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

發明內容
發明要解決的問題在上述的FCS、FIDA等使用了共焦顯微鏡的光學系統和光子計數技術的光學分析技術中，所計量的光是從螢光單分子或多分子發出的光，但在該光的分析中，執行時序地測量出的螢光強度數據的自相關函數的運算或對直方圖擬合之類的螢光強度的波動的計算等統計性的處理，並非個別地參照或分析來自各個螢光分子等的光的信號。即，在這些光分析技術中，對來自多個螢光分子等的光的信號統計性地進行處理，針對螢光分子等檢測統計平均性的特性。因而，為了在這些光分析技術中得到統計上有意義的結果，樣本溶液中的作為觀測對象的螢光分子等的濃度或個數密度需要在平衡狀態下是在一次的秒級長度的計量時間內能夠進行統計性的處理的個數的螢光分子等出入微小區域內的水平，優選的是在微小區域內始終存在一個左右的螢光分子等的水平。實際上，共焦區組織的體積為IfL左右，因此，在上述的光分析技術中使用的樣本溶液中的螢光分子等的濃度典型的是InM左右或其以上，在大幅低於InM時，在共焦區組織內不存在螢光分子等的時間產生而無法得到統計上有意義的分析結果。另一方面，在專利文獻6 8所記載的螢光分子等的檢測方法中，不包括螢光強度的波動的統計性的運算處理，即使樣本溶液中的螢光分子等小於InM也能夠檢測螢光分子等，但無法達成定量地計算出在溶液中隨機運動的螢光分子等的濃度或個數密度之類的情況。因此，本申請的申請人在日本特願2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基於以下的新原理的光分析技術，即能夠定量地觀測比利用FCS、FIDA等包含統計性處理的光分析技術對作為觀測對象的發光粒子的濃度或個數密度進行處理的水平低的樣本溶液中的發光粒子的狀態或特性。在該新的光分析技術中，如果清楚地進行描述，則與FCS、FIDA等同樣地，在使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統等能夠檢測來自溶液中的微小區域的光的光學系統的情況下，一邊使作為光的檢測區域的微小區域(以下稱為「光檢測區域」)的位置在樣本溶液中移動，即一邊通過光檢測區域對樣本溶液內進行掃描，一邊在光檢測區域包含在樣本溶液中分散且隨機地運動的發光粒子時檢測從該發光粒子發出的光，由此，能夠對樣本溶液中的發光粒子逐個地進行個別檢測，來獲取與發光粒子的計數、樣本溶液中的發光粒子的濃度或個數密度有關的信息。根據該新的光分析技術(以下稱為「掃描分子計數法」)，與FCS、FIDA等光分析技術同樣地，需要測量的樣本可以是微量的(例如幾十UL左右)，另外，測量時間短，並且與FCS、FIDA等光分析技術的情況相比，能夠檢測更低的濃度或個數密度的發光粒子的存在，定量地檢測其濃度、個數密度或其它特性。但是，在上述的掃描分子計數法中，一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊進行計量而得到的光強度值(或光子計數值)的時序的數據中，在觀測到相當於來自發光粒子的光的光強度增大、即某個閾值以上的光的強度(典型的是吊鐘狀的曲線地)增大時，判定為在光檢測區域內包含一個發光粒子，由此進行一個發光粒子的存在的檢測。但是，在該結構中，在由於樣本溶液中的發光粒子的濃度比較高而在光檢測區域內暫時包含兩個以上的發光粒子從而產生同時觀測這些發光粒子的光的時間的情況下，即在光強度數據上表不來自多個發光粒子的光的信號一部分在時間上重疊的情況下，難以分別對各個發光粒子區別地進行檢測，有可能無法準確地獲取發光粒子的個數、或濃度、或個數密度等信息。實際上，如後面所記載的實施例所示那樣，發現了在樣本溶液中的發光粒子的濃度高時(約InM以上)，發光粒子的檢測個數低於根據樣本溶液中的發光粒子的濃度所預期的個數，發光粒子的檢測個數的精度惡化。通過在顯微鏡的光學系統中變更激勵光的聚光狀態或針孔的直徑而縮小光檢測區域，使得暫時包含在光檢測區域內的發光粒子的個數實質上始終為一個以下，由此能夠解決由該光檢測區域中暫時包含兩個以上發光粒子的狀態發生所引起的問題，但實際上，難以進行用於縮小光檢測區域的光學系統的變更和調整，另外裝置的結構有可能變得複雜。但是，關於該點，本發明的發明人發現:在光強度數據中提高用於判別與發光粒子對應的光強度增大的閾值時，能夠減小「表觀的光檢測區域」，能夠得到與實際減小光檢測區域的大小大致同等的作用效果。一般，在實施掃描分子計數法的光分析裝置中，從單個發光粒子釋放併到達光檢測器的光的強度因發光粒子在光檢測區域中的位置而不同，典型的是在發光粒子的位置位於光檢測區域的大致中心區域時，光強度最大(以下將光檢測區域內的發光粒子的光強度最大的位置稱為「最大強度點」)，隨著發光粒子的位置趨於接近光檢測區域的周緣，光強度逐漸降低。即，從光檢測區域內的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布具有強度從最大強度點向周緣降低的大致吊鐘狀的曲線，光檢測區域移動過程中的發光粒子的通過路徑越是接近光檢測區域的最大強度點，則對應的光的信號的強度越高。因而，與某個閾值以上的強度的光的信號對應的發光粒子的通過路徑位於包含光檢測區域內的最大強度點的比光檢測區域狹小的區域內，通過該比光檢測區域狹小的區域以外的發光粒子的光的強度低於上述閾值。而且，越是增大在光強度數據上用於判別表示與發光粒子對應的光的信號的閾值，則與所選擇的信號對應的發光粒子的通過位置越是限定在更狹小的區域內。換言之，通過增大或變更用於判別發光粒子的信號的閾值，能夠進行「表觀的光檢測區域(即檢測發光粒子的區域、或產生被檢測為發光粒子的信號的信號的發光粒子通過的區域)」的縮小或調節(參照下述(注))。根據本發明人發現的見解，只要對測量數據的分析處理的校正，即使在樣本溶液中的發光粒子的濃度高時，也能夠劃定使暫時包含的發光粒子的個數實質上始終為一個以下的區域，能夠個別檢測通過該區域內的單個發光粒子，能夠高精度地獲取發光粒子的個數、濃度、個數密度等信息。(注)能夠認為發光粒子在樣本溶液中三維地均等分散，因此在移動中的光檢測區域內包含兩個以上的發光粒子時，發光粒子的信號的峰值點(信號強度的極大點)重疊的情況非常稀少，在大多數情況下，各個信號的峰值點相互錯開，因此，重疊的信號的最大值並不比一個發光粒子的信號的峰值強度大。另外，通過表觀的光檢測區域以外的發光粒子越是遠離表觀的光檢測區域，則其個數越多，但光的強度比通過表觀的光檢測區域內的發光粒子低。因而，能夠認為即使通過與某個閾值對應的表觀的光檢測區域外的兩個以上的發光粒子的光重疊，該光的信號的強度的最大值在大多數情況下低於閾值，不被檢測為發光粒子的信號，檢測為發光粒子的信號的信號在大多數情況下是通過了表觀的光檢測區域中的發光粒子的信號。這樣，本發明的一個課題是提供一種新的方法，其用於利用上述的見解避免在掃描分子計數法中由於在光檢測區域內暫時包含多個發光粒子導致發光粒子的檢測個數的精度惡化。另外，本發明的另一個課題是利用上述的見解，在掃描分子計數法中，在樣本溶液中的發光粒子的濃度高的情況下，避免發光粒子的檢測個數的精度惡化，擴大能夠良好地計量發光粒子的檢測個數的發光粒子的濃度範圍。用於解決問題的方案根據本發明，通過以下的方法達成上述的課題，該方法是一種光分析方法，其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，其特徵在於，包括如下步驟:通過變更顯微鏡的光學系統的光路使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動；一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動，一邊測量來自光檢測區域的光的強度，來生成光強度數據；在光強度數據上個別檢測表示發光粒子的光的信號，其中，在個別檢測表示發光粒子的光的信號的步驟中，選擇性地檢測具有超過閾值的強度的信號作為表示發光粒子的光的信號，設定上述閾值使得選擇性地檢測表示來自包含在光檢測區域內的比該光檢測區域狹小的區域中的發光粒子的光的信號。在該結構中，「在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子」是指在樣本溶液中分散或溶解的原子、分子或它們的聚合體等發出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中進行布朗運動的粒子，就可以是任意的粒子。該發光粒子典型的是螢光性粒子，但也可以是通過磷光、化學發光、生物發光、光散射等來發出光的粒子。共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統的「光檢測區域」是指在這些顯微鏡中檢測光的微小區域，在從物鏡提供照明光的情況下，相當於該照明光會聚的區域(在共焦顯微鏡中，特別地根據物鏡和針孔之間的位置關係來確定。在發光粒子沒有照明光而發光的情況下，例如通過化學發光或生物發光來發光的粒子的情況下，在顯微鏡中不需要照明光)。另外，在本說明書中，在「信號」這樣的情況下，只要沒有特別限定，是指表示來自發光粒子的光的信號。從上述可知，在作為本發明的基本結構的掃描分子計數法中，首先一邊使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動，即一邊通過光檢測區域掃描樣本溶液內，一邊依次進行光的檢測。這樣，在移動的光檢測區域包含了隨機運動的發光粒子時，檢測來自發光粒子的光，由此，期待檢測出一個發光粒子的存在。因此，在依次檢測出的光中個別檢測來自發光粒子的光的信號，由此依次個別檢測每一個粒子的存在，獲取與粒子在溶液內的狀態有關的各種信息。這時，在本發明中，基於以上所述的見解，即發光粒子的信號的強度因該發光粒子通過光檢測區域的通過位置而不同這樣的見解，設定閾值使得選擇性地檢測表示來自包含在光檢測區域內的比該光檢測區域狹小的區域中的發光粒子的光的信號。根據該結構，通過任意地變更閾值的設定，能夠調整「表觀的光檢測區域」的大小，能夠選擇性地檢測通過光檢測區域內的任意特定區域的發光粒子的存在。另外，如已經說明的那樣，典型的是，從光檢測區域內的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布是從發光粒子釋放而被檢測出的光的強度從光檢測區域內的最大強度點向光檢測區域的周緣降低的分布，即發光粒子的位置從最大強度點越是接近光檢測區域的周緣則光強度越是降低的分布(特別在發光粒子是被照射激勵光而釋放光的粒子、根據激勵光的會聚區域劃定光檢測區域的情況下，從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布與光檢測區域內的激勵光的強度分布一致)。因而，越是增大閾值，則能夠將「表觀的光檢測區域」鎖定成(包含最大強度點的)越狹小的區域。另外，優選的是在掃描分子計數法中，典型的是通過個別檢測單個發光粒子的信號來得到發光粒子的個數、濃度等信息，因此，上述本發明的結構中，優選設定閾值使得暫時包含在比光檢測區域狹小的區域(表觀的光檢測區域)中的發光粒子的個數實質上為一個以下。關於該點，例如可以基於理論上依設計估計出的光檢測區域的大小確定閾值，使得暫時包含在表觀的光檢測區域中的發光粒子的個數為一個以下，但通常難以高精度地確定光檢測區域的大小的理論值，因此可以通過多次反覆進行試行實驗，來確定給出暫時包含的發光粒子的個數為一個以下的表觀的光檢測區域的閾值。此外，從後文所示的實施例可知，即使不將閾值設定成使暫時包含在表觀的光檢測區域中的發光粒子的個數為一個以下，也能夠獲取發光粒子的個數、濃度等信息。在本發明中，重要的是應該理解到能夠通過適當地設定閾值來適當地設定表觀的光檢測區域的大小這一點。在上述的本發明的實施方式之一中，可以對選擇性地檢測出的信號的個數進行計數，來對包含在比光檢測區域狹小的區域(表觀的光檢測區域)中的發光粒子的個數進行計數(粒子的計數)。在該情況下，能夠通過將檢測出的發光粒子的個數和光檢測區域的位置的移動量相組合，得到與樣本溶液中的鑑定出的發光粒子的個數密度或濃度有關的信息。具體地說，例如可以計算多個樣本溶液的個數密度或濃度的比、或者相對於作為濃度或個數密度的基準的標準樣本溶液的相對的個數密度或濃度的比，或者使用相對於作為濃度或個數密度的基準的標準樣本溶液的相對的個數密度或濃度的比確定絕對的個數密度值或濃度值。或者，只要通過任意的方法、例如以規定的速度移動光檢測區域的位置等確定出光檢測區域的位置的移動軌跡的全部體積和/或表觀的光檢測區域的全部體積，就能夠具體地估算出發光粒子的個數密度或濃度。另外，作為本發明的另一個方式，也能夠基於從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布，根據通過粒子的計數確定出的發光粒子的個數，計算在設定了與進行該粒子的計數時的閾值不同的其它閾值的情況下應該檢測出的發光粒子的個數。如後文的具體實施方式
部分所記載的那樣，能夠根據通過粒子的計數確定出的發光粒子的個數近似地確定從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布。而且，當確定了從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布時，能夠預測與任意的閾值對應的表觀的光檢測區域的大小。能夠認為通過表觀的光檢測區域內的發光粒子的個數與該表觀的光檢測區域的大小成比例，因此根據與進行粒子的計數時的閾值對應的表觀的光檢測區域的大小和與其它閾值對應的表觀的光檢測區域的大小之比，計算出在設定了其它閾值時應該檢測出的發光粒子的個數。當得到了在設定了與進行該粒子的計數時的閾值不同的其它閾值的情況下應該檢測出的發光粒子的個數時，容易比較使用互不相同的閾值檢測出的粒子的個數，在得到與發光粒子的個數密度或濃度等有關的信息時有利。此外，可以使用在設定了與進行粒子的計數時的閾值不同的其它閾值的情況下應該檢測出的發光粒子的個數，確定發光粒子的個數密度或濃度。進一步地，作為本發明的再一個方式，也可以在設定閾值使得暫時包含在比光檢測區域狹小的區域中的發光粒子的個數實質上為一個以下的情況下，檢測選擇性地檢測出的表示來自發光粒子的光的信號的個數為規定個數的閾值，根據檢測出的閾值的大小確定發光粒子的個數密度或濃度。如後文的具體實施方式
部分所記載的那樣，根據選擇性地檢測出的信號個數和表觀的光檢測區域的大小而給出發光粒子的個數密度或濃度，其中，信號個數和表觀的光檢測區域的大小都是閾值的函數(閾值越高，則信號個數和表觀的光檢測區域的大小均越降低)，能夠通過從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布的參數來表示表觀的光檢測區域的大小。因而，能夠通過閾值、從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布的參數以及選擇性地檢測出的信號個數，來表示發光粒子的個數密度或濃度，只要檢測出給出某個選擇性地檢測出的信號個數的閾值，就能夠確定發光粒子的個數密度或濃度。實際上，根據後文記載的實驗例，可知能夠根據給出某個選擇性地檢測出的信號個數的閾值來確定發光粒子的個數密度或濃度。該方式能夠在掃描分子計數法中有利於檢測任意的樣本溶液中的發光粒子的個數密度或濃度地進行使用。關於上述的本發明的結構中的使光檢測區域的位置移動的步驟，可以根據發光粒子的特性或樣本溶液中的個數密度或濃度，適當地變更樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動速度。從發光粒子檢測出的光的形態能夠根據其特性或樣本溶液中的個數密度或濃度而變化。特別當光檢測區域的移動速度變快時，從一個發光粒子所能得到的光量降低，因此優選的是適當地變更光檢測區域的移動速度，使得能夠高精度或高靈敏度地計量來自一個發光粒子的光。進一步地，關於上述的使光檢測區域的位置移動的步驟，優選的是將樣本溶液內的光檢測區域的位置的移動速度設定得比發光粒子的擴散移動速度(由布朗運動造成的粒子的平均移動速度)高。如上述說明的那樣，在本發明的方法中，光檢測區域檢測從一個發光粒子發出的光，來個別檢測發光粒子。但是，發光粒子由於在溶液中進行布朗運動而隨機地移動，在多次出入光檢測區域的情況下，有可能從一個發光粒子多次檢測(表示其存在的)信號，難以使檢測出的信號與一個發光粒子的存在對應起來。因此，如上所述，將光檢測區域的移動速度設定得比發光粒子的擴散移動速度高，由此能夠使一個發光粒子與一個信號相對應。此外，擴散移動速度因發光粒子的不同而變化，因此如上所述，優選的是根據發光粒子的特性(特別是擴散係數)適當地變更光檢測區域的移動速度。可以以任意的方式進行光學系統的光路的變更以移動光檢測區域的位置。例如可以使用在雷射掃描型光學顯微鏡中採用的檢電鏡變更光路，來變更光檢測區域的位置。可以任意地設定光檢測區域的位置的移動軌跡，例如可以從圓形、橢圓形、矩形、直線以及曲線中選擇。此外，在本發明中，構成為變更光學系統的光路使光檢測區域的位置移動，由此光檢測區域的移動迅速，並且在樣本溶液中實質上不發生機械振動、流體力學的作用，因此樣本溶液中的發光粒子不會受到力學作用的影響，能夠在(沒有偽像的狀態且)穩定的狀態下進行光的計量(例如在使樣本發生流動的情況下，難以始終賦以一樣的流速，並且裝置結構複雜，另外所需要的樣本量大幅增加，並且由於流動所造成的流體力學的作用而溶液中的發光粒子或其它物質有可能變質或變性)。另外，不需要構成為使樣本溶液流通，因此能夠與FCS、FIDA等的情況同樣地在微量(IuL 幾十y L左右)的樣本溶液中進行計量和分析。應該理解為:本發明的方法典型地用於分析或解析蛋白質、肽、核酸、脂質、糖鏈、胺基酸或它們的聚合體等生物體分子、病毒、細胞等粒子狀的生物學對象物在溶液中的狀態，但也可以用於分析或解析非生物學的粒子(例如原子、分子、膠束(micelles)、金屬膠體等)在溶液中的狀態，這樣的情況也屬於本發明的範圍。發明效果總之，在本發明的方法中，在掃描分子計數法中，發光粒子的信號的強度因該發光粒子在光檢測區域內的通過位置而不同，因此著眼於能夠通過變更用於判別發光粒子的信號的閾值的設定來調整「表觀的光檢測區域」的大小這一點，嘗試通過適當地設定閾值，由此劃定「表觀的光檢測區域」(光檢測區域內的比該光檢測區域狹小的區域)，選擇性地檢測表示來自包含在該「表觀的光檢測區域」中的發光粒子的光的信號。根據本發明的結構，在發光粒子的信號檢測中所參照的區域(表觀的光檢測區域)與實際的光檢測區域相比相對狹小，因此包含在該區域內的發光粒子的個數為兩個以上的可能性比實際的光檢測區域內的發光粒子的個數為兩個以上的可能性低，因此能夠更準確地計量單個發光粒子的個數，獲取與發光粒子的濃度或個數密度等有關的信息。因而，即使在樣本溶液中的發光粒子的濃度比較高、從而實際的光檢測區域內的發光粒子的個數為兩個以上的可能性變高的情況下，也能夠通過適當地設定閾值來實現在發光粒子的信號檢測中所參照的區域內暫時包含的發光粒子的個數為一個以下的狀態，因此，能夠個別檢測單個發光粒子，對其個數進行計數，或者獲取與濃度或個數密度等有關的信息。換言之，根據本發明，能夠使可高精度地應用掃描分子計數法的發光粒子的濃度範圍或個數密度範圍擴大到高濃度或高密度側。這樣，根據本發明的方法，期待擴大能夠利用掃描分子計數法的樣本溶液的範圍，擴大分子間相互作用的觀測和分析等掃描分子計數法的應用範圍。通過以下的本發明的優選實施方式的說明，能夠了解本發明的其它目的和優點。


圖1的(A)是執行本發明的方法的光分析裝置的內部構造的示意圖。圖1的(B)是共焦區組織(共焦顯微鏡的觀察區域)的示意圖。圖1的(C)是變更反射鏡7的朝向使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動的機構的示意圖。圖2的(A)、⑶分別是說明應用本發明的方法的掃描分子計數法中的光檢測的原理的示意圖和所計量的光強度的時間變化的示意圖。圖3是說明依照本發明的方法通過適當地設定用於判別發光粒子的信號的閾值來設定表觀的光檢測區域的原理的圖。(A)是從顯微鏡的光的行進方向觀察到的光檢測區域的截面的示意圖，示意性地示出在光檢測區域CV內暫時包含兩個以上的發光粒子的狀態。(B)是在(A)的情況下計量的時序的光強度數據的例子的示意圖。(C)是說明從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布、閾值以及表觀的光檢測區域之間的關係的圖。左上是從光檢測區域內的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布，右下是光檢測區域CV、表觀的光檢測區域qCVl、qCV2的示意立體圖，左下是從光檢測區域的移動方向觀察到的光檢測區域CV、表觀的光檢測區域qCVl、qCV2的示意截面圖。圖4是以流程圖的形式表示依照本發明的方法執行的掃描分子計數法的處理步驟的圖。圖5的(A)、(B)分別是表示在發光粒子一邊進行布朗運動一邊橫穿光檢測區域時、和在由於以比發光粒子的擴散移動速度快的速度使樣本溶液內的光檢測區域的位置移動而發光粒子橫穿光檢測區域時的粒子的運動的方式的模型圖。圖5的(C)是說明用於依照掃描分子計數法根據所計量的時序光強度數據(光子計數的時間變化)檢測發光粒子的存在的處理步驟中的檢測信號的信號處理過程的例子的圖。圖6示出所計量的光子計數數據的實測例子(直方圖表)、對數據進行平滑處理而得到的曲線(虛線)以及在脈衝存在區域中擬合的高斯函數(實線)。在圖中，附加為「噪聲」的信號作為由噪聲或異物造成的信號而被忽略。圖7是通過依照本發 明的方法執行的掃描分子計數法(實施例1)針對包含各種濃度的發光粒子的樣本溶液計量出的被檢測為發光粒子的信號的脈衝數的圖表。(A)、(B)分別是針對發光粒子的濃度繪製在檢測發光粒子的信號時設定為閾值=0.5(pC/10i!S)(在10 ys期間檢測出的光子個數)以及閾值=2.0 (pc/10 ys)的情況下的脈衝數所得到的圖，(C)是針對發光粒子的濃度繪製各種閾值下的脈衝數所得到的圖(橫軸和縱軸是對數)。圖8的(A)是根據閾值與發光粒子的信號數之間的關係得到的從光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布，圖8的(B)是針對發光粒子的濃度繪製根據圖8的(A)的光的強度分布將設定高的閾值所得到的發光粒子的脈衝數換算為設定低的閾值時應該得到的脈衝數的情況下的脈衝數所得到的圖。圖9是針對發光粒子的濃度繪製脈衝數為20時的閾值所得到的圖。圖中，黑點是閾值，實線是針對閾值的擬合曲線。圖10是在現有的計算螢光強度的波動的光分析技術中得到的光子計數(光強度)的時間變化的例子，(A)是樣本內的粒子的濃度為能夠提供足夠的計量精度的程度的情況，(B)是樣本內的粒子的濃度相比於(A)的情況大幅降低的情況。附圖標記說明1:光分析裝置(共焦顯微鏡)；2:光源；3:單模光纖；4:準直透鏡；5、14a:分色鏡；6、7、11:反射鏡；8:物鏡；9:微板；10:皿(樣本溶液容器)；12:聚光鏡；13:針孔；14:屏蔽濾波器；15:多模光纖；16:光檢測器；17:反射鏡偏轉器；17a:臺位置變更裝置；18:計算機。
具體實施例方式以下，詳細說明本發明的優選實施方式。光分析裝置的結構本發明的方法能夠通過如下的光分析裝置來實現:在基本結構中，如圖1的(A)示意性地示例那樣，由能夠執行FCS、FIDA等的共焦顯微鏡的光學系統和光檢測器組合而成。參照圖1的(A)，光分析裝置I由光學系統2 17以及用於控制光學系統的各部的動作並且獲取並解析數據的計算機18構成。光分析裝置I的光學系統可以與普通的共焦顯微鏡的光學系統相同，在此，使從光源2發射並在單模光纖3內傳播的雷射(Ex)在光纖的出射端成為以由固有的NA決定的角度發散的光而被發射，通過準直器4成為平行光，被分色鏡5、反射鏡6、7反射，入射到物鏡8。典型的是在物鏡8的上方配置有微板9，該微板9排列有注入了 I U L 幾十U L的樣本溶液的樣本容器或皿10，從物鏡8射出的雷射在該樣本容器或皿10內的樣本溶液中形成焦點，形成光強度強的區域(激勵區域)。在樣本溶液中分散或溶解有作為觀測對象物的發光粒子，典型的是附加有螢光色素等發光標識的分子，當發光粒子進入到激勵區域時，在其間激勵發光粒子而釋放出光。所釋放的光(Em)通過物鏡
8、分色鏡5，被反射鏡11反射而在聚光鏡12聚光，通過針孔13。此外，如本領域技術人員所了解的那樣，針孔13配置在與物鏡8的焦點位置共軛的位置，由此僅從如圖1的⑶示意性地表示的雷射的焦點區域、即激勵區域內發出的光通過針孔13，遮斷來自焦點面以外的光。圖1的(B)所例示的雷射的焦點區域通常是具有IfL IOfL左右的有效體積的本光分析裝置中的光檢測區域，被稱為共焦區組織。在共焦區組織中，典型的是光強度以區域中心為頂點的高斯型分布或洛侖茲型分布，其有效體積是將光強度為1/e2的面作為邊界的大致橢圓球體的體積。這樣，通過了針孔13的光經過分色鏡14a，透過屏蔽濾波器14(在此只選擇特定波長頻帶的光成分)，被導入到多模光纖15，到達對應的光檢測器16，在被轉換成時序的電信號後，輸入到計算機18，以後面說明的方式進行用於光分析的處理。作為光檢測器16，優選的是使用能夠在光子計數中使用的超高靈敏度的光檢測器，由此，能夠檢測來自一個發光粒子的光、例如來自一個或多個螢光色素分子的微弱光。另外，在上述的光分析裝置的光學系統中，還設置有用於變更光學系統的光路來通過光檢測區域掃描樣本溶液內、即使焦點區域(即光檢測區域)的位置在樣本溶液內移動的機構。作為該用於使光檢測區域的位置移動的機構，例如如圖1的(C)示意性地例示的那樣，可以採用變更反射鏡7的朝向的反射鏡偏轉器17。該反射鏡偏轉器17可以與在通常的雷射掃描型顯微鏡中裝備的檢電鏡裝置相同。另外，為了實現所希望的光檢測區域的位置的移動圖案，在計算機18的控制下與光檢測器16所進行的光檢測協調地驅動反射鏡偏轉器17。可以從圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合中任意地選擇光檢測區域的位置的移動軌跡(可以使得在計算機18中的程序中能夠選擇各種移動圖案)。此外，雖然沒有圖示，但也可以通過使物鏡8上下移動來使光檢測區域的位置在上下方向上移動。如上所述，根據不是移動樣本溶液而是變更光學系統的光路使光檢測區域的位置移動的結構，在樣本溶液內不會實質地產生機械振動、流體力學作用，能夠排除力學作用對觀測對象物的影響，實現穩定的計量。此外，作為追加的結構，也可以在顯微鏡的臺(未圖示)設置用於移動微板9的水平方向位置的臺位置變更裝置17a，以變更所觀察的皿10。可以由計算機18控制臺位置變更裝置17a的動作。在發光粒子通過多光子吸收而發光的情況下，上述光學系統被用作多光子顯微鏡。在該情況下，只在激勵光的焦點區域(光檢測區域)釋放光，因此可以去除針孔13。在發光粒子通過磷光或散射而發光的情況下，能夠直接使用上述的共焦顯微鏡的光學系統。另外，在發光粒子通過化學發光、生物發光現象而與激勵光無關地發光的情況下，可以省略用於生成激勵光的光學系統2 5。進一步地，可以在光分析裝置I中如圖示那樣設置多個激勵光源2，可以使得能夠根據激勵發光粒子的光的波長而適當地選擇激勵光的波長。同樣地，也可以具備多個光檢測器16，在樣本中包含波長不同的多種發光粒子的情況下，可以使得能夠根據波長分別檢測來自這些發光粒子的光。本發明的方法的原理如發明內容所記載的那樣，本發明的方法如果清楚地進行描述，則如上所述，在共焦顯微鏡(或多光子顯微鏡)進行光檢測時，發光粒子的信號的強度因該發光粒子在光檢測區域內的位置而不同，基於通過設定用於判別發光粒子的信號的閾值來使「表觀的光檢測區域」的大小變化這樣的原理，在掃描分子計數法中，通過適當地設定閾值來調整「表觀的光檢測區域」的大小。而且，優選的是，設定用於判別發光粒子的信號的閾值，使得暫時包含在「表觀的光檢測區域」內的發光粒子的個數為一個以下，即使得被檢測為發光粒子信號的信號各自與單個發光粒子對應，或者使得可靠地個別檢測單個發光粒子，在該狀態下對通過光檢測區域掃描樣本溶液內的期間的發光粒子的個數進行計數，試著以更高精度獲取發光粒子的濃度或個數密度等信息。以下，說明掃描分子計數法和本發明的方法的原理。1.掃描分子計數法的原理FCS、FIDA等分光分析技術與現有的生物化學的分析技術相比，其優點在於所需要的樣本量極少且能夠迅速地執行檢查。但是，在FCS、FIDA等分光分析技術中，在原理上，根據螢光強度的波動來計算發光粒子的濃度、特性，因此為了得到高精度的測量結果，要求如圖10的(A)示意性地描繪的那樣樣本溶液中的發光粒子的濃度或個數密度在計量螢光強度的過程中始終是在光檢測區域CV內存在一個左右的發光粒子的水平，如該圖的右側所示那樣在計量時間中始終檢測到有意義的光強度(光子計數)。在發光粒子的濃度或個數密度更低的情況下，例如如圖10的(B)所描繪的那樣，在發光粒子只是偶爾進入到光檢測區域CV內的水平的情況下，如該圖的右側所示例的那樣，只在計量時間的一部分內出現有意義的光強度的信號(光子計數)，難以高精度地計算出光強度的波動。另外，在與計量中始終是在光檢測區域內存在一個左右的發光粒子的水平相比發光粒子的濃度大幅降低的情況下，在光強度的波動的運算中，容易受到背景的影響，為了得到足夠進行運算的量的有意義的光強度數據而計量時間變長。因此，本申請的申請人在日本特願2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基於以下的新原理的「掃描分子計數法」:即使在發光粒子的濃度低於如上所述的在FCS、FIDA等分光分析技術中要求的水平的情況下，也能夠檢測發光粒子的個數密度或濃度等特性。
作為在掃描分子計數法中執行的處理，如果清楚地描述，則驅動用於使光檢測區域的位置移動的機構(反射鏡偏轉器17)來變更光路，如在圖2中示意性地描繪的那樣，一邊使光檢測區域CV的位置在樣本溶液內移動，即一邊通過光檢測區域CV掃描樣本溶液內，一邊執行光檢測。這樣，例如如圖2的(A)那樣，在光檢測區域CV移動的期間(圖中為時間t0 t2)，在通過存在一個發光粒子的區域時(tl)，從發光粒子釋放出光，如在圖2的(B)中所描繪的那樣，在時序的光強度數據上出現有意義的光強度(Em)的脈衝狀的信號。這樣，執行上述的光檢測區域CV的位置的移動和光檢測，檢測其間出現的每一個如圖2的⑶所示例的脈衝狀的信號(有意義的光強度)，由此個別檢測發光粒子，對其個數進行計數，由此能夠獲取與存在於所計量的區域內的發光粒子的個數、濃度或個數密度有關的信息。在該掃描分子計數法的原理中，不進行如螢光強度的波動的計算那樣的統計性的運算處理，而是檢測每一個發光粒子，因此即使在應該觀測的粒子的濃度低至無法通過FCS、FIDA等以足夠的精度進行分析的程度的樣本溶液中，也能夠獲取與粒子的濃度或個數密度有關的彳目息。2.本發明的「表觀的光檢測區域」的大小的調節的原理在上述的掃描分子計數法中，在樣本溶液中的發光粒子的個數密度高的情況下，在光檢測區域內暫時包含兩個以上的發光粒子的可能性變高。例如，如圖3的(A)示意性地描繪的那樣，在光檢測區域CV的移動過程中發光粒子a溜出光檢測區域之前，發光粒子^進入光檢測區域內時，如圖3的(B)的右方所示那樣，在時序光強度數據上，發光粒子a的信號與發光粒子P的信號一部分相互重疊。在該情況下，發光粒子a、^的信號的曲線如在圖中用虛線所示的那樣，成為難以分別檢測這兩個發光粒子的信號的形狀，有時將該相互重疊的兩個以上的發光粒子的信號檢測為一個發光粒子的信號。實際上，可知在樣本溶液中的發光粒子的個數密度高的情況下，典型的是在高到約InM程度時，通過掃描分子計數法檢測為發光粒子的光的信號個數大幅地少於根據實際的濃度所預期的個數，能夠認為該信號個數的降低是由於將相互重疊的兩個以上的發光粒子的信號作為一個發光粒子的信號來進行計數。作為排除如上所述的相互重疊的兩個以上的發光粒子的信號而個別檢測各單個發光粒子來生成時序光強度數據的一個方法，能夠考慮如在圖3的(A)中用虛線所描繪的那樣，縮小光檢 測區域，實現在光檢測區域內暫時包含的發光粒子個數實質上始終為一個以下的狀態。但是，光檢測區域的縮小存在原理上的局限(無法將區域的大小縮小到光的波長以下)，另外裝置的結構變得複雜，因此實際上縮小光檢測區域是極其困難的。但是，根據本發明，只要對根據時序光強度數據檢測發光粒子的光的信號時的信號處理進行校正，就能夠如在圖3的(A)中用虛線描繪的那樣，選擇性地檢測通過光檢測區域內的比該光檢測區域狹小的區域的發光粒子的光的信號，將相互重疊的兩個以上的發光粒子的信號檢測為一個發光粒子的信號的可能性大幅降低。在光檢測區域中，從通過光檢測區域的發光粒子釋放併到達光檢測器的光的強度因發光粒子在光檢測區域中的位置而不同，例如，在發光粒子是被照射照明光而發光的粒子的情況下，照明光在光檢測區域內的光的強度典型的是在光檢測區域(聚光區域)的大致中心處最大，從該最大強度點向大致放射方向降低。因而，發光粒子的光強度在發光粒子橫穿光檢測區域的大致中心時為最大，隨著發光粒子的位置趨於接近光檢測區域的周緣，光強度逐漸降低。即，從光檢測區域內的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度的分布如圖3的(C)的左上所示例的那樣，呈吊鐘狀的分布，例如如圖3的(A)所描繪的那樣，通過在圖中用虛線描繪的區域的發光粒子Y的光強度比通過用虛線描繪的區域以外的發光粒子
a、^的光強度高(參照圖3的(B))。這樣，在清楚地描述時，如果參照發光粒子的信號的強度，則能夠大致確定發光粒子在光檢測區域內的通過範圍。而且，在根據時序光強度數據檢測發光粒子的信號時，設定閾值，如果只將具有超過該閾值的強度的信號檢測為有意義的信號，則能夠只「挑出」與通過了給出該閾值以上的光強度的區域的發光粒子對應的信號。另外，在如圖3的(C)的左上那樣按照IthO — Ithl — Ith2的順序提高閾值的情況下，挑出的發光粒子所通過的區域如圖3的(C)的左下和右下的截面圖和立體圖所描繪的那樣，按照CV — qCVl — qQV2的順序縮小。換言之，在時序光強度數據的信號的分析處理中，通過設定某個閾值(例如Ithl、Ith2)，來劃定檢測單個發光粒子的區域、即「表觀的光檢測區域」(例如qCVl、qCV2)，能夠選擇性地只檢測通過該表觀的光檢測區域內的發光粒子的信號。此外，如上所述，在根據信號的強度的高低來選擇發光粒子的信號的情況下，在兩個以上的發光粒子同時進入到光檢測區域且這些發光粒子的信號的峰值(最大值)的時間幾乎沒有錯開時，無論這些發光粒子是否正在通過表觀的光檢測區域，這些發光粒子的信號都可能不相互區別地被檢測為一個發光粒子的信號。但是，發光粒子在樣本溶液中三維地分散，因此兩個發光粒子同時進入光檢測區域的情況(限於發光粒子的個數密度相當低)是稀少的，另外，光檢測區域內的發光粒子的所檢測出的光的強度分布是吊鐘狀的分布，發光粒子的位置越是接近光檢測區域的周緣，則發光粒子的強度越是降低，因此即使假設兩個發光粒子大致同時進入光檢測區域而它們的信號所重疊的信號的強度的最大值增大，在大多數情況下，能夠認為比位於光檢測區域的中心附近的單個發光粒子的光的強度低(越是高光強度， 則發光粒子個數越少，因此高光強度的發光粒子重疊的概率大幅地少於低光強度的發光粒子重疊的概率)。因而，如上所述，通過適當地設定閾值，來實質上排除被檢測為一個發光粒子的信號的相互重疊的兩個以上的發光粒子的信號。

在上述的本發明的適當地設定閾值來調節表觀的光檢測區域的大小的結構中，根據以下的關係式使閾值和表觀的光檢測區域的大小關聯起來。即，如圖3的(C)的左上所示例的那樣，在能夠用高斯函數來近似從光檢測區域內的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度的分布的情況下，使用光強度分布的最大值Imax(Imax相當於單個發光粒子的最大光強度)、分布的半峰半寬《、強度的背景Ibg以及表觀的光檢測區域的截面半徑(離最大強度點的距離)r，通過下式來表示閾值Ith。[式I]
權利要求
1.一種光分析方法，其使用共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統檢測來自在樣本溶液中分散且隨機運動的發光粒子的光，其特徵在於，包括如下步驟: 通過變更上述光學系統的光路使上述光學系統的光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動； 一邊使上述光檢測區域的位置在上述樣本溶液內移動一邊測量來自上述光檢測區域的光的強度，來生成光強度數據； 在上述光強度數據上個別檢測表示發光粒子的光的信號， 其中，在上述個別檢測表示發光粒子的光的信號的步驟中，選擇性地檢測具有超過閾值的強度的信號作為上述表示發光粒子的光的信號，設定上述閾值使得選擇性地檢測表示來自包含在上述光檢測區域內的比該光檢測區域狹小的區域中的發光粒子的光的信號。
2.根據權利要求1所述的光分析方法，其特徵在於， 從上述光檢測區域內的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布是從上述發光粒子釋放而被檢測出的光的強度從上述光檢測區域內的最大強度點向上述光檢測區域的周緣降低的分布。
3.根據權利要求1所述的光分析方法，其特徵在於， 設定上述閾值使得暫時包含在比上述光檢測區域狹小的上述區域中的發光粒子的個數實質上為一個以下。
4.根據權利要求3所述的光分析方法，其特徵在於，還包括如下步驟: 對選擇性地檢測出的上述信號的個數進行計數，來確定包含在比上述光檢測區域狹小的上述區域中的發光粒子的個數。
5.根據權利要求4所述的光分析方法，其特徵在於，還包括如下步驟: 根據所確定的上述發光粒子的個數確定該發光粒子的個數密度或濃度。
6.根據權利要求4所述的光分析方法，其特徵在於， 基於從上述光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布，根據所確定的上述發光粒子的個數計算在設定了與上述閾值不同的其它閾值的情況下應該檢測出的上述發光粒子的個數。
7.根據權利要求6所述的光分析方法，其特徵在於，還包括如下步驟: 根據計算出的上述發光粒子的個數確定該發光粒子的個數密度或濃度。
8.根據權利要求3所述的光分析方法，其特徵在於， 確定使選擇性地檢測出的表示來自發光粒子的光的上述信號的個數為規定個數的閾值，根據上述閾值的大小確定上述發光粒子的個數密度或濃度。
9.根據權利要求1所述的光分析方法，其特徵在於， 上述發光粒子是通過被照射激勵光而釋放光的粒子，從上述光檢測區域中的發光粒子釋放而被檢測出的光的強度分布與上述光檢測區域內的上述激勵光的強度分布一致。
10.根據權利要求1 9中的任意一項所述的光分析方法,其特徵在於， 上述光檢測區域的位置以比上述樣本溶液中的發光粒子的擴散移動速度快的速度移動。
全文摘要
提供如下一種方法在使用了共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光測量的掃描分子計數法中，避免由於多個發光粒子暫時包含在光檢測區域內而發光粒子的檢測個數的精度惡化。在本發明的光分析技術中，在一邊通過變更共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學系統的光路使光檢測區域的位置在樣本溶液內移動一邊在測量光的強度而生成的光強度數據中，在以選擇性地將具有超過閾值的強度的信號檢測為表示發光粒子的光的信號的方式個別檢測表示發光粒子的光的信號時，設定閾值使得選擇性地檢測表示來自包含在光檢測區域內的比該光檢測區域狹小的區域中的發光粒子的光的信號。
文檔編號G01N21/64GK103119421SQ20118004554
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月16日 優先權日2010年9月21日
發明者田邊哲也 申請人:奧林巴斯株式會社