一種抗流感病毒廣譜中和性的中和分子1f2的製作方法

2023-09-19 05:12:10

一種抗流感病毒廣譜中和性的中和分子1f2的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗流感病毒廣譜中和性的中和分子1F2，能夠中和多種亞型流感病毒。本發明的抗體的功能由其輕鏈和重鏈可變區基因特異性基因序列決定，能夠結合具有天然構象的流感病毒血凝素蛋白(HA)的HA2亞基，能夠阻止多種亞型流感病毒侵染易感細胞。利用本發明的抗體可變區基因或互補決定區(CDR)基因，可在利用原核和真核細胞的任何表達系統中改造和生產不同形式的基因工程抗體。
【專利說明】—種抗流感病毒廣譜中和性的中和分子1F2
【技術領域】
[0001]本發明提供一株能夠中和多種亞型流感病毒的全人單克隆抗體1F2，具有臨床上預防或治療多種流感病毒感染的潛力。
【背景技術】
[0002]自2009年4月起，甲型HlNl流感(A/H1N)疫情在世界範圍內爆發。這一疫情從北美迅速傳播擴散到5大洲200多個國家和地區。據世界衛生組織報導，截止2010年4月9日，甲型A/H1N1流感疫情已在超過213個國家爆發，全球甲型HlNl流感死亡病例已超過
1.77萬例。在我國，據中國疾病預防控制中心報導，截至2010年3月31日，全國31個省份累計報告甲型HlNl流感確診病例12.7萬餘人，已治癒12.2萬，死亡800例。
[0003]流感病毒屬於正粘病毒科，有包膜，呈球型、橢圓型或絲狀，病毒包膜來自宿主細胞的雙層類脂膜。流感病毒屬單鏈的RNA病毒。根據核蛋白(NP)和細胞質蛋白(Ml)的差異，流感病毒可分為A、B、C(甲、乙、丙)三種亞型。對A型流感病毒，根據血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)表面糖蛋白抗原性的不同，又可進一步分為不同的亞型。目前，A型流感病毒有16種HA亞型(H1-H16)和9種NA亞型(N1-N9)。
[0004]A型流感病毒的基因組由8個單獨的單鏈RNA片段組成(見圖1)，每個RNA片段編碼一至兩個蛋白。因此A型流感病毒共有8個基因，編碼10種蛋白。其中，HA蛋白對於結合細胞表面受體和病毒與細胞的膜融合起重要作用，在感染細胞前，HA會水解成HAl和HA2,其中位於HAl上的受體結合區(receptor binding domain, RBD)的附近區域,在不同流感病毒株中高度變異(RBD本身比較保守)，是重要的中和性表位所在區域，目前發現的多種中和性抗體所針對的表位大多位於HAl蛋白的RBD附近區域。但是這些抗體大多不具備中和不同亞型或同一亞型不同毒株流感病毒的能力。NA可以去除唾液酸，幫助子代病毒的釋放和避免病毒自身的聚集；PA、PB`1和PB2三種聚合酶以及NP核蛋白主要用於病毒RNA的複製和轉錄；基質蛋白Ml負責核外輸送，M2負責形成離子通道；非結構蛋白NSl是幹擾素的抑制劑，NS2負責核外輸送。
[0005]目前，國家許可用於治療流感的藥物主要為以下兩大類:1)烷胺類(金剛烷胺和金剛乙胺)；2)流感病毒神經氨酸酶抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。對烷胺類藥物，已出現大量的耐藥性流感毒株，因此目前世界衛生組織不建議使用烷胺類藥物作為治療流感的藥物；目前大部分流感病毒(包括甲型HlNl流感)仍對奧司他韋和扎那米韋敏感，但在日本等地區也已經出現耐藥性毒株，耐藥性毒株的出現限制了這些化學小分子藥物的大規模使用。
[0006]治療性抗體用於流感的等病毒感染性疾病的治療早有報導，抗血清用於治療SARS和重症H5N1禽流感病毒感染者的案例已經證明了抗體在治療病毒感染中發揮的重要作用。具有廣譜中和活性的抗流感病毒的治療性抗體具有以下潛在優勢，一方面它可以阻斷病毒與靶細胞的結合，另一方面通過補體和T細胞、NK細胞等效應細胞的作用，將被病毒感染的細胞殺死。[0007]因此，本領域很有必要針對流感病毒開發親和性良好且副作用低的治療性抗體，如人源化或全人源的抗體，以滿足臨床治療的需求。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在於提供一種抗流感病毒廣譜中和性全人單克隆抗體及其應用。
[0009]在本發明的一個方面，提供一種分離的結合分子，所述的結合分子識別(較佳地為特異性識別)流感病毒HA蛋白中HA2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位。
[0010]在一個優選例中，所述結合分子包含SEQ ID NO:8所示重鏈CDRl區、SEQ ID NO:9所示重鏈⑶R2和SEQ ID NO: 10所示重鏈⑶R3區；其能識別並結合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亞基中的表位。
[0011]在另一優選例中，所述結合分子包含SEQ ID NO: 14所示輕鏈⑶Rl區、SEQ IDNO: 15所示輕鏈⑶R2和SEQ ID NO: 16所示輕鏈⑶R3區；其能識別並結合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亞基中的表位。
[0012]在另一優選例中，所述結合分子包含以下的胺基酸序列:SEQ ID N0:8所示的重鏈CDRl，SEQ ID NO:9 所示的重鏈 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所示的重鏈 CDR3，SEQ ID NO: 14 所示的輕鏈CDR1、SEQ ID NO: 15所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示的輕鏈CDR3 ;其能識別並結合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亞基中的表位。
[0013]在另一優選例中，所述的結合分子包含重鏈可變區，所述的重鏈可變區具有SEQID NO:2所示的胺基酸序列。
[0014]在另一優選例 中，所述的結合分子包含輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區具有SEQID NO:4所示的胺基酸序列。
[0015]在另一優選例中，所述的結合分子包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。
[0016]在另一優選例中，所述的結合分子包含抗體的重鏈恆定區和或輕鏈恆定區。
[0017]在另一優選例中，所述的結合分子是Fab、F(ab』 )、F(ab』)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體。
[0018]優選的，所述的結合分子是人單克隆抗體。
[0019]更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ IDN0:2和SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列，其重鏈恆定區選擇下組中重鏈類型之一的恆定區:IgGU IgG2a、IgG2b和IgG3，和其輕鏈恆定區選擇下組輕鏈類型的恆定區之一:κ鏈和λ鏈。
[0020]更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ IDNO: 2和SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列，其重鏈恆定區和輕鏈恆定區分別具有Genebank號ACK87036和ACK87038所示的胺基酸序列。
[0021]在另一優選例中，所述的單克隆抗體識別流感病毒HA蛋白上介於線性和空間構象之間的表位。
[0022]在另一優選例中，所述的單克隆抗體識別流感病毒HA蛋白中ΗΑ2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位(序列及位數的計算基於GenBank登錄號ACP41105.1的ΗΑ2蛋白)。[0023]在本發明的一個方面，提供編碼所述的結合分子的核酸分子。
[0024]在本發明的一個方面，提供所述的結合分子在製備用於診斷、治療和/或預防流感病毒所致的流感感染的藥物中的用途。
[0025]在另一優選例中，所述的流感病毒的毒株選自如下一組:H1亞型流感病毒(如H1N1)、H3亞型流感病毒(如H3N2)和H9亞型流感病毒(H9N2)。
[0026]在本發明的一個方面，提供一種表達載體，所述表達載體中含有編碼所述的結合分子的DNA。
[0027]在本發明的一個方面，提供一種宿主細胞，所述宿主細胞中含有所述的表達載體。
[0028]在本發明的一個方面，提供一種組合物，它含有有效量的所述的單克隆抗體，以及藥學上可接受的載體。
[0029]在本發明的一個方面，提供一種檢測流感病毒的試劑盒，其包括所述的結合分子。
[0030]在另一優選例中，所述的試劑盒還包括:抗原或抗體包被用試劑，洗滌試劑，第二抗體，標記物(如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖澱粉酶)，顯色劑酶底物等。
[0031]在本發明的一個方面，提供一種(優選非治療性地)抑制流感病毒的方法，所述的方法包括給予患者有效量的所述的結合分子。
[0032]在本發明的一個方面，提供一種(優選非診斷性地)檢測流感病毒的方法，利用所述的結合分子與待測樣品進行接觸，通過檢測所述的結合分子與受試樣品的結合情況，獲得流感病毒的存在情況以及存在量。
[0033]本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1、A型流感病毒結構示意圖。
[0035]圖2、β -actin內參的PCR擴增產物的電泳結果。
[0036]圖3、重鏈基因的PCR擴增產物的電泳結果。
[0037]圖4、輕鏈基因的PCR擴增產物的電泳結果。
[0038]圖5、全人單克隆抗體(1F2)濃度。
[0039]圖6、全人單克隆抗體(1F2)對HA/HA1蛋白的識別能力鑑定。
[0040]圖7、全人單克隆抗體(1F2)識別HA2蛋白G345到P504肽段。
[0041]圖8、全人單克隆抗體(1F2)識別流感病毒的廣譜性。
[0042]圖9、全人單克隆抗體1F2的廣譜中和活性。A:A/Sichuan/l/2009 (HlNl) ；B:A/Jiangx1-Donghu/312/2006(H3N2) ；C:A/Guangzhou/333/99 (H9N2)。
[0043]圖10、載體AbVec-hlgG的質粒圖譜。
[0044]圖11、AbVec-hlgKappa 的質粒圖譜。
【具體實施方式】
[0045]本發明人經過廣泛而深入的研究，獲得一種含有獨特的互補決定區(⑶R區)的抗流感病毒廣譜中和性的結合分子，優選全人單克隆抗體，該結合分子對於流感病毒具有廣譜中和作用。在此基礎上完成了本發明。
[0046]結合分子
[0047]本發明提供了能特異性結合流感病毒的結合分子。優選地，所述結合分子是人結合分子。優選地，本發明的結合分子呈現對於流感病毒的中和活性。
[0048]本發明的結合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述結合分子可以是抗原結合片段，包括但不限於Fab、F(ab』 )、F(ab，) 2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈卩遼菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及至少含有足以賦予與禽流感病毒毒株的特異性抗原結合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
[0049]本發明的結合分子也可以特異性結合流感病毒的一或多個片段。對於治療和/或預防流感病毒的方法而言，所述結合分子優選能特異性結合流感病毒的表面可及蛋白質。在特定的實施方案中，本發明的結合分子能特異性結合流感病毒的HA2分子。
[0050]本發明還提供了所述的結合分子在製備診斷、預防和/或治療流感病毒感染的藥物中的應用。這種感染可以在小群體中發生，但是也可以以季節流行病方式在世界範圍傳播，或者更嚴重地在全球蔓延，數百萬個體處於危險之中。本發明提供了可以中和導致這種季節流行病以及潛在的全球性流行病的流感病毒毒株的感染的結合分子。重要的是，目前可以預期利用本發明的結合分子對於多種流感病毒毒株起到防護和治療作用，因為已經揭示了由於與在不同流感病毒毒株的HA蛋白之間共享的表位的結合，因此目前可以使用本發明的結合分子在這些毒株之間進行交叉中和作用。本發明的結合分子可以大規模地製備和貯存，因為其提供了針對不同的流行性毒株的保護作用，且對於為將來可能發生的流感爆發做準備是有利的。
[0051]CDR區是免疫學感興趣的蛋白質的序列。在本發明的實施方案中，結合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六個CDR區。優選地，本發明的結合分子包含本文揭示的至少兩個⑶R。
[0052]本發明的另一方面包括本文所述結合分子的功能變體。如果變體能與親代結合分子競爭特異性結合流感病毒或其蛋白片段，則認為該變體分子是本發明結合分子的功能變體。換句話說，所述功能變體仍能結合流感病毒或其片段。優選地，所述功能變體能競爭性特異性結合由親代結合分子特異性結合的至少兩(或更多個)不同的流感病毒毒株或其片段。此外，如果某分子對於親代結合分子對其具有中和活性的流感病毒、優選對於至少兩(或多個)流感病毒毒株具有中和活性，則認為該分子是本發明結合分子的功能變體。功能變體包括但不限於一級結構序列基本相似、但是含有例如在親代結合分子中未發現的體外或體內化學和/或生物化學修飾的衍生物。這種修飾包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共價附著、脂質或者脂質衍生物的共價附著、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。換句話說，親代結合分子的胺基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述胺基酸序列的所述結合分子的結合特性，即所述結合分子仍能識別並結合其靶位。
[0053]所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和胺基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本 領域已知的標準技術導入，例如定向誘變和隨機PCR介導的誘變，並且可包含天然以及非天然核苷酸和胺基酸。
[0054]保守胺基酸取代包括其中胺基酸殘基由具有相似結構或者化學性質的另一胺基酸殘基置換的取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族已經在本領域中限定。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、無電荷極性側鏈胺基酸(例如天冬酞胺、穀氨酞胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半膚氨酸、色氨酸)、非極性側鏈胺基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支側鏈胺基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側鏈胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領域技術人員明白也可以使用除了上述家族之外的其它胺基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的胺基酸取代，例如胺基酸由具有不同結構或者化學性質的另一胺基酸殘基置換。相似的小變異也可包括胺基酸缺失或者插入，或者這二者。使用本領域熟知的電腦程式可以發現確定哪些胺基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學活性的指導。
[0055]此外，功能變體可包含胺基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者這兩端的截短體。本發明的功能變體與親代結合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的結合親和性，但是仍能結合流感病毒或其片段。例如，本發明的功能變體與親代結合分子相比對於流感病毒HlNl或其片段可具有增加或降低的結合親和性。優選地，可變區包括但不限於構架區、高變區或CDR區的胺基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區包含三個高變區，包括三個CDR，以及更保守的區域，即所謂的構架區((FR)。高變區包含來自CDR的胺基酸殘基和來自高變環的胺基酸殘基。在本發明範圍內的功能變體與本文所述親代結合分子具有至少大約50%至大約99%、優選至少大約60%至大約99%、更優選至少大約70%至大約99%、甚至更優選至少大約80%至大約99%、最優選至少大約90%至大約99%、特別是至少大約95%至大約99%，以及特別是至少大約97%至大約99%的胺基酸序列同源性。本領域技術人員已知的計算機算法如Gap或者Bestfit可用於最佳地排列胺基酸序列以進行對比以及明確相似或相同的胺基酸殘基。功能變體可以通過使用本領域已知的普通分子生物學方法改變親代結合分子或其一部分而獲得，所述方法包括但不限於易錯PCR、寡核苷酸指導的誘變、定點誘變以及重鏈和/或輕鏈改組法。在一個實施方案中，本發明的功能變體對於流感病毒具有中和活性。所述中和活性與親代結合分子相比可以相同或者更高或更低。此後，當使用術語(人)結合分子時，其也涵蓋所述(人)結合分子的功能變體。
[0056]作為本發明的優選方式，所述的結合分子是單克隆抗體，優選它包括人源的恆定區(如人源恆定區IgH序列和IgKappa序列)。所述的抗流感病毒單克隆抗體的重鏈可變區、輕鏈可變區以及位於重鏈可變區和輕鏈可變區的互補決定區(CDR)均具有獨特的不同於現有技術的結構，且它們是全人源的。
[0057]本發明包括:具有所述單克隆抗體的相應胺基酸序列的單克隆抗體，具有所述單克隆抗體可變區鏈 的單克隆抗體。本發明還包括具有含所述的互補決定區(CDR)的輕鏈和重鏈的任何抗體，以及⑶R區與本發明的單克隆抗體的⑶R具有90%以上(較佳地95%以上)的同源性的任何抗體。
[0058]抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為互補決定區(complementarity determining region,CDR),所述的CDR區將可變區間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，通過其間的FR形成的β摺疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位點。可以通過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了 FR或⑶R區域。
[0059]對於本發明的單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規方法測定。
[0060]經驗證，本發明的抗流感病毒單克隆抗體的CDR區是全新的，其針對的是一個獨特的流感病毒HA蛋白上的抗原表位，技術構思不同於現有的抗流感病毒抗體。本發明的抗流感病毒單克隆抗體所識別的表位介於線性和空間構象之間；更佳地所述的單克隆抗體識別流感病毒HA蛋白中HA2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位。
[0061]本發明的單克隆抗體是全人源的，其重鏈、輕鏈可變區以及恆定區均來源於人抗體。因此，其在具有特別優異的識別和中和流感病毒的作用的同時，還具有免疫原性低、安全性高的特點。
[0062]在本發明的實施例中，本發明從接種2009年甲型HlNl流感病毒裂解疫苗(2009/Cal)志願者體內獲得外周血單個核細胞(PBMC)，使用⑶197lgG+/HA為特異性標誌物，經流式細胞儀分選(FACS)獲得識別HA蛋白特異性B細胞。使用文獻已報導的單細胞RT-PCR 技術(Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124)，獲得了抗體基因並在293T細胞中進行表達獲得全人單克隆抗體1F2。ELISA表位分析得知這株抗體識別血凝素HA蛋白的HA2亞基，HA2在不同種屬流感病毒中具有保守性，表明這株抗體可能的識別廣譜性。微中和實驗證明此抗體能夠中和A/Sichuan/1/2009 (HlNl)，A/Jiangx1-Donghu/312/2006 (H3N2), A/Guangzhou/333/99 (H9N2)流感病毒，表明此株抗體具有廣譜中和活性，在臨床上具有預防和治療多種亞型流感病毒感染的潛在價值。
[0063]另一方面，本發明包括免疫綴合物，即包含本文所述至少一個結合分子以及進一步包含至少一個標記如可檢測的部分/物質的分子。本發明還涉及本發明免疫綴合物的混合物或者至少一種本發明免疫綴合物與另一分子的混合物，所述另一分子如治療劑或者另一結合分子或免疫綴合物。`本發明的免疫綴合物可包含一個以上的標記。這些標記可以彼此相同或不同，並且可以與結合分子非共價地結合/綴合。所述標記也可以通過共價鍵與人結合分子直接結合/綴合。或者，所述標記可以通過一或多種連接化合物與所述結合分子結合/綴合。標記與結合分子的綴合技術為本領域技術人員所熟知。
[0064]本發明的免疫綴合物的標記可以是治療劑，但是它們也可以是可檢測的部分/物質。適於治療和/或預防的標記可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強吞噬作用或者免疫刺激作用的其它結合分子。包含可檢測物質的免疫綴合物可診斷性地用於例如評定對象是否已經感染流感病毒毒株或者作為臨床實驗程序的一部分監測流感病毒感染的發生或進展以例如確定指定治療方案的功效。然而，它們也可以用於其它檢測和/或分析和/或診斷目的。可檢測的部分/物質包括但不限於酶、輔基、螢光材料、發光材料，生物發光材料、放射性材料、正電子發射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。為了檢測和/或分析和/或診斷目的用於標記結合分子的標記依賴於使用的特定檢測/分析/診斷技術和/或方法例如免疫組織化學染色(組織)樣品、流式細胞計量術、雷射掃描細胞計量術檢測、螢光免疫測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、生物測定(例如吞噬作用測定)、蛋白質印跡應用等。對於本領域已知的檢測/分析/診斷技術和/或方法合適的標記為本領域技術人員所熟知。
[0065]此外，本發明的人結合分子或者免疫綴合物也可以附著於固體支持物上，其特別用於流感病毒HA蛋白或其片段的體外免疫測定或者純化。這種固體支持物可以是多孔或者無孔的、平面或非平面的。本發明的結合分子可以與標記序列如膚融合以便於純化。所述標記序列的例子包括但不限於六組氨酸標記、血凝素(HA)標記、myc標記或者flag標記。或者，一種抗體可以與另一種抗體綴合形成抗體異源綴合物(heteroconjugate)。
[0066]另一方面，本發明的結合分子可以與一或多個抗原綴合/附著。優選地，這些抗原是由給予了結合分子-抗原綴合物的對象的免疫系統識別的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附著抗原和結合分子的綴合方法為本領域所熟知，包括但不限於使用交聯劑。本發明的結合分子結合流感病毒並且附著於結合分子的抗原將引發對於所述綴合物的有力T細胞攻擊，最終導致流感病毒的破壞。
[0067]除了通過直接或間接(例如通過接頭)綴合而化學產生免疫綴合物之外，所述免疫綴合物可以作為融合蛋白而產生，所述融合蛋白包含本發明的結合分子及合適的標記。融合蛋白可以通過本領域已知方法產生，例如通過構建核酸分子以及隨後表達所述核酸分子而重組產生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼結合分子的核苷酸序列以及編碼合適標記的核苷酸序列。
[0068]本發明另一方面提供了編碼本發明的至少一種結合分子、其功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。這種核酸分子可以用作中間物以進行克隆，例如用於如上述的親和力成熟方法中。在一個優選的實施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。DNA分子的序列可以用常規技術，或利用雜交瘤技術獲得。
[0069]本領域技術人員將意識到這些核酸分子的功能變體也是本發明的一部分。功能變體是這樣的核酸序列，通過使用標準遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的胺基酸序列。
[0070]一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。[0071 ] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0072]目前，已經可以完全通過化學`合成來得到編碼本發明的結合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明的結合分子的序列中。
[0073]本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。優選的，本發明的載體是例如含病毒啟動子的質粒表達載體，且在所述表達載體中分別插入了抗流感病毒單克隆抗體重鏈可變區(VH)與恆定區的IgH (來自人源IgH的恆定區)融合序列和輕鏈可變區VL與人體Igkappa(來自人源Igkappa的恆定區)融合序列。
[0074]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:細菌細胞如大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細胞如CH0、C0S7、NS0或Bowes黑素瘤細胞等。特別適用於本發明的宿主細胞是真核宿主細胞，尤其是哺乳動物細胞，如293細胞。
[0075]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉澱法，或常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0076]獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的結合分子。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0077]本發明的結合分子優選的是採用哺乳動物細胞來生產，哺乳動物細胞通常需要在含血清的培養基中進行培養。需要對細胞進行無血清的適應過程後，方可讓細胞在無血清培養基中正常的生長。
[0078]如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於:常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
[0079]本發明的結合分子也可以在轉基因非人哺乳動物如兔、山羊或者牛中產生，並且分泌進例如其乳中。
[0080]藥物組合物
[0081 ] 本發明的結合分子可用於製備抑制流感病毒的組合物。
[0082]基於本發明的新發現，還提供了一種可抑制流感病毒或流感病毒感染相關疾病的組合物，其包含:有效量的本發明所述的結合分子；以及藥學上可接受的載體。
[0083]本文所用的術語「藥學上可接受的」是指當分子本體和組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生不利的、過敏的或其它不良反應。本文所用的「藥學上可接受的載體」應當與本發明的結合分子相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低組合物的效果O
[0084]可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，如玉米澱粉和土豆澱粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween?;潤溼劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩衝液等。
[0085]本發明的組合物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以採用注射或其它治療方式。 [0086]本發明的結合分子可以以未分離的或者分離的形式使用。此外，本發明的結合分子可以單獨應用或者於包含至少一種本發明的結合分子(或其變體或片段)的混合物中應用。換句話說，所述結合分子可以組合應用，例如作為包含兩或更多種本發明的結合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的結合分子可以組合在一個治療方案中以達到希望的預防、治療或診斷作用，但是或者也可以將具有相同活性的結合分子組合在一個治療方案中以達到希望的預防、治療或診斷作用。任選地，所述混合物進一步包含至少一種其它治療劑。優選地，所述治療劑如MZ抑制劑(例如amantidine、金剛乙胺(rimantadine))和/或神經氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋((zanamivir)、奧司他韋(oseltamivir))可用於預防和/或治療流感病毒感染。
[0087]所述藥物組合物可包含兩或多個對於流感病毒具有中和活性的結合分子。在一個實施方案中，當組合應用時，所述結合分子呈現協同中和活性。換句話說，所述組合物包含至少兩種具有中和活性的結合分子，特徵在於所述結合分子在中和流感病毒中起協同作用。如本文所用，術語「協同」是指當組合應用時，結合分子的組合作用高於單獨應用時的加合作用。所述協同作用的結合分子可以結合流感病毒的相同或不同片段上的不同結構。計算協同作用的方式是通過組合指數計算。組合指數(Cl)的概念已經由Chou andTalalay(1984)描述。
[0088]本發明的結合分子或藥物組合在用於人體之前可以在合適的動物模型系統中檢測。這種動物模型系統包括但不限於小鼠、雪貂(ferret)和猴。感病毒流感病毒中也可以協同作用。
[0089]可以調整給藥方案以提供最佳的所需應答(例如治療應答)。合適的劑量範圍可例如是0.01-lOOmg/kg體重,優選0.l_15mg/kg體重。此外,例如可以給予一次推注、隨時間給予多次分開劑量或者根據治療情況的緊急性而可以按比例降低或增加劑量。本發明的分子和組合物優選是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法為本領域所熟知。用於診斷、預防和/或治療的其它分子可以以與本發明的結合分子相似的給藥方案給予。如果單獨給予其它分子，則可以在給予本發明的一或多種人結合分子或藥物組合物之前、同時或者之後給予患者。對於人患者的精確給藥方案通常在臨床實驗期間挑選出。
[0090]檢測試劑和試劑盒
[0091]本發明的結合分子可用於製備檢測流感病毒的試劑或試劑盒。
[0092]如本文所用，術語「待測樣品」涵蓋了多種樣品類型，包括生物學來源的血液及其它體液樣品，實體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養物，或者衍生自其中的細胞或者其後代。該術語還包括在獲得後已經通過任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或者富集某些成分如蛋白質或者多核苷酸。該術語涵蓋了得自任何物種的各種臨床樣品，也包括培養的細胞、細胞上清和細胞溶解產物。
[0093]以所述的結合分子為基礎，可製備方便、快速且準確地檢測流感病毒(如甲型流感病毒；更特別地如甲型HlNl、H3N2、H9N2病毒)的試劑盒。
[0094]因此，本發明提供了一種用於檢測樣品中是否存在流感病毒的檢測試劑盒，該試劑盒中含有本發明的抗流感病毒的結合分子。
[0095]在獲得了本發明提供的結合分子後，可以方便地製備出用於特異性檢測流感病毒的檢測試劑盒。
[0096]作為本發明的一種檢測方式，採用間接ELISA法，將待測的抗原包被於固相載體上，利用本發明的結合分子進行檢測。
[0097]作為本發明的一種優選方式，所述的結合分子是抗體，可根據雙抗夾心法的原理來檢測。雙抗夾心法常規的做法是將一抗(如本發明的單克隆抗體)固定於載體，然後使一抗與抗原反應，洗滌後再與二抗反應(所述的二抗攜帶可檢測信號，或可與攜帶可檢測信號的物質結合)，最後進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。雙抗夾心法特別適用於具有兩個或兩個以上表位的抗原的檢測。
[0098]為了在檢測時更方便，所述試劑盒中除了含有本發明的結合分子以外，還可以包含其它檢測試劑或輔助試劑，所述的輔助試劑例如是ELISA試劑盒中常規使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配製方法均是本領域技術人員所熟知的，如顯色劑、標記物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領域人員應理解，各種變化形式的檢測試劑盒均是包含在本發明中的，只要在其中利用了本發明的結合分子作為識別流感病毒的試劑。
[0099]此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用於說明其中裝載的試劑的使用方法。
[0100]在獲得了本發明提供的結合分子和/或試劑盒後，可以利用多種免疫學相關方法來檢測樣品中HA蛋白或其含量，從而得知待測樣品的供體是否感染流感病毒，這些方法均被包含在本發明中。較佳地，所述的方法是以非疾病診斷為目的的。
[0101]作為一種優選方式，本發明提供一種體外(非診斷或治療性地)檢測流感病毒的方法，包括以下步驟:
[0102](al)將待測樣品包被於固相載體；
[0103](a2)將本發明的結合分子加樣於(al)的固相載體，從而使待測樣品中的流感病毒與結合分子結合，形成帶有「流感病毒-本發明的結合分子」 二元複合物的固相載體；
[0104](a3)將特異性結合本發明的結合分子的檢測物加樣於(a2)的固相載體，形成帶有「流感病毒-本發明的結合分子-檢測物」三元複合物的固相載體；所述的檢測物上攜帶一標記物；
`[0105](a4)檢測三元複合物中的標記物，確定待檢測樣品中流感病毒的存在與否以或存在的量。
[0106]按照上述方法，只要設置已知濃度的抗原對照，製作濃度標準曲線，通過比照濃度標準曲線就可以得出待測樣品中的流感病毒含量。
[0107]本發明的主要優點在於:
[0108](I)提供了一種具有全新的結合分子，其是全人源的，與其它動物源性(如鼠源性)抗流感病毒的分子相比，免疫原性大大減少，且親和性良好。不僅治療效果好，而且副作用低。
[0109](2)本發明的結合分子能夠結合具有天然構象的流感病毒血凝素蛋白(HA)的HA2亞基，能夠阻止多種亞型流感病毒侵染易感細胞。
[0110]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0111]1.材料和方法
[0112]以下說明本發明即一株能夠中和多種流感病毒廣譜中和性全人單克隆抗體製備以及抗體特性分析過程。分為兩部分:
[0113](I)單細胞RT-PCR法獲得抗體基因以及抗體表達；[0114](2)抗體特性分析。
[0115]具體過程如下:
[0116]1、外周血單核細胞(PBMC)的獲得
[0117]從根據血凝抑制實驗篩選的志願者體內抽取外周血，採用常規Ficoll-Paque密度梯度離心，得到IO7以上個外周血單核細胞(PBMC)。
[0118]2、HA特異性記憶B細胞分選
[0119]使用FITC-CD 19/APC-1gG/Cy3-HA(FITC-CD 19/APC-1gG 購自 BD，Cy3_HA 製備方法為:由杆狀病毒昆蟲細胞蛋白表達系統(Invitrogen)表達製備HA蛋白，並用生物素蛋白標記試劑盒(Thermo Scientific)標記後,和Cy3_鏈黴親和素(Sigma)偶聯)為標誌物,經流式細胞儀獲得特異性B細胞至96孔RT-PCR板，每孔一個細胞，獲得HA特異性記憶B細胞。
[0120]3、抗體基因
[0121]使用RT-PCR和Nested-PCR技術，獲得抗體基因(參見NatProtoc.2009; 4 (3): 372-84)。連接 pGEM_T Easy (Promega)載體,進行測序,常規方法驗證抗體基因。如文獻Kenneth Smith et al.Rapid generation of fully human monoclonalantibodies specific to a vaccinating antige.Nat Protoc.2009;4(3):372 - 384 所述構建載體AbVec-hlgG和AbVec-hlgKappa，載體圖譜分別如圖10和11，序列分別為genebank號FJ475055和FJ475056所述，其中分別包含編碼人IgGl重鏈和輕鏈恆定區的鹼基序列，編碼人IgGl重鏈和輕鏈恆定區的胺基酸序列為Genebank號ACK87036和ACK87038所述。然後將重、輕鏈基因分別連接表達載體AbVec-hlgG(插入位點為AgeI和Sail)和AbVec-hlgKappa (插入位 點為 AgeI 和 BsiwI)。
[0122]4、抗體表達
[0123]脂質體法瞬時轉染293T細胞，進行全人抗體表達。
[0124]I)在轉染前I天將1.0X IO6細胞接種到6孔細胞培養板中；
[0125]2)A 管:500μ1 Opt1-MEM(Invitrogen) +4 μ g IgG+4 μ g IgL
[0126]3)Β 管:500μ1 0pt1-MEM+20 μ I Lipofectamine Reagent (Invitrogen)
[0127]4)靜置5分鐘後,將A管與B管混合,在室溫靜置20min ；
[0128]5) A、B管混合物加入細胞培養盤中，37°C孵育6h ；
[0129]6) 6h 後，吸除含有 Lipofectamine Reagent 的培養液，每孔加入 2mlFreeStyle?293Expression Medium(Invitrogen)；
[0130]7) 72h後，收集含全人抗體的細胞上清，4°C，3000rpm, 5min,保存備用。
[0131]5、抗體濃度測定
[0132]ELISA方法測定全人抗體濃度。
[0133]I)包被 Goat Ant1-Human IgG (Fab Specific)Antibody (購自 S igma)於 ELISA板，10 μ g/ml,每孔 100 μ 1,4°C過夜；
[0134]2) PBST 洗板，3 次；
[0135]3)封閉:18/111185八，每孔20(^ l，37°C，2h ；
[0136]4) PBST 洗板，3 次；
[0137]5)使用倍比稀釋的人IgG(購自Sigma)製作標準曲線,濃度400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、0ng/ml, 100 μ I/ 孔；前述製備的全人抗體細胞上清稀釋5000倍，每孔ΙΟΟμ l，37°C，2h ；
[0138]6) PBST 洗板，3 次；
[0139]7)加入 Goat Ant1-Human IgG (Fe specific)-Peroxidase antibody (購自Sigma), 1:10000 稀釋 ，每孔 ΙΟΟμ l，37°C，lh ；
[0140]8) PBST 洗板，3 次；
[0141]9)TMB 底物(購自 Sigma)，每孔 100μ l，37°C，15min，避光反應；
[0142]10)加入 2M H2SO4,每孔 50 μ I ；
[0143]11)測定0D450，並進行數據處理。
[0144]6、抗原特異性檢測
[0145]檢測表達的全人抗體是否識別HA蛋白、HAl蛋白、2009甲型HlNl流感病毒疫苗裂解液(2009/Cal)和 2008-2009 季節流感病毒疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))。ELISA進行檢測，分別包被HA-His (杆狀病毒昆蟲細胞蛋白表達系統(Invitrogen)表達)、IOO0C 5分鐘熱變性HA-His、HAl-Fc (杆狀病毒昆蟲細胞蛋白表達系統(Invitrogen)表達),2009甲型HlNl流感疫苗裂解液(2009/Cal)(購自華蘭生物)和2008-2009季節流感疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))(購自華蘭生物)。
[0146]I)分別包被HA-HiS、熱變性HA-His、HAl-Fc、2009甲型HlNl流感疫苗裂解液(2009/Cal)和 2008-2009 季節流感疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))於 ELISA板，10 μ g/ml,每個樣品兩個復孔，每孔100 μ 1,4 C過夜；
[0147]2) PBST 洗板，3 次；
[0148]3)封閉:1%BSA，每孔 200μ l，37°C，2h ;
[0149]4) PBST 洗板，3 次；
[0150]5)根據測定濃度，調整本發明全人抗體至300μ g/ml，每孔100μ 1，鼠源單克隆抗體S-95-7(識別位於HAl上的構象依賴表位，其保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO:C201024)為陽性對照，37°C，2h ；
[0151]6) PBST 洗板，3 次；
[0152]7)Goat Ant1-Human IgG (Fe specific)-Peroxidase antibody,1: 10000稀釋，每孔100μ 1，加到HA-His、熱變性HA-His、2009甲型HlNl流感病毒疫苗裂解液和2008-2009季節流感病毒疫苗裂解液ELISA板；GoatAnt1-Human IgG (Fabspecific) -Peroxidase antibody, 1: 10000 稀釋，每孔 100 μ I,加到 HAl-Fc ELISA 板,37°C, Ih ；
[0153]8) PBST 洗板，3 次；
[0154]9) TMB 底物(購自 Sigma)，每孔 100μ l，37°C，15min，避光反應；
[0155]10)加入 2M H2SO4,每孔 50 μ I ；
[0156]11)測定0D450，並進行數據處理。
[0157]7、抗體中和活性測定
[0158](I)微中和試驗
[0159]DMDCK細胞(購自ATCC)鋪至96孔板，DMEM+10% (v/v) FBS培液培養，12h後生長至90%，備用。[0160]2) 96孔板，抗體用DMEM+0.2%BSA 2 X梯度稀釋，終體積50 μ I/孔。
[0161]3)每孔加入50 μ I含100個TCID5tl病毒(預先用DMEM+0.2%BSA稀釋至100TCID50/50 μ I)。病毒為:A/Sichuan/l/2009 (HlNl)，A/Jiangx1-Donghu/312/2006 (H3N2)或 A/Guangzhou/333/99(H9N2)。
[0162]4)每塊板還包括對照:
[0163]病毒對照(PC，不加抗體)——50 μ I DMEM 0.2%BSA+50 μ I病毒(病毒種類如4)所列)；
[0164]MDCK 細胞對照(NC)-100 μ I DMEM 0.2%BSA ；
[0165]5) 37 °C 5%(v/v)C02，lh，使抗體與病毒充分作用。
[0166]6) MDCK 單層細胞吸去培液，PBS 洗兩遍，加 100 μ I DMEM+0.2%BSA+2 μ g/mlTPCK-trypsin。
[0167]7)將抗體-病毒孵育混合物100 μ I全部對應移至MDCK細胞平板中。
[0168]8)37°C，5%C02，20h。
[0169]10)PBS洗一遍。預冷的80%(v/v)丙酮-PBS溶液固定IOmin ；
[0170](2) ELISA
[0171]I)固定好的細胞板PBS+0.05%(v/v) Tween 20 (漂洗液)洗3遍。
[0172]2)用 PBS+1%BSA 0.l%Tw`een 20 (稀釋液)1:10000 稀釋 ant1-NP (HRP)抗體，50 μ I/孔，室溫I小時。
[0173]3)漂洗液洗6遍。
[0174]4)新配製的底物 2mg OPD (o-phenylenediamine,鄰苯二胺)加入到 4ml 0.05M 朽1檬酸緩衝液(含0.03g/ml過硼酸鈉)中，50 μ I/孔，室溫5min。
[0175]5) 2M H2SO4 終止反應，50 μ I/孔。
[0176]6)分光光度計490nm讀板。
[0177]7)至少做兩次獨立實驗。
[0178]I1.實施例
[0179]實施例1、HA特異性記憶B細胞
[0180]使用FITC-CD19/APC-1gG/Cy3-HA為特異性標誌物，獲得了若干個HA特異性B細胞。
[0181]實施例2、抗體基因
[0182]RT-PCR和Nested-PCR法獲得抗體重、輕鏈可變區基因，分子量為400bp左右，β-actin作為內參(343bp)，電泳圖譜見圖2，圖3和圖4。將來源於同一個B細胞抗體重輕鏈基因可變區連接T載體，測序並進行表達載體構建。
[0183]1F2重鏈可變區基因序列如下(SEQ ID NO:1):
[0184]GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGC AACTA1GTCATGCAT(CDRl) TGGGTCCGCCAGGCTCGAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCΛ TCTATTAGTGGGACTGGTCTTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGGfCDR2^ CGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCCTATATTACTGTGCGAAA GCGACGAAGTATCCTTACACGAAT(CDR3> TGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCGGGTCACCGTCTCCTC
[0185]備註:其中使用雙下劃線標註的依次為重鏈基因CD R1(SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQID N0:6)，CDR3(SEQ ID NO:7)序列。
[0186]1F2重鏈可變區胺基酸序列如下(SEQ ID NO:2):
[0187]EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS NYVMHfCDRl)WVRQARGKGLEWVS SISGTGLSTYVADSVKG(CDR2) RFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTALYYCAK ATKYPYTN(CDR3> WFDPWGQGTLVTVSS
[0188]備註:其中使用雙下劃線標註的依次為重鏈胺基酸⑶R1(SEQ ID NO:8),CDR2 (SEQ ID NO: 9)，CDR3 (SEQ ID NO: 10)序列。
[0189]1F2輕鏈可變區基因序列如下(SEQ ID NO:3): [0190]GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC ACGCCCAGTCAC ACT4TTAGrAr.rGArTTACrr<rDRn TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGGTCCCAGGCTCCTCATCTAT GGTGCATCCACCAGGGCCACT(CDR2) GGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCA( LLI ( CAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGT CAGCAGTATAATAACTGGCCTCCG(CDR3、/VTCACCTTCGGGCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCAATCACTAG
[0191]備註:其中使用雙下劃線標註的依次為輕鏈基因CD R1(SEQ ID NO: 11)，CDR2 (SEQID N0:12)，CDR3(SEQ ID NO: 13)序列。
[0192]1F2輕鏈可變區胺基酸序列如下(SEQ ID NO:4):
[0193]EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC RASOSISSDLA(CDRl)WYQQKPGQGPRLLIY O VSTRAT(CDR2) GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC OOYNNWPP(CDR3) ITFGQGTRLEIK
[0194]備註:其中使用雙下劃線標註的依次為輕鏈胺基酸⑶Rl (SEQ ID NO: 14),CDR2 (SEQ ID NO: 15)，CDR3 (SEQ ID NO: 16)序列。
[0195]實施例3、抗體表達
[0196]ELISA結果表明成功表達了全人抗體，因表達載體中已含有重輕鏈的恆定區，因此空載體轉染的293T細胞也能表達抗體重輕鏈恆定區，見圖5。
[0197]實施例4、抗體表位分析
[0198]ELISA表明，1F2能夠識別HA蛋白，HA熱變性之後，1F2能夠部分識別HA，表明1F2識別的表位介於線性和空間構象之間。但是1F2不識別HAl蛋白，而HA蛋白僅由HAl和HA2兩部分組成，說明這此株抗體結合位點位於HA2，見圖6。HA2在不同流感病毒株中具有很高的保守性，因此提示，這株抗體具有識別流感病毒的廣譜性。S-95-7為鼠源特異性識別2009年甲型HlNl流感病毒HAl構象表位單克隆抗體，作為陽性對照，Vector (空載體轉染的293T細胞分泌的上清)為陰性對照。
[0199]本發明人進一步獲得了 HA2蛋白的片段，進行ELISA實驗檢測該抗體所識別的片段。ELISA表明，該全人源抗體識別HA2蛋白(序列及位數的計算基於GenBank登錄號ACP41105.1 的 HA2 蛋白)第 345 到第 504 (A/California/07/2009 (HlNl)序列)之間的一段肽段(G345-P504)，見圖7 ;圖中非肽(no peptide)是指孔中不包被任何肽段，疫苗是指甲型HlNl流感病毒裂解液。
[0200]實施例5、抗體識別流感病毒廣譜性
[0201]ELISA 結果表明，1F2 對 2009 年甲型流感病毒(A/California/07/2009 (HlNl))具有很高的識別性，同時對2008-2009年季節流感病毒(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))也具有很強的結合特性，見圖8。表明這株全人單克隆抗體具有識別廣譜性。S-95-7為鼠源特異性識別2009年甲型HlNl流感病毒HAl構象表位單克隆抗體，作為陽性對照，Vector (空載體轉染的293T細胞分泌的上清)為陰性對照。
[0202]實施例6、抗體具有廣譜中和性
[0203]全人單克隆抗體(1F2)使用293T細胞進行表達，將其濃度調整為1000 μ g/ml,進行對比稀釋。使用微中和試驗測定其對A/Sichuan/1/2009 (HlNl)(簡稱SC09)，A/Jiangx1-Donghu/312/2006 (H3N2)和 A/Guangzhou/333/99 (H9N2)(獲自中國疾病預防控制中心)流感病毒的中和活性。實驗表明，1F2不僅能夠中和Hl亞型流感病毒，並且對H3，H9亞型流感病毒均具有中和活性，說明了此株抗體的廣譜中和活性，見圖9。1F2對這些病毒的中和活性呈現出濃度梯度依賴性。
[0204]在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範
圍。`
【權利要求】
1.一種分離的結合分子，其特徵在於，所述的結合分子識別流感病毒HA蛋白中HA2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位。
2.如權利要求1所述的結合分子，其特徵在於，所述結合分子包含SEQID NO:8所示重鏈CDRl區、SEQ ID NO:9所示重鏈CDR2和SEQ ID NO: 10所示重鏈CDR3區。
3.如權利要求1所述的結合分子，其特徵在於，所述結合分子包含SEQID N0:14所示輕鏈CDRl區、SEQ ID NO: 15所示輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示輕鏈CDR3區。
4.如權利要求1所述的結合分子，其特徵在於，所述結合分子包含以下的胺基酸序列:SEQ ID NO:8所示的重鏈CDRl，SEQ ID NO:9所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 10所示的重鏈 CDR3, SEQ ID NO: 14 所示的輕鏈 CDR1，SEQ ID NO: 15 所示的輕鏈 CDR2 和 SEQ ID NO: 16所示的輕鏈⑶R3。
5.如權利要求1-4任一所述的結合分子，其特徵在於，包含重鏈可變區，所述的重鏈可變區具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
6.如權利要求1-4任一所述的結合分子，其特徵在於，包含輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區具有SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列。
7.如權利要求1-4任一所述的結合分子，其特徵在於，包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。
8.如權利要求1-4任一所述的結合分子，其特徵在於，所述的結合分子是Fab、F(ab』)、F(ab』)2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體； 優選的，所述的結合分子是`人單克隆抗體； 更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID NO:2和SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列，其重鏈恆定區選擇下組中重鏈類型之一的恆定區:IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，和其輕鏈恆定區選擇下組輕鏈類型的恆定區之一:κ鏈和λ鏈； 更優選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區和輕鏈可變區分別具有SEQID NO:2和SEQ ID Ν0:4所示的胺基酸序列，其重鏈恆定區和輕鏈恆定區分別具有Genebank號ACK87036和ACK87038所示的胺基酸序列。
9.編碼權利要求1-8任一所述的結合分子的核酸分子。
10.權利要求1-8任一所述的結合分子在製備用於診斷、治療和/或預防流感病毒所致的流感感染的藥物中的用途。
11.如權利要求10所述的用途，其特徵在於，所述的流感病毒的毒株選自如下一組:H1亞型流感病毒、H3亞型流感病毒和H9亞型流感病毒。
12.—種表達載體,其特徵在於,所述表達載體中含有編碼權利要求1-7任一所述的結合分子的DNA。
13.一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞中含有權利要求12所述的表達載體。
14.一種組合物，其特徵在於，它含有有效量的權利要求1-8任一所述的單克隆抗體，以及藥學上可接受的載體。
15.一種檢測流感病毒的試劑盒，其包括權利要求1-8任一所述的結合分子。
16.一種抑制流感病毒的方法，其特徵在於，所述的方法包括給予患者有效量的權利要求1-8任一所述的結合分子。
17.—種檢測流感病毒的方法，其特徵在於，利用權利要求1-8任一所述的結合分子與待測樣品進行接觸，通過檢測所述的結合分子與受試樣品的結合情況，獲得流感病毒的存在情況以及存在量 。
【文檔編號】G01N33/569GK103665155SQ201210342658
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月14日 優先權日:2012年9月14日
【發明者】孫兵, 陳愛中, 邊超, 胡偉斌, 王同燕, 凌志洋 申請人:中國科學院上海生命科學研究院