化學合成的sars病毒s基因片段及其表達、應用的製作方法

2023-09-16 14:53:50 2

專利名稱：化學合成的sars病毒s基因片段及其表達、應用的製作方法
技術領域：
本發明是化學合成的SARS病毒S蛋白的全新基因片段，利用基因工程技術，製備重組SARS病毒S蛋白。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達，表達的蛋白可用於疫苗及SARS病毒抗體或抗原的檢測等，本發明涉及基因工程技術、疫苗和診斷試劑領域。
SARS病毒是一種新型的冠狀病毒，由於這種病毒以前未曾感染過人類，所以人群對該病毒普遍易感，SARS病毒是一種單股正鏈RNA病毒，目前對其全基因序列已經測定，Genebank內已公布了10個左右的全長病毒基因序列，為利用基因工程技術研究診斷試劑、疫苗及篩選抗病毒藥物奠定了基礎。
SARS病毒用Vero-E6可以體外培養，所以利用培養的SARS病毒建立了檢測SARS病毒抗體的免疫螢光方法和酶聯免疫檢測法，但是用培養的SARS病毒作抗原檢測抗體，難以大量生產，亦會產生假陽性，研製特異的基因重組抗原是建立SARS病毒特異抗體檢測試劑的發展方向。預防SARS感染的最理想途徑是注射疫苗，但目前沒有預防SARS的疫苗，國內外均在積極開展疫苗的研製，尤其對滅活疫苗的研究進展較快，基因工程疫苗是最終的發展方向。
SARS病毒最外層的S蛋白，是介導病毒和宿主細胞結合的主要蛋白，封閉該蛋白的結合位點可阻止病毒感染細胞，所以SARS病毒的S蛋白是研製疫苗的首選蛋白。通過計算機分析，我們篩選出含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達，表達的蛋白可用於疫苗及SARS病毒抗體或抗原的檢測等。

發明內容
本發明是化學合成的SARS病毒S蛋白的全新基因片段，利用基因工程技術，製備重組SARS病毒S蛋白片段。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，第162個胺基酸一第460個胺基酸，共299個胺基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達該基因。表達的蛋白可用於疫苗、SARS病毒抗體或抗原的檢測及用於免疫製備抗人巨細胞病毒單抗和多抗等。化學合成的SARS病毒S基因片段及其表達、應用是採取以下步驟實施的1.SARS病毒S蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成利用ANTHEWIN等軟體，通過計算機分析SARS病毒S蛋白的胺基酸序列，發現S蛋白的N端(第162胺基酸-第460胺基酸)含有較強的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，並且在5』端增加了BamHI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護鹼基(GT)，在3』端增加了終止密碼子(TAA)和EcoRI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護鹼基(AC)，使該基因片段易於克隆至質粒pET28a(+)內的BamHI和EcoRI酶切位點內。
篩選的SARS病毒S蛋白內的抗原表位胺基酸序列(第162個aa-第460個aa)Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Glv TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe化學合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC2.表達SARS病毒S蛋白片段重組質粒的構建提取質粒pET28a(+)，用BamHI和EcoRI雙酶切，電泳後回收酶切的質粒大片段，溶於去離子水內。同樣用BamHI和EcoRI雙酶切化學合成的SARS病毒S蛋白基因片段，電泳回收後，溶於去離子水內。
取等摩爾濃度的上述兩種酶切後DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連接，使SARS病毒S蛋白基因片段插入到載體pET28a(+)內的BamHI和EcoRI位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白。3.重組質粒的篩選與鑑定將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，塗布含卡那黴素(60μg/ml)LB平板，置37℃過夜。次日隨機挑取轉化菌落和個對照菌(質粒pET28a轉化菌)，分別提取質粒，以提取的質粒為模板，PCR擴增SARS病毒S蛋白基因片段，含SARS病毒S蛋白基因片段的陽性重組質粒，應擴增出長約916bp的基因片段。將含有外源基因的質粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質粒含有合成的SARS病毒S蛋白基因片段，序列完全正確GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAACAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGCTAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCGATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCTTTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TACCTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCTGTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAGATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTTGTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACTAAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GATTAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCTGCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTTAAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TACAAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AACATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGCAAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA構建的重組質粒表達SARS的病毒S蛋白片段(299個胺基酸)，在其N端融合了載體上的34個胺基酸，全長333個胺基酸，其胺基酸序列如下Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Lys Val Pro Arg Gly SerHis Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Tyr Ile SerAsp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg GluPhe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro IleAsp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys LeuPro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro AlaGln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro ThrThr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys SerGln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys GlyIle Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe ProAsn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro SerVal Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val LeuTyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys LeuAsn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp AspVal Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys LeuPro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg ProPhe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe4.表達融合蛋白工程菌的篩選鑑定將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含3ml LB培養基(含卡那毒素60μg/ml)的試管內，37℃振蕩培養3h，加IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續振蕩培養誘導6h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量約為37kD的SARS病毒S蛋白，表達量約為30％，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶。5.表達SARS病毒S蛋白的純化1)表達SARS病毒S蛋白工程菌的超聲裂解將誘導表達融合蛋白的工程菌離心(8000rpm、10min、4℃)收菌，菌體重懸於原培養液1/10體積的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/LDTT)內，冰浴超聲破菌10min，離心(12000rpm、20min、4℃)收集上清，棄沉澱。收集的上清用於下一步的離子交換純化。
2)DEAE-Sepharose FF陰離子柱純化將DEAE-Sepharose FF陰離子柱連接至常壓層析系統，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)衝洗平衡，然後將上步獲得的裂解上清直接上樣，上樣流速為1.5ml/min，收集穿過峰。
3)S-Sepearse FF陽離子柱純化將上步DEAE-Sepharose FF陰離子穿過峰，裝入透析袋內，對透析液(20mmol/LPB(pH7.4)、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)攪拌透析4h。用上述透析液衝洗平衡S-Sepharose FF陽離子柱，然後將透析後的穿過峰直接上樣，上樣流速1.5ml/min。上樣結束後用透析液充分洗柱，再依次用含50、100、1000mmol/L NaCl的透析液洗脫蛋白，收集100mmol/L NaCl洗脫峰蛋白，即為純化的SARS病毒S蛋白。6.純化的SARS病毒S蛋白用作抗原檢測HCMV抗體將純化的SARS病毒S蛋白用50mmol/L的碳酸鹽(pH9.6)倍比稀釋後包被酶聯板，間接酶聯免疫法檢測已知的抗SARS病毒陽性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白能與抗SARS病毒陽性血清反應，不與正常人血清反應，說明病毒的SARS病毒S蛋白有較好抗原性和特異性。
同樣用辣根過氧化物酶(HRP)標記SARS病毒S蛋白，用撲獲法檢測抗SARS病毒IgM或IgG抗體，有較高的敏感性和特異性。SARS病毒S蛋白用作抗原，用金標法檢測抗SARS病毒抗體，亦有較高的敏感性和特異性。7.將表達的SARS病毒S蛋白片段，用於疫苗、SARS病毒抗體或抗原的檢測及用於免疫製備抗SARS病毒單抗和多抗等。8.將合成的SARS病毒S蛋白基因片段與其它基因片段連接，以融合蛋白的形式進行表達、製備。本發明與現有技術相比具有的優點我們表達的SARS病毒的S蛋白片段，有較多優點1.目前應用的SARS病毒抗體的酶聯免疫檢測試劑盒，其使用的抗原是全病毒抗原，生產較危險、成本高、與其它冠狀病毒有交叉反應等缺點。表達的SARS病毒的S蛋白片段用作抗原可克服上述缺點。
2.目前缺乏SARS病毒疫苗。滅活疫苗的研究取得了較打進展，但是生產成本高、危險大。SARS病毒最外層的S蛋白，是介導病毒和宿主細胞結合的主要蛋白，封閉該蛋白的結合位點可阻止病毒感染細胞，所以SARS病毒的S蛋白是研製疫苗的首選蛋白，我們選擇了其強抗原表位，利用基因工程技術表達製備，為研製基因工程疫苗奠定基礎。基因工程疫苗安全、成本低。
3.根據篩選出的SARS病毒的S蛋白片段胺基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，該基因適宜在真核和原核細胞內高表達。
4.本文構建的表達SARS病毒的S蛋白的工程菌，表達量可達菌體蛋白的30％，易於純化，可大量純化製備該蛋白。目前未見表達該段蛋白的報導。


以下將結合附圖對本發明作進一步說明圖1是分子生物學軟體對SARS病毒S蛋白的抗原表位進行分析結果。結果顯示，在SARS病毒的S蛋白N端從第162個胺基酸到第460個胺基酸，含有強的親水性抗原表位，即圖內箭頭標示的位置。
圖2是表達SARS病毒的S蛋白的重組質粒構建流程圖。
圖3是用1.2％的Agarose凝膠檢測5個重組子的PCR擴增產物。M低分子量DNA標準(TaKaRa，DL2000)；C含質粒pET28a(+)的對照菌；1～5∶5個轉化子均擴增出916bp的目的基因片段，即圖內箭頭標示的位置。
圖4是表達SARS病毒的S蛋白重組菌的SDS-PAGE分析結果。M低分子量蛋白標準(Pharmacia)；C對照菌E.coli BL21(DE3)；1～5∶1～5號重組菌，5個重組子均表達相對分子量約為37000的融合蛋白，即圖內箭頭標示的位置。
圖5是表達SARS病毒的S蛋白純化前後的SDS-PAGE分析結果。M低分子量蛋白標準(Pharmacia)；1對照菌BL21(DE3)；2表達PSARS病毒的S蛋白的工程菌；3S-Sepharose FF陽離子柱純化後的的SARS病毒的S蛋白。
2.分子生物學試劑限制性內切酶BamHI、EcoRI、及T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產品。質粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內回收DNA片段的試劑盒為德國QIAGEN公司產品。DTT及IPTG為Promega公司產品。其它試劑為進口或國產分析純試劑。
3.基因片段的合成由大連TaKaRa公司幫助合成。
4.基因克隆方法DNA的酶切、連接、電泳；質粒的提取、轉化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常規方法進行。其它試劑盒按說明書進行操作。
5.DNA序列分析用QIAGEN公司質粒純化試劑盒純化質粒，用DNA全自動測序儀測序。結果1.SARS病毒的S蛋白抗原表位篩選及基因片段的合成利用ANTHEWIN等軟體，通過計算機分析SARS病毒的S蛋白的全部胺基酸序列(GeneBank，接通號AY278488)，篩選出SARS病毒的S蛋白內的強抗原表位(圖1)，即從第162個胺基酸到第460個胺基酸，其胺基酸序列如下Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe LysHis Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys GlyTyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr AlaPhe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly TyrLeu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp AlaVal Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe GluIle Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp ValVal Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala ThrLys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala AspTyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val SerAla Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val ValLys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp TyrAsn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg AsnIle Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His GlyLys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe根據篩選的SARS病毒S蛋白內的抗原表位胺基酸序列，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，並且在5』端增加了BamHI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護鹼基(GT)，在3』端增加了終止密碼子(TAA)和EcoRI酶切位點(下畫線部分)及兩個保護鹼基(AC)，使該基因片段易於克隆至質粒pET28a(+)內的BamHI和EcoRI酶切位點內。化學合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)如下GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AACTTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTGAAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTGACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTTGGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACTGAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGCTTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAG CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGTGAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AACGCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTTGCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGCGTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTCGTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCTGAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACTCGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGTCAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC2.表達SARS病毒S蛋白片段重組質粒的構建提取質粒pET28a(+)(美國Novagen公司產品)，用BamHI和EcoRI雙酶切，電泳後回收酶切的質粒大片段，溶於去離子水內。同樣用BamHI和EcoRI雙酶切化學合成的SARS病毒S蛋白基因片段，電泳回收後，溶於去離子水內。
取等摩爾濃度的上述兩種酶切後DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連接，使SARS病毒S蛋白基因片段插入到載體pET28a(+)內的BamHI和EcoRI位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白(構建流程見圖2)。3.重組質粒的篩選與鑑定將上步連接的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，將轉化產物塗布含卡那黴素(60μg/ml)的固體LB培養基上，置37℃培養過夜。次日隨機挑選5個轉化子菌落(分別標記為1-5號)和1個對照菌(質粒pET28a轉化菌)，分別接種到含4ml液體LB培養基(含卡那黴素60μg/ml)的試管內，置37℃振蕩培養6h，取菌液1ml，離心收菌。分別用50μl去離子水懸浮菌體，沸水煮5min，離心(4℃，12000rpm)5min，取上清(內有質粒)2μl用作PCR模板，PCR擴增插入載體內的SARS病毒S蛋白基因片段，PCR反應濃度為質粒模板2μl、SARS病毒S蛋白基因片段的正鏈P1(GAATACATCTCTGACGCATTC)和負鏈引物P2(TTAGAACGGCACGTTAGAGAT)各1μl、10xBuffer 5.0μl、2.5mmol/L dNTP 4.0μl、Taq DNA聚合酶0.5μl(2.5U)、去離子水36.5μl，總體積50μl。擴增條件為94℃ 30秒、65℃30秒、72℃60秒，35個循環；最後72℃延伸7分鐘。取PCR擴增產物5μl，用1.2％的Agarose凝膠檢測，結果，5個轉化子均擴增出900bp的目的基因片段(見圖3)，而含質粒pET28a(+)的對照菌沒有擴增出該基因片段。初步證實，這5個轉化子均含有SARS病毒S蛋白基因片段。
提取1號重組子的質粒，測定質粒內的SARS病毒S蛋白基因序列，DNA序列分析證實，重組質粒含有合成的SARS病毒S蛋白基因片段，序列完全正確GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAACAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGCTAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCGATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCTTTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TACCTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCTGTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAGATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTTGTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACTAAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GATTAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCTGCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTTAAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TACAAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AACATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGCAAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA構建的重組質粒表達SARS的病毒S蛋白片段(299個胺基酸)，在其N端融合了載體上的34個胺基酸，全長333個胺基酸，其胺基酸序列如下Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Lys Val ProArg Gly SerHis Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Tyr Ile SerAsp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg GluPhe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro IleAsp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys LeuPro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro AlaGln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro ThrThr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys SerGln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys GlyIle Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe ProAsn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro SerVal Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val LeuTyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys LeuAsn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp AspVal Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys LeuPro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg ProPhe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe4.表達SARS病毒S蛋白工程菌的篩選鑑定將含有重組質粒的5個陽性轉化子和1個對照菌(質粒pET28a轉化菌)，接種至含3ml LB培養基(含卡那毒素60μg/ml)的試管內，37℃振蕩培養3h，加IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續振蕩培養誘導6h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量約為37 kD的SARS病毒S蛋白，表達量約為30％，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶(圖4)。
表達SARS病毒S蛋白的純化根據表達SARS病毒S蛋白的胺基酸序列，分析其理化特性，確定適當的純化方法。經計算機分析，表達SARS病毒S蛋白的等電點為pH8.5，因此我們決定在pH為8.0的Tris-HCl的緩衝液內，用DEAE-SepharoseFF陰離子純化，收集穿溜峰。然後再在pH為7.4的磷酸鹽緩衝液內，用S-SepharoseFF陽離子純化。具體步驟如下材料和方法1.主要試劑DEAE-SepharoseFF陰離子和S-SepharoseFF陽離子凝膠為Pharmacia公司產品，IPTG、DTT為Promega公司產品。其它試劑為國產或進口分析純試劑。2.表達SARS病毒的S蛋白的超聲裂解將培養的表達SARS病毒的S蛋白的工程菌離心(8000rpm，l0mins，4℃)，棄上清，菌體重懸於原培養液1/10體積的裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT)內，冰浴超聲破菌10mins，離心(12000rpm、20mins，4℃)收集上清，棄沉澱。收集的上清用於下一步的離子交換純化。3.DEAE-Sepharoe FF陰離子柱純化將DEAE-Sepharose FF陰離子柱(膠高20cm，直徑1.2cm)連接至Bio-Rad常壓層析系統，先用平衡液(50mmol/LTris-HCl pH8.0、1mmol/L EDTA、0.1mMmol/L DTT)衝洗平衡，然後將上步獲得的裂解上清直接上樣，上樣流速為1.5ml/min。收集穿過峰。4.S-Sepharose FF陽離子柱純化將上步DEAE-Sepharose FF陰離子穿過峰，裝入透析袋內，對pH7.4的磷酸鹽透析液(20mmol/L PB、1mmol/L EDTA、0.1mmol/L DTT)攪拌透析4h。用上述透析液衝洗平衡S-Sepharose FF陽離子柱，然後將透析後的穿過峰直接上樣，上樣流速1.5ml/min。上樣結束後用透析液充分洗柱，使記錄筆回至基線，再依次用含50、100、1000mmol/L NaCl的透析液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白進行SDS-PAGE檢測。結果將不同濃度NaCl從S-Sepharose FF柱上洗脫的蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示(見圖5)，SARS病毒的S蛋白僅存在於100mmol/L NaCl洗脫峰內，顯色一條很濃的SARS病毒的S蛋白帶(37kD處)，其它洗脫峰內無明顯SARS病毒的S蛋白帶。
純化SARS病毒的S蛋白的鑑定及應用將純化的重組人巨細胞病毒融合蛋白用作抗原，通過間接ELISA試驗方法，檢測抗SARS病毒抗體(IgM或IgG)陽性及陰性血清，以鑑定表達的SARS病毒S蛋白的抗原性和特異性。實驗結果顯示，該重組蛋白有很好的抗原性和特異性，可用作抗原檢測抗SARS病毒抗體。材料和方法1.抗SARS病毒抗體陽性血清及正常人血清GBI公司生產的抗SARS病毒抗體ELISA試劑盒內的陽性對照，及2份滅活的抗SARS病毒抗體陽性血清。正常人血清由本實驗室保存。
2.酶聯反應材料酶聯板為深圳產96孔板，辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗人μ鏈單克隆抗體購自Sigama公司。其它材料為酶聯反應的常規材料。
3.ELISA試驗採用間接ELISA檢測血清中的抗SARS病毒抗體(IgG或IgM)。基本步驟為用50mmol/L碳酸鹽溶液(pH9.6)稀釋SARS病毒的S蛋白包被酶聯板，每孔100μl，4℃過夜。次日用封閉液(10mmol/L磷酸鹽緩衝液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，5％蔗糖)封閉，每孔130μl，37℃1h(或4℃過夜)。將待測的抗SARS病毒抗體(IgG或IgM)陰、陽性血清，用樣本稀釋液(10mmol/L磷酸鹽緩衝液、pH7.4，10％山羊血清，20％小牛血清，0.5％casein，0.05％硫硫汞，0.5mmol/L NaCl)稀釋後(IgG 1∶20稀釋，IgM 1∶100稀釋)，分別加至封閉後的酶聯板孔內，每孔100μl，每個樣本加2孔，37℃反應30min，用PBST液(10mmol/L磷酸鹽緩衝液、pH7.4，0.5％吐溫-20)洗5遍後，加1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG或抗人μ鏈單抗，每孔100μl，37℃反應30min，PBST洗5遍，加底物TMB溶液100μl，37℃避光顯色10min，加50μl 4N硫酸混勻終止反應，用酶聯儀測定A450值。結果1.間接ELISA檢測血清中抗SARS病毒抗體(IgG或IgM)將純化的SARS病毒的S蛋白與已知不同濃度的牛血清白蛋白(第五部分)共同電泳、顯色後比較，確定純化的SARS病毒的S蛋白濃度約為1.5mg/ml。用50mmol/L碳酸鹽溶液(pH9.6)1∶1000稀釋後包被酶聯板，檢測已知2份抗SARS病毒抗體(IgG)陽性血清和1份抗SARS病毒抗體(IgM)陽性血清。結果顯示，2份抗SARS病毒抗體陽性血清均出現顯色反應，A450值分別為0.857和0.731。1份抗SARS病毒抗體(IgM)陽性血清也出現顯色反應，A450值為0.557。同時檢測了180份正常人血清，它們的A450值均小於0.05，說明SARS病毒的S蛋白有較好的抗原性和特異性。
化學合成的SARS病毒S基因片段序列表110李越希 陶開華120化學合成的SARS病毒S基因片段及其表達、應用16022101211299212PRT213SARS病毒的S蛋白片段220223含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，第162個胺基酸-第460個胺基酸，共299個胺基酸。4001Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly1 5 10 15Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe20 25 30Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu35 40 45Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly50 55 60Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala65 70 75 80Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu85 90 95Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr100 105 110Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser115 120 125Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe130 135 140Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn145 150 155 160Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val165 170 175Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser180 185 190Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val195 200 205Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp210 215 220Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln225 230 235 240Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met245 250 255Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr260 265 270Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg275 280 285Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe290 2952102211900212DNA213人工序列220221CDS222(1)...(897)223人工合成的全新基因片段，編碼SARS病毒S蛋白片段。220221mis-feature222(898)...(900)223合成基因時增加的終止密碼子。4002GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTC AAA CAC 60Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His1 5 10 15 20CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TAC AAG GGC TAC CAG 120Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln25 30 35 40CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG 180Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys45 50 55 60CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT 240Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala65 70 75 80CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC 300Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr85 90 95 100TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC 360Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn105 110 115 120CCA CTG GCT GAA CTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG 420Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln125 130 135 140ACC TCT AAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC 480Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn145 150 155 160CTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAG 540Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu165 170 175 180CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACC TTT TTC 600Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe185 190 195 200TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTG TGC TTC TCC AAC 660Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn205 210 215 220GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG 720Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln225 230 235 240ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG 780Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu245 250 255 260GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT 840Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg265 270 275 280TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA 900Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe285 290 29權利要求
1.一種化學合成的SARS病毒S蛋白的基因片段，該基因片段編碼含強抗原表位的SARS病毒的S蛋白片段，第162個胺基酸-第460個胺基酸，共299個胺基酸，其DNA序列如下GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTCAAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACTCTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCTATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCCTAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AACGGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAATGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTCCGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGCCCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAGCGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACCTTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTGTGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGTCAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACTTCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGTCCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA
2.權利要求1所述的化學合成的SARS病毒S蛋白的基因片段序列，利用基因工程技術表達該序列，具體方法如下SARS病毒S蛋白抗原表位的篩選通過計算機分析SARS病毒S蛋白的胺基酸序列，發現S蛋白的N端第162個胺基酸至第460個胺基酸含有較強的抗原決定簇，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，並且在5』端增加了BamHI酶切位點及兩個保護鹼基GT，在3』端增加了終止密碼子TAA和EcoRI酶切位點及兩個保護鹼基AC，使該基因片段易於克隆至質粒pET28a(+)內的BamHI和EcoRI酶切位點內。篩選的SARS病毒S蛋白內的抗原表位胺基酸序列，既第162個胺基酸至第460個胺基酸，共299個胺基酸Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn PheLys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val TyrLys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn ThrLeu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg AlaIle Leu Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala AlaTyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu AsnGly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu LysCys Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn PheArg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu CysPro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp GluArg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser ThrPhe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp LeuCys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val ArgGln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu ProAsp Asp Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala ThrSer Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu ArgPro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe化學合成的含SARS病毒S蛋白抗原表位基因的DNA序列(916bp)GTGGATCCGAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGTAAC TTC AAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TACGTT TAC AAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTTAAC ACT CTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTCCGC GCT ATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCTGCA GCC TAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GACGAA AAC GGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAACTG AAA TGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCTAAC TTC CGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AACCTG TGC CCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCATGG GAG CGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AACTCT ACC TTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AACGAC CTG TGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GACGTA CGT CAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAACTG CCG GAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GACGCT ACT TCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAACTG CGT CCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAAGAATTCAC表達SARS病毒S蛋白片段重組質粒的構建提取質粒pET28a(+)，用BamHI和EcoRI雙酶切，電泳後回收酶切的質粒大片段，溶於去離子水內，同樣用BamHI和EcoRI雙酶切化學合成的SARS病毒S蛋白基因片段，電泳回收後，溶於去離子水內；取等摩爾濃度的上述兩種酶切後DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連接，使SARS病毒S蛋白基因片段插入到載體pET28a(+)內的BamHI和EcoRI位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白；重組質粒的篩選與鑑定將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，塗布含60μg/ml卡那黴素的LB平板，置37℃過夜，次日隨機挑取轉化菌落和含質粒pET28a(+)的對照菌，分別提取質粒，以提取的質粒為模板，PCR擴增SARS病毒S蛋白基因片段，含SARS病毒S蛋白基因片段的陽性重組質粒，應擴增出長約916bp的基因片段，將含有外源基因的質粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質粒含有合成的SARS病毒S蛋白基因片段，序列完全正確GAA TAC ATC TCT GAC GCA TTC TCT CTG GAC GTT TCC GAA AAG TCT GGT AAC TTCAAA CAC CTG CGC GAG TTC GTG TTT AAA AAC AAA GAC GGT TTC CTG TAC GTT TACAAG GGC TAC CAG CCG ATC GAC GTA GTT CGT GAC CTG CCG TCT GGT TTT AAC ACTCTG AAA CCG ATC TTC AAG CTG CCG CTG GGT ATT AAC ATC ACT AAC TTC CGC GCTATC CTG ACT GCT TTC TCT CCG GCT CAG GAC ACT TGG GGC ACT TCT GCT GCA GCCTAC TTC GTT GGC TAC CTG AAG CCA ACT ACC TTT ATG CTG AAG TAC GAC GAA AACGGT ACT ATC ACT GAT GCT GTT GAC TGC TCT CAG AAC CCA CTG GCT GAA CTG AAATGC TCT GTT AAG AGC TTT GAG ATC GAC AAA GGT ATT TAC CAG ACC TCT AAC TTCCGT GTT GTT CCG TCT GGT GAC GTT GTG CGT TTC CCT AAC ATC ACT AAC CTG TGCCCG TTT GGT GAA GTT TTC AAC GCT ACT AAA TTC CCT TCT GTC TAC GCA TGG GAGCGT AAA AAA ATT TCT AAC TGC GTT GCT GAT TAC TCT GTG CTG TAC AAC TCT ACCTTT TTC TCT ACC TTC AAG TGC TAC GGC GTT TCT GCT ACT AAG CTG AAC GAC CTGTGC TTC TCC AAC GTT TAC GCA GAT TCT TTC GTA GTT AAG GGT GAT GAC GTA CGTCAG ATC GCT CCA GGT CAG ACT GGT GTT ATC GCT GAC TAC AAC TAT AAA CTG CCGGAC GAT TTC ATG GGT TGC GTT CTG GCT TGG AAC ACT CGT AAC ATT GAC GCT ACTTCT ACT GGT AAC TAC AAC TAC AAA TAT CGT TAC CTG CGT CAC GGC AAA CTG CGTCCG TTC GAA CGT GAC ATC TCT AAC GTG CCG TTC TAA構建的重組質粒表達SARS病毒S蛋白的299個胺基酸片段，在其N端融合了載體上的34個胺基酸，全長333個胺基酸，其胺基酸序列如下Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Lys Val ProArg Gly SerHis Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser Glu Tyr IleSer Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His LeuArg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly TyrGln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys ProIle Phe Lys Leu Pro Leu Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu ThrAla Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe ValGly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Glv Thr IleThr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys Ser ValLys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val ValPro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe GlyGlu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys LysIle Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe SerThr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe SerAsn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile AlaPro Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp PheMet Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr GlyAsn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe GluArg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe表達融合蛋白工程菌的篩選鑑定將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含卡那毒素60μg/mL的LB培養基內，37℃振蕩培養3h，加IPTG至終濃度0.5-1.0mmol/L，繼續振蕩培養誘導4-6h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測，重組子表達相對分子量約為37kD的SARS病毒S蛋白，表達量約為30％，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶；表達SARS病毒S蛋白的純化1)表達SARS病毒S蛋白工程菌的超聲裂解將誘導表達融合蛋白的工程菌離心收菌，菌體重懸於裂解液(50mmol/LTris-HCl pH8.0、10mmol/L EDTA、10mmol/L DTT)內，冰浴超聲破菌10min，離心收集上清，棄沉澱，收集的上清用於下一步的離子交換純化；2)DEAE-Sepharose FF陰離子柱純化將DEAE-Sepharose FF陰離子柱連接至常壓層析系統，先用Tris-HCl緩衝液衝洗，然後將上步獲得的裂解上清直接上樣，收集穿過峰；3)S-Sepearse FF陽離子柱純化將上步DEAE-Sepharose FF陰離子穿過峰，裝入透析袋內，對pH7.4的磷酸鹽透析液攪拌透析4h，用上述透析液衝洗平衡S-Sepharose FF陽離子柱，然後將透析後的穿過峰直接上樣，上樣結束後用透析液充分洗柱，用含梯度濃度的NaCl溶液洗脫蛋白，收集100mmol/L NaCl洗脫峰蛋白，即為純化的SARS病毒S蛋白；純化的SARS病毒S蛋白用作抗原檢測HCMV抗體將純化的SARS病毒S蛋白用碳酸鹽溶液倍比稀釋後包被酶聯板，間接酶聯免疫法檢測已知的抗SARS病毒陽性血清及正常人血清，SARS病毒S蛋白能與抗SARS病毒陽性血清反應，不與正常人血清反應，說明病毒的SARS病毒S蛋白有較好抗原性和特異性；同樣用辣根過氧化物酶標記SARS病毒S蛋白，用撲獲法檢測抗SARS病毒IgM或IgG抗體，有較高的敏感性和特異性，SARS病毒S蛋白用作抗原，用金標法檢測抗SARS病毒抗體，亦有較高的敏感性和特異性。
3.權利要求1所述的化學合成的SARS病毒S蛋白的基因片段序列，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進行重組表達、製備。
4.權利要求1所述的化學合成的SARS病毒S蛋白的基因片段表達的蛋白片段，用於疫苗、SARS病毒抗體或抗原的檢測及用於免疫製備抗SARS病毒單抗和多抗。
5.權利要求1所述的化學合成的SARS病毒S蛋白的基因片段序列，與其它基因片段連接，以融合蛋白的形式進行表達、製備。
全文摘要
本發明化學合成的SARS病毒S基因片段及其表達、應用涉及基因工程技術、疫苗和診斷試劑領域。本發明是通過計算機分析，篩選出SARS病毒的S蛋白內的強抗原表位，第162個胺基酸至第460個胺基酸，共299個胺基酸，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技術，表達該基因片段、製備SARS病毒S蛋白的強抗原表位片段。表達的SARS病毒S蛋白的強抗原表位片段可用於疫苗、SARS病毒抗體或抗原的檢測及用於免疫製備抗SARS病毒單抗和多抗等。
文檔編號G01N33/569GK1472321SQ03131879
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月13日 優先權日2003年6月13日
發明者李越希, 陶開華 申請人:李越希, 陶開華