抗人前列腺特異性膜抗原胞外區單鏈抗體及其應用的製作方法

2023-09-16 09:32:25

專利名稱：抗人前列腺特異性膜抗原胞外區單鏈抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程抗體，涉及一種抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的 人源性單鏈抗體及其在前列腺癌診斷和治療藥物開發中的應用。
背景技術：
前列腺癌是當今嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，對於它的早期診斷和治療， 尤其是轉移、復發灶的早期診斷和治療是人們難以攻克的醫學難題。隨著腫瘤免疫學和分 子生物學的不斷發展，尤其是噬菌體表面展示技術的不斷完善，為前列腺癌的早期診斷和 根治帶來了新的機遇。目前，抗前列腺癌抗體在國外正在進行臨床試驗，這些抗體基本上都 是人源化的鼠源性抗體。儘管人源化可以在很大程度上減少鼠源性抗體的免疫原性，但不 可能徹底去除其免疫原性，因而在臨床治療中不可避免地會導致中和抗體的出現從而降低 其治療價值。從前列腺癌患者構建的人源性單鏈抗體庫中直接篩選高親和力的單鏈抗體無 疑成為前列腺癌的早期診斷、導向治療藥物研究的重要手段。

發明內容
本發明的目的是利用噬菌體抗體庫技術篩選一種人前列腺特異性膜抗原(PSMA) 胞外區特異性人源性單鏈抗體。本發明的另一個目的是上述單鏈抗體在前列腺癌早期診斷和導向治療中的應用。 利用該特異性人源性單鏈抗體可以特異性的檢測人前列腺特異性膜抗原(PSMA)的表達水 平，作為診斷前列腺癌的一個標準；同時利用該人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異 性人源性單鏈抗體作為生物載體，結合優化的抗腫瘤藥物靶向輸送到前列腺癌細胞，定向 殺滅癌細胞，在前列腺癌的治療中發揮重要作用。本發明採用噬菌體表面展示技術，從前列腺癌患者外周血單個核細胞提取mRNA 並從中擴增出人的全套抗體可變區基因，然後裝配成單鏈抗體基因片段並克隆到噬粒載體 並轉化大腸桿菌構建成一個大庫容量的人源性單鏈抗體庫。然後用重組人前列腺特異性膜 抗原(PSMA)胞外區進行篩選得到其特異性的高親和力抗體。該抗體可在大腸桿菌中可溶 性表達，該抗體的胺基酸序列如下LPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSffHSSNAI
AWHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNWGDGIPDRF
SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTffGTGIH
VVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLQ
SGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHffVR
QAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTIS
RDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAA
RFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
該胺基酸序列被命名為SEQ ID NO1O
本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體的重鏈可 變區基因編碼124個胺基酸，序列如下EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYA
MHffVRQAPGKGLEffVAVMSYDGNNKYYADSVK
GRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCAR
DLDIAARFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
該胺基酸序列被命名為SEQ IDNO2。 本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體的輕鏈可 變區基因編碼112個胺基酸，序列如下L PVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSN A I
AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDR F
SGSSSGAERYLI ISSLQSEDEADYYCQTffGTG I H
VVFGGGTKLTVL
該胺基酸序列被命名為SEQ ID NO :3。
本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體由X753個核苷酸核且成，其序列如下
CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC
TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA
GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC
AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGC
AGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT
ATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGA
GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGG
GACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體:重鏈可變區由372個核苷酸組成，其序列如下
GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAG
ACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCG
CCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATA
ATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCC
AAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATA
TTACTGTGCGAGA GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGT
CTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排後形成的具有單一開放讀框的功能性可變區基 因。其中CDR3的核苷酸序列為GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGT TTC，胺基酸序列為DLD I A A R F，由IGHD6-6和該抗體特有的序列組成。本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區由339個核苷酸組成，其序列如下CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAGCTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACTGCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACAACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGTTACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排後形成的具有單一開放讀框的功能性可變區基因。其 中CDR3的核苷酸序列為CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，胺基酸序列為Q TW G T G I。本發明的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體可在前列腺 癌診斷和治療藥物開發中應用。噬菌體抗體庫技術無需經過雜交瘤技術，甚至無需經過免疫過程即可直接獲得特 異性的高親和力抗體分子。單鏈抗體具有分子量小，穿透性強，半衰期短的優勢，是理想的 腫瘤復發和遠處轉移的診斷試劑，也可以為導向藥物治療提供導向作用。而將篩選到的單 鏈抗體改造成全抗體後就會具有半衰期長，可直接介導補體及細胞免疫(ADCC)殺傷腫瘤 作用。因此，本發明中的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體在前 列腺癌的早期診斷和導向治療中具有重要的價值。本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體可在噬菌 體表面呈現表達，也可以在大腸桿菌中可溶性表達。經蛋白電泳和Western blot證實，IPTG 誘導後表達的可溶性單鏈抗體分子量約為30kD。經ELISA和流式細胞儀分析表明該抗體 與重組人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區蛋白的親和力為Kd = 0. 2nM ；該抗體不僅可 以結合重組的PSMA胞外區，而且可以結合表面表達PSMA的NEK293細胞及前列腺癌細胞系 LNCaP。這為利用該抗體進行前列腺癌影像診斷和導向治療奠定了基礎。


圖1是本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體的 純化；泳道1 :Marker ；泳道2 流穿液；泳道3 第一遍洗滌；泳道4 第二遍洗滌；泳道5 純化的單鏈抗體。圖2是本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體與 重組人PSMA胞外區親和力測定。圖3是本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體與細胞表面表達的天然PSMA結合活性的鑑定；A 只用抗V5-APC染NEK293細胞；B 用本發明的單鏈抗體和抗V5-APC染NEK293 細胞；C 只用抗V5-APC染PSMA轉染的NEK293細胞；D 用本發明的單鏈抗體和抗V5-APC 染PSMA轉染的NEK293細胞；E 只用抗V5-APC染LNCaP細胞；F 用本發明的單鏈抗體和抗 V5-APC 染 LNCaP 細胞。
具體實施例方式下面對本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體的 實施例進行詳細說明。實施例(一)淋巴細胞的分離收集50位前列腺癌患者的外周血共500ml，加入等體積的淋巴細胞分離液離心分 層，2500g，10min。小心吸取中層淋巴細胞，離心，2500g，lOmin。棄上清，用lmlTrizol/5ml 外周血裂解淋巴細胞，至溶液徹底透明為止。-80°C保存。(二)RNA 的提取取_70°C保存的淋巴細胞裂解液融化至室溫，加入0. 2ml氯仿/mlTrizol，votex振 蕩15s，室溫靜置3min，12000g，5min。吸上層清亮水相，注意勿混入中層蛋白及DNA層。加 Λ 0. 5ml 異丙醇 /ml Trizol，顛倒混勻，_20°C沉澱 30_60min，12000g 離心 IOmin0 保留沉 澱，70%的乙醇洗滌一遍，空氣中晾乾，DEPC水溶解沉澱RNA。(三)mRNA的純化純化步驟為本領域的慣常技術，按(美國OMEGA)試劑盒說明書進行.(四)反轉錄取13yg mRNA於70°C保溫lOmin，使其打開二級結構，然後迅速置於冰上，按說明 書依次加入各試劑，隨機6聚體進行反轉錄。室溫靜置IOmin使引物延伸，然後42°C 60mi 進行反轉錄，最後95°C 5min滅活反轉錄酶，冰浴5min，-20°C保存。(五)全套可變區基因擴增將反轉錄產物分成3份作為模板進行第一輪PCR，將VH、VL、VK的3』端引物分 別混合後與5』端各引物分別進行擴增。反應條件為94°C 5min熱啟動，94°C Imin變性， 55 0C Imin退火，72°C Imin延伸，共35cycles。最後進一步延伸7min。反應體系為100μ1。 將第一輪PCR的產物VH混合，VL和VK以1 2混合，分別作電泳純化回收，100倍稀釋後 作為第二輪PCR反應的模板進行第二輪PCR反應引入更長的保護序列及重疊延伸序列，條 件為:94°C 5min熱啟動，94°C Imin變性，55°C Imin退火，72°C Imin延伸，共25循環。反應 體系為100 μ 1。(六)scFv(單鏈抗體)片斷的隨機拼接及擴增將VH、VL和VK基因片斷分別行2%的瓊脂糖凝膠電泳分離、回收，然後按 VH VK VL Llinker = 3 2 1 3的比例混合進行重疊延伸以裝配scFv片斷， 條件為94°C Imin變性，55°C Imin退火，72°C Imin延伸，共7個循環。將重疊延伸產物行 1 100稀釋，以此作模板，以VL 5』端和VH 3』端的保護序列為引物擴增scFv片斷，PCR 反應條件是94°C 5min熱啟動，94°C Imin變性，65°C Imin退火，72°C Imin延伸，10個循環後，再將退火溫度降到58°C後進行15個循環。PCR產物即為單鏈抗體基因片斷，用1.5%的 瓊脂糖凝膠回收。(七)scFv與噬粒載體的連接及單鏈抗體庫的製備1.電轉化感受態的製備從M9平板上挑取TGl單克隆搖菌過夜，1 100轉接於500ml LB，振搖2. 5h，OD6tltl 的值在0. 5-0. 6之間，離心收菌，3000rpm, IOmin0用等體積的冰冷ImM的HEPES洗滌兩遍， 3000rpm, lOmin，用1/10體積的冰冷10%甘油洗滌兩遍，4000rpm，lOmin，用與沉澱等體積 的冰冷10%甘油重懸沉澱，每管50μ 1於-80°c保存。注感受態製備均在0-4°C進行。2.單鏈抗體庫的製備將上述純化的單鏈抗體基因片段用Sfi I/Not I酶切，並與經相同酶切開的噬粒 載體PCANTAB5E連接。將連接產物於70°C孵育IOmin滅活T4DNA連接酶，然後電轉化大腸 桿菌TGl。將轉化後的細菌塗布到含葡萄糖和100mg/L氨苄的2YT平板上，30°C培養過 夜，次日用含15%甘油的2YT將克隆刮下來凍存到-80°C保存。3.抗體庫的噬菌體表面呈現接種3X IOiq的細菌抗體庫於1500ml 2YTGA(2YT+1 %葡萄糖+amp)中，37°C振搖 至0D600 = 0. 5。取150ml (0D600 = 0. 1的細菌濃度是8 X IO7)用輔助性噬菌體M13K07以 20 1的比例於37°C靜置水浴30min進行感染。然後3300g，IOmin室溫離心，棄上清，將細 菌沉澱再分別接到30°C預熱的1500ml的2YTGAK(2YT+1 %葡萄糖+amp+kan)中，30°C振搖 過夜(應達到12小時)。次日，IOmin離心(4°C )，收上清。在上清中加入1/5體積的PEG/ NaCl (20%的PEG6000，2. 5M的NaCl)，混勻，4°C靜置1小時以上沉澱噬菌體。然後IOOOOrpm 於4°C離心15min，收集噬菌體沉澱並重懸於5ml PBS中。IOOOOrpm再次離心15min，取上 清(沉澱為殘留的細菌碎片及PEG)，放於4°C備篩庫用。同時取Iul倍比稀釋進行滴度分 析。(八)噬菌體抗體庫滴度測定從M9培養基上挑取TGl單克隆於5ml 2YT，振搖過夜。取0. 5ml過夜菌接種於50ml 2YT (100ml三角燒瓶)中，37°C振搖至0D600 = 0. 2。將噬菌體抗體庫做十倍倍比稀釋，從 各個稀釋度各取10 μ 1加入到200 μ 1 0D600 = 0. 2的TGl中，混勻，37°C水浴30min。將這 200 μ 1細菌和噬菌體的混合液塗布到含氨苄的2ΤΥ瓊脂平板上。倒置放於37°C，第二天根 據克隆數計算噬菌體庫的滴度。(九)輔助性噬菌體M13K07的製備從M9培養基上挑取TGl單克隆於5ml 2YT，振搖過夜。取0. 5ml過夜菌接種於 50ml2YT (100ml三角燒瓶)中，37°C振搖至0D600 = 0. 2。將M13K07十倍倍比稀釋，從各 個稀釋度各取10 μ 1加入到200 μ 1 0D600 = 0. 2的TGl中，混勻，37°C水浴30min。將這 200 μ 1細菌和噬菌體的混合液加入到3ml不燙手的上層瓊脂膠中，稍微晃一下，立即倒入 37°C預熱的用2TY配製的瓊脂平板上。倒置放於37°C，第二天可出現噬斑。挑取單個噬斑 接種於3-4ml 0D600 = 0. 5的TGl中(製備方法同前，即前一晚從M9上挑克隆，搖菌過夜， 第二天1 100轉接於50ml 2YT中，振搖約2-2. 5小時)，37°C振搖2小時。將這3_4ml 感染了 M13K07的TGl接種於500ml 2YT中，37°C振搖1小時。加入卡那(50-70 μ g/ml)， 繼續於37°C振搖8-16小時，IOOOOrpm,離心15min，收上清。上清中加入1/5體積的PEG/NaCl(20%&PEG6000，2. 5M 的 NaCl)，混勻，4°C靜置 1 小時以上，lOOOOrpm，離心 15min。用 20ml含15%甘油的PBS重懸噬菌體，lOOOOrpm，離心15-20min，收集上清(沉澱為細菌碎片 及PEG)。噬菌體溶液經0. 45 μ m濾膜過濾消毒後分裝，凍存於_80°C，同時用噬斑的方法測 其滴度。(十)特異性抗體的篩選用5ml 50ug/ml的抗原(第一輪)包被25cm2培養瓶，4°C過夜(包被液為200mM 的碳酸氫鈉緩衝液，PH9. 6)，第二輪以後包被的抗原濃度降低到5ml lOug/ml。PBST洗滌 後加入5ml含1 X IO14噬菌體的4% MPBS,脫色搖床上輕晃30min後室溫水平放置90min以 上進行抗原抗體的結合。然後用PBS和PBST各洗20遍，最後將生長至對數生長期的IOml TGl加入培養瓶並於30°C水浴30min讓結合於抗原的噬菌體感染TG1。被感染的TGl經離 心後塗布於15cm 2YTGA平板上，30°C過夜。再用輔助性噬菌體超感染的方法從被感染並擴 增了的TGl製備噬菌體，進行第二輪篩選。如此反覆進行「吸附_洗脫_感染_繁殖」的篩 選過程共4輪。(十一)單克隆噬菌體抗體抗原結合活性的鑑定1.單克隆噬菌體抗體的製備從最後一輪篩選的板子上挑選單個克隆於裝有2YTGA的96孔培養板中，37°C振搖 過夜，次日1 100轉接於新的2YTGA中，37°C振搖2. 5小時，用M13K07以20 1的比例進 行超感染，3500轉，離心lOmin，用200ul 2YTGAK重懸細菌沉澱，30°C振搖過夜。次日11000 轉離心15min，取上清進行phage ELISA鑑定。2. Phage ELISA鑑定抗原抗體結合活性用PSMA於4°C過夜包被ELISA板，每孔50ul，濃度為lug/ml。次日用含5%脫脂奶 粉的PBS加滿孔室溫封閉2小時，PBST洗5遍，用含2%脫脂奶粉的PBS稀釋抗體，將稀釋 好的抗體室溫放置30分鐘。用PBST洗板6次然後加入抗體200ul，室溫孵育2小時，PBST 洗板，6次。加入HRP標記的抗M13噬菌體的抗體200ul，稀釋度為1 5000。室溫孵育1 小時，PBST洗板8次後加TMB顯色·(十二)可溶性單鏈抗體的表達陽性噬菌體需要感染HB2151才能進行可溶性表達。陽性克隆的噬菌體作10或 100倍倍比稀釋後過0. 45的濾膜(過濾膜這一步是為了去除混雜在噬菌體裡的TGl大腸杆 菌.TGl比HB2151有生長優勢，所以要去掉它)，取稀釋好的10 μ 1去感染200 μ 1對數生長 期的ΗΒ2151。方法如下生長於Μ9培養基上的ΗΒ2151單克隆於5ml2YTG中，次日1 100 轉接於50ml 2YTG，37°C振搖至0D600 = 0. 5。加入10 μ 1經濾過的、倍比稀釋過的噬菌體， 混勻，37°C水浴30min。鋪塗有奈定酮酸和氨苄的2YTG瓊脂板，37°C過夜。挑單克隆於5ml 2YTGA(含葡萄糖)中，37°C搖過夜。次日1 100轉接於50ml含0. 1 %葡萄糖的2YTGA 中，37°C振搖至0D600 = 0. 9 (大約3小時40分)，加入IPTG至終濃度為ImM，30°C振搖過 夜，取上清做行聚丙烯醯氨凝膠電泳分析表達情況，用ELISA鑑定可溶性表達的單鏈抗體 的抗原結合活性。(十四)可溶性單鏈抗體的純化由於單鏈抗體是與6個組氨酸的標籤融合表達的，所以可溶性表達上清可以用鎳 柱進行親和純化，具體步驟為用PBS平衡親和柱，樣品上柱，50mM的咪唑洗脫非特異的結合蛋白，500mM的咪唑洗脫下結合於鎳柱上的單鏈抗體，用分子篩去除咪唑，緩衝液置換為 PBS0 (見圖 1)(十五)可溶性單鏈抗體的親和力鑑定用lug/m 1和0. 5ug/ml兩種不同濃度的PSMA包被ELISA板，然後加入從lug/ml 到lpg/ml十倍倍比稀釋的純化過的單鏈抗體，然後加入抗V5-HRP抗體(單鏈抗體與V5標 籤融合表達)，最後用TMB顯示。根據ELISA讀數繪製親和力曲線，然後求出0D50時Iug/ ml和0. 5ug/ml PSMA對應的抗體濃度，分別記為[Ab](對應於lug/ml PSMA)和[Ab] 』 (對 應於0. 5ug/ml PSMA)，然後用公式Kd = 2[Ab]，-[Ab]計算單鏈抗體的親和力。(見圖2)(十六)可溶性抗體與細胞表面表達的天然PSMA結合活性的鑑定由於重組PSMA的構象可能不同於表達於前列腺癌細胞表面PSMA的天然構象，所 以具有與重組PSMA結合活性的scFv可能並不能結合表達於細胞表面的PSMA。因而為了 鑑定我們篩選到的單鏈抗體與天然表達於細胞表面PSMA的結合活性，我們用流式細胞技 術對該抗體與NEK293細胞，轉染了 PSMA的NEK293細胞及前列腺癌細胞系LNCaP的結合活 生進行了比較。方法是將該抗體與上述三種細胞孵育1小時，對照組不加該抗體，然後用抗 V5-APC抗體染色，最後用流式細胞儀比較APC信號的強弱。(見圖3A-F)
0108]需要說明的是，本發明提供的附圖1是在凝膠成像儀下採集的圖片，圖3A-F是流 式細胞儀檢測後自動生成的圖片，為醫學研究最清晰的圖片。
0109]以上實施例中未作詳細敘述部分屬於本行業或相關行業的公知技術，採用的設備 是行業慣例設備。
0110]序列表
0111]USEQ ID :1ο
0112]序列
0113]LPVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSNAI
0114]AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDRF
0115]SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTGIH
0116]VVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLQ
0117]SGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYAMHffVR
0118]QAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTIS
0119]RDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAA
0120]RFHYCAMDVffGQGTAVTVSS
0121]由753個核苷酸組成，其序列如下
0122]CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
0123]CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
0124]GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
0125]ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
0126]TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
0127]TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
0128]CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC
0129]TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA
GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA2, SEQ ID NO 20序列EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFS NYAMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTISR DN SKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDlAARFHYCAMDVffGQGTAVTVSS由372個核苷酸組成，其序列如下GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排後形成的具有單一開放讀框的功能性可變區基 因。其中CDR3的核苷酸序列為GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGT TTC，胺基酸序列為D L D I A A R F，由IGHD6-6和該抗體特有的序列組成。
0151]3, SEQ ID NO 3
0152]序列
0153]LPVLTQSPSASASLGASVKLTC TLSSffHSSNAI
0154]AffHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNffGDGIPDRF
0155]SGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTGIH
0156]VVFGGGTKLTVL
0157]由339個核苷酸組成，其序列如下
0158]CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG
0159]CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT
0160]GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA
0161]ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT
0162]TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC
0163]TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG
0164]C
0165]本發明的人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變區由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排後形成的具有單一開放讀框的功能性可變區基因。其 中CDR3的核苷酸序列為CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，胺基酸序列為Q TW G T G I。
權利要求
一種抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體，起特徵在於該單鏈抗體的胺基酸序列為SEQ ID；1該抗體的胺基酸序列如下L P V L T Q S P S A S A S L G A S V K L T C T L S S W H S S N A IA W H Q L R P E K G L R Y L M K V N S D G S H N W G D G I P D R FS G S S S G A E R Y L I I S S L Q S E D E A D Y Y C Q T W G T G I HV V F G G G T K L T V L G G G G S G G G G S G G G G S E V Q L L QS G G G V V R P G R S L R L S C A A S G F T F S N Y A M H W V RQ A P G K G L E W V A V M S Y D G N N K Y Y A D S V K G R F T I SR D N S K N T L Y L Q M S S L R A G D T A V Y Y C A R D L D I A AR F H Y C A M D V W G Q G T A V T V S S
2.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體， 其特徵在於該抗體的重鏈可變區按技術序列為SEQ ID NO :2，序列如下EVQLLQSGGGVVRPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMHWVRQAPGKGLEWVAVMSYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAGDTAVYYCARDLDIAARFHYCAMDVWGQGTAVTVSS
3.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體， 其特徵在於該抗體的輕鏈可變區按技術序列為SEQ ID NO :3，序列如下LPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSWHSSNA IAWHQLRPEKGLRYLMKVNSDGSHNWGDGIPDR FSGSSSGAERYLIISSLQSEDEADYYCQTWGTG I HVVFGGGTKLTVL
4.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體， 其特徵在於所述人源性單鏈抗體由X753個核苷酸組成，其序列如下 CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAG CTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACT GCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACA ACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGT TACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACC TGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGG CGGTGGCGGATCTGGCGGAGGTGGCTCCGGAGGTGGCGGTTCTGAGGTGCAGCTGC TGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGC AAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGC AGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGT ATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGA GATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGG GACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
5.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體， 其特徵在於所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區由372個核苷酸組成，其序列如下GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCGGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGTCATATGATGGAAATAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCTGGGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGATCTGGATATAGCAGCTCGTTTCCACTACTGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACTGCGGTCACCGTCTCCTCA
6.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體， 其特徵在於所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體重鏈可變 區由GHV3-30，IGHD6-6和IGHJ6基因重排後形成的具有單一開放讀框的功能性可變區基 因；其中CDR3的核苷酸序列為GAT CTG GAT ATA GCA GCT CGTTTC，胺基酸序列為DLDI A A R F，由IGHD6-6和該抗體特有的序列組成。
7.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體， 其特徵在於所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區由339個核苷酸組成，其序列如下CTGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCTGCCTCTGCCTCCCTGGGAGCCTCGGTCAAGCTCACCTGCACTCTGAGCAGTTGGCACAGTAGCAACGCCATCGCATGGCATCAACTGCGGCCAGAGAAGGGCCTTCGATATTTGATGAAAGTTAACAGTGATGGCAGCCACAACTGGGGAGACGGGATCCCTGATCGCTTCTCAGGCTCCAGCTCTGGGGCTGAGCGTTACCTCATCATCTCCAGCCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGACCTGGGGCACTGGCATTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC
8.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體， 其特徵在於所述人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區特異性人源性單鏈抗體輕鏈可變 區由IGLV4-69和IGLJ3基因片段重排後形成的具有單一開放讀框的功能性可變區基因；其 中CDR3的核苷酸序列為CAG ACC TGG GGC ACT GGC ATT，胺基酸序列為Q T W G T G I。
9.根據權利要求1所述的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區的人源性單鏈抗體 在前列腺癌診斷和治療藥物開發中的應用。全文摘要
本發明的抗人前列腺特異性膜抗原(PSMA)胞外區單鏈抗體是採用噬菌體展示技術，以前列腺癌患者的外周血單個核細胞為原料構建的大庫容量的單鏈抗體庫通過先鬆弛後嚴謹的篩選富集得到的。該抗體可在大腸桿菌中可溶性表達，與前列腺特異性膜抗原胞外區的親和力達到Kd＝0.2nM。該抗體不僅可以結合重組的PSMA胞外區，而且可以結合表面表達PSMA的NEK293細胞及前列腺癌細胞系LNCaP。這為利用該抗體進行前列腺癌影像診斷和導向治療奠定了基礎。
文檔編號C07K16/28GK101891818SQ20091002093
公開日2010年11月24日 申請日期2009年1月16日 優先權日2009年1月16日
發明者溫偉紅, 秦衛軍, 董青川, 趙愛志 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學