一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法和裝置的製作方法

2023-09-16 14:35:00

專利名稱：一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法和裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及超分辨顯微領域，尤其涉及一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法和裝置。
背景技術：
由阿貝衍射極限理論可知，光束經一般透鏡聚焦後所成光斑的尺寸用半高全寬可
以表示為Ar = 4，其中λ為入射光束的波長，NA為所用透鏡的數值孔徑，因此常規遠 2ΝΑ
場螢光顯微鏡的極限解析度一般被限制在了半波長左右。為了突破阿貝衍射極限的限制，使得螢光顯微鏡可以在遠場實現超分辨顯微，科研人員們提出了多種超分辨顯微方法。其中，受激發射損耗顯微術(STED stimulatedEmission Depletion Microscopy)目前的發展最為成熟,應用最為廣泛。在STED顯微方法中，當激發光使其所成光斑範圍內的螢光分子躍遷到激發態後，損耗光(STED光，一般為中空型光斑)使得其中處於激發光斑邊緣部分的螢光分子通過受激發射作用回到基態，從而大大減小了實際有效螢光的發光面積，實現了超衍射極限的解析度。目前，在STED顯微方法中，一般將激發光和STED光均設置為圓偏振光，以獲得較高的受激發射損耗效率。然而，經研究發現，切向偏振光型的激發光和STED光同樣可以用於STED顯微方法中實現超分辨顯微，並且在相同的條件下，這種方法可以實現更高的解析度。公開號為101907766A的中國專利公開了一種基於切向偏振的超分辨突光顯微方法和裝置，包括將第一光源發出的用於激發螢光樣品產生螢光的激發光(第一雷射光束)經第一切向偏振轉換器轉換為切向偏振光，通過(Γ2 π渦旋位相板位相編碼後投射到螢光樣品上形成激發光斑；將第二光源發出的用於抑制螢光樣品發出螢光的受激發射損耗光(第二雷射光束)經第二切向偏振轉換器轉換為切向偏振光後投射到位於納米平臺上螢光樣品上形成中心點與激發光斑中心點重合的聚焦光斑；收集螢光樣品發出的螢光，經探測成像系統處理後得到相應的顯微圖像。

發明內容
本發明提供了一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法和裝置。當採用與現有技術的STED顯微方法相同的STED光強時，本發明可以實現更高的解析度。—種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法，包括將第一雷射光束和第二雷射光束分別轉換為第一切向偏振光和第二切向偏振光；所述第一切向偏振光經相位調製後投射到突光樣品上形成激發光斑；所述第二切向偏振光分解為第一工作光束和第二工作光束，所述第一工作光束和所述第二工作光束分別進行相位調製形成第一 STED光束和第二STED光束，所述第一 STED光束和所述第二 STED光束經顯微物鏡投射到螢光樣品上通過非相干疊加形成相應的STED光斑，該STED光斑的中心點與所述激發光斑的中心點重合得到、聚焦光斑；收集螢光樣品在該聚焦光斑作用下發出的螢光，經處理後得到相應的顯微圖像。所述的第一雷射光束進行相位調製的調製函數Zi(Ap)為./I(氏爐)=P，所述Θ
為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，所述的P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。第一雷射光束經第一位相板的調製作用，所形成的激發光束經顯微物鏡投射後在待測螢光樣品上呈現為一個實心光斑。所述的第一工作光束進行相位調製的調製函數f揪φ)為
、 ο ,^Q<e<θ3 ^θΑ<θ<αΜ
,m咖觀<Θ<Θα時』所述9為入射光束垂直光軸 剖面內各點所對應的孔徑角，所述的口為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角，θ」 θ2、θ3、04均為對應的位相板的結構參數，所述α為由顯微物鏡的數
fJA
值孔徑NA所決定的最大孔徑角，a = arcsin (-)，η為待測滅光樣品周圍介質的折射率。
η
第一工作光束經第二位相板的調製作用，所形成的第一 STED光束經顯微物鏡投射後在待測螢光樣品上呈現為一個橫向(xy平面)中空型光斑，在該第一 STED光斑中，電矢量的X分量主要集中於I軸附近，而電矢量的I分量主要集中於X軸附近。優選的，所述顯微物鏡的數值孔徑NA=L 4，所述位相板的結構參數θρ θ2、θ3、θ 4分別為θ 1=0. I、θ 2=0- 4、θ 3=0- 62、θ 4=0. 77。當位相板的結構參數按上述方式設置時，本發明可以實現最佳的分辨效果。所述的第二工作光束進行相位調製的調製函數fM(p)為
π，^|0<φ<φ< — 0'J'
Αθ,φ) = \2 3 2 ，所述θ為入射光束垂直光軸剖面內各
O，當一〈匆或一<φ<2π^
、 2 2
點所對應的孔徑角，所述的P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。第二工作光束經第三位相板的調製作用，所形成的第二 STED光束經顯微物鏡投射後在待測突光樣品上同樣呈現為一個橫向中空型光斑，在該第二 STED光斑中，電矢量的X分量主要集中於X軸附近，電矢量的I分量主要集中於I軸附近。一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置，包括沿第一光路依次布置的第一光源、第一切向偏振轉換器和第一位相板；沿第二光路依次布置的第二光源、第二切向偏振轉換器；用於承載螢光樣品的納米平移臺；用於將所述第一光路和第二光路的光線投射至螢光樣品的投射裝置；檢測所述螢光樣品發光的探測成像系統；在所述第二切向偏振轉換器與投射裝置之間依次設有用於將所述第二切向偏振轉換器的出射光分解為第一工作光束和第二工作光束的第一分光稜鏡；用於將所述第一工作光束和所述第二工作光束分別進行相位調製的第二位相板和第三位相板；
用於匯聚所述第二位相板和第三位相板的出射光的第二分光稜鏡。所述第一位相板為(Γ2 π渦旋位相板,其對應的調製函數為/ {θ,φ) = φ,
所述Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，所述的P力入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。第一雷射光束經第一位相板的調製作用，所形成的激發光束經顯微物鏡投射後在待測螢光樣品上呈現為一個實心光斑。所述第二位相板為0/ π位相板，其對應的調製函數f抓φ)為
[O . 'iIO <θ<θ·. ,^es θ< θ,\!^β, <θ<αλ^\
越的、所述θ為入射光束垂直光軸剖面內
各點所對應的孔徑角，所述的P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角，θρ θ2、θ3、04均為對應的位相板的結構參數，所述α為由顯微物鏡的數值孔徑
MA
NA所決定的最大孔徑角，a = arcsin (——)，η為待測突光樣品周圍介質的折射率。第一工
η
作光束經第二位相板的調製作用，所形成的第一 STED光束經顯微物鏡投射後在待測螢光樣品上呈現為一個橫向(xy平面)中空型光斑，在該第一 STED光斑中，電矢量的X分量主要集中於I軸附近，而電矢量的I分量主要集中於X軸附近。所述第三位相板為四象限型O/π位相板，其對應的調製函數_/；(民妁為
π，當0<爐<令或;^爐<與時
/3(^>^) = 1'，所述Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點
O，當_ <φ< 難i戈—<φ < 2η 時、 2 2
所對應的孔徑角，所述的P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾
角。第二工作光束經第三位相板的調製作用，所形成的第二 STED光束經顯微物鏡投射後在待測突光樣品上同樣呈現為一個橫向中空型光斑，在該第二 STED光斑中，電矢量的X分量主要集中於X軸附近，電矢量的I分量主要集中於I軸附近。在所述第一光源與所述第一切向偏振轉換器及所述第二光源與所述第二切向偏振轉換器之間依次設有用於對光束進行準直作用的單模光纖和準直透鏡。保證相應的光源所發出的雷射光束在轉換為切向偏振光之前為準直光束。本發明的工作原理如下在本發明的受激發射損耗顯微方法中，當第一雷射光束在螢光樣品上使其所成光斑範圍內的螢光分子躍遷到激發態後，中空型的STED光斑通過受激發射作用使得激發光斑邊緣部分中的螢光分子回到基態，從而抑制了這部分螢光分子發射螢光。這樣，只有位於激發光斑中心部分的突光分子最終可以發出突光，由此實際有效突光的發光面積大大減小，解析度得以提高。然而，STED光束的這種消光能力與螢光分子的分子指向有關。研究表明，只有當STED光束的偏振方向和螢光分子的分子指向一致時，STED光束的消光能力才達到最強。在本發明中，由於第一位相板的調製作用，第一雷射光束經顯微物鏡投射後在待測螢光樣品上呈現為一個實心光斑，該實心激發光斑使得其光斑範圍內的具有不同指向的螢光分子被激發。需要注意的是，由於切向偏振光的特殊聚焦特性，其所成聚焦光斑中的電矢量將不具有Z分量，因此，僅有分子指向位於xy平面內的螢光分子被激發。同時，由於第二位相板的調製作用，第一 STED光束經顯微物鏡投射後在待測螢光樣品上呈現為一個橫向(xy平面)中空型光斑。在該第一 STED光斑中，電矢量的X分量主要集中於I軸附近，而電矢量的I分量主要集中於X軸附近。因此，如果只有第一 STED光束單獨作用，此時對於位於I軸附近，分子指向具有I分量的螢光分子以及於X軸附近，分子指向具有X分量的螢光分子並不具備很好的消光效果。引入第二 STED光束可以解決這一問題。由於第三位相板的調製作用，第二 STED光束經顯微物鏡投射後在待測螢光樣品上同樣呈現為一個橫向中空型光斑，並且在該光斑中，電矢量的X分量主要集中於X軸附近，電矢量的I分量主要集中於I軸附近。因此，當所述第一 STED光斑和第二 STED光斑在螢光樣品上通過非相干疊加形成橫向中空型的合STED光斑進行作用時，對於各處不同指向的螢光分子均能實現較好的消光效果。同時，由於所用切向偏振光特有的聚焦特性，它所形成的STED中空型光斑與由常 規圓偏振光所形成的相比收斂更快，因此在相同的STED光強下，有效螢光的發光面積可以被壓縮得更小，從而實現比已有技術更高的解析度。相對於現有技術，本發明具有以下有益的技術效果(I)在相同的工作光強下，可以實現更高的解析度；(2)可以在更低的工作光強下，實現與現有技術相同的解析度，從而降低樣品的漂白，避免了對樣品的損壞。


圖I為本發明的一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置示意圖；圖2為本發明中所用第一位相板的示意圖；圖3為本發明中所用第二位相板的示意圖；圖4為本發明中所用第三位相板的示意圖；圖5為本發明中所生成的激發光斑的橫向歸一化光強分布曲線圖；圖6為本發明中所生成的合STED光斑與常規圓偏振光所生成的STED光斑的橫向歸一化光強分布曲線比較示意圖；圖7為本發明中有效突光光斑與相同功率圓偏振光條件下的有效突光光斑的橫向歸一化光強分布曲線比較示意圖。
具體實施例方式如圖I所不,一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置,包括第一雷射器1，第二雷射器2,第一單模光纖3,第二單模光纖4,第一準直透鏡5,第二準直透鏡6,第一切向偏振轉換器7，第二切向偏振轉換器8,第一分光稜鏡9,第一位相板10,第二位相板11,第三位相板12，第一反射鏡13，第二反射鏡14，第二分光稜鏡15，第一二向色鏡16，第二二向色鏡17，顯微物鏡18，納米平移臺19，帶通濾波片20，場鏡21，探測器22。投射裝置包括第一二向色鏡16，第二二向色鏡17和顯微物鏡18。探測成像系統由第一二向色鏡16，第二二向色鏡17，顯微物鏡18，納米平移臺19，帶通濾波片20，場鏡21和探測器22組成。其中，第一單模光纖3和第一準直透鏡5位於第一雷射器I發出的第一雷射光束的光軸上，並對所述第一雷射光束進行準直處理；第一切向偏振轉換器7位於準直後的第一雷射光束的光軸上，將所述準直後的第一雷射光束轉換為第一切向偏振光。第一位相板10位於所述第一切向偏振光的光軸上,用於對第一切向偏振光進行相位調製得到第一調製光束；第一位相板10為渦旋位相板，其相位調製函數設為
/衝，^，且/!(民爐)=…其中，Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，φ為？K
射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。第一位相板10的結構示意如圖2所示。 第二單模光纖4和第二準直透鏡6位於第二雷射器2發出的第二雷射光束的光軸上，並對所述第二雷射光束進行準直處理；第二切向偏振轉換器8位於準直後的第二雷射光束的光軸上，將所述準直後的第二雷射光束轉換為第二切向偏振光。第一分光稜鏡9位於第二切向偏振光的光路上,用於將第二切向偏振光分解為透射光束和反射光束；其中，透射光束為第一工作光束，反射光束為第二工作光束；第一工作光束和第二工作光束的光路相互垂直。第二位相板11位於第一工作光束的光路之上，用於對垂直入射的第一工作光束進行相位調製，得到第二調製光束；第二位相板11為ο/π位相板，其相位調製函數設為
[O /uO <θ<θ. θ < θ, ιχθ, <θ<α Iij且/2(久爐)=^^ 3^n4,，其中，Θ為入射光束
f揪φ),，當或烏<沒<沒4時
垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角，θ」 θ2、θ3、04均為第二位相板的結構參數，α為由顯微物鏡的數值孔
,,NA ,
徑NA所決定的最大孔徑角，《 = arcsm (—)，n為待測螢光樣品周圍介質的折射率。第
11
二位相板11的結構示意如圖3所示，其中畫斜線部分對應的相位調製函數為π，空白部分對應的相位調製函數為O。第一反射鏡13位於第二調製光束的光路上，用於對第二調製光束進行光路折轉，使其垂直入射到第二分光稜鏡15上。第二反射鏡14位於第二工作光束的光路上，用於對第二工作光束進行光路折轉，使其垂直入射到第三位相板12上。第三位相板12用於對垂直入射的第二工作光束進行相位調製，得到第三調製光束；第三位相板12為四象限型O/π位相板，其相位調製函數設為/3(武妁，且
π , ^β<φ<~τ^π<φ<~^
Μθ,φ) = \ π 2 >π 2 ，其中，θ為入射光束垂直光軸剖面內各點所
O，<^ <^(；—<φ<2π^
. 2 2
對應的孔徑角，P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。第三位相板12的結構示意如圖4所示，其中畫斜線部分對應的相位調製函數為π，空白部分對應的相位調製函數為O。由第三位相板出射的第三調製光束垂直入射到第二分光稜鏡15上。第二分光稜鏡15,用於使垂直入射的第二調製光束反射,得到第一 STED光束；同時還使垂直 入射的第三調製光束透射，得到第二 STED光束；第一 STED光束和第二 STED光束的光路重合。第一二向色鏡16，用於使第一調製光束反射，得到激發光束；同時還使所述第一STED光束和第二 STED光束透射；透射後的第一 STED光束和第二 STED光束的光路均與所述激發光束的光路重合；在對螢光樣品所發射的螢光進行收集時，第一二向色鏡16使得螢光光束以及經樣品表面反射的第一 STED光束和第二 STED光束透射，同時還使經樣品表面反射的激發光束反射，從而起到從螢光光束中濾去激發光束的作用。第二二向色鏡17，用於使第一 STED光束和第二 STED光束反射，從而入射到第一二向色鏡16上；對螢光樣品所發射的螢光進行收集時，第二二向色鏡17使得螢光光束透射，同時還使經樣品表面反射的第一 STED光束和第二 STED光束反射，從而起到從螢光光束中濾去第一 STED光束和第二 STED光束的作用。顯微物鏡18，用於將激發光束、第一 STED光束以及第二 STED光束投射到待測螢光樣品上分別形成激發光斑、第一 STED光斑和第二 STED光斑；同時顯微物鏡18還用於收集螢光樣品上所發射的螢光。納米平移臺19，用於放置待測的螢光樣品，使螢光樣品位於顯微物鏡18的焦平面附近，並對螢光樣品進行三維平移以實現對於螢光樣品的三維掃描。帶通濾波片20，用於對透過第二二向色鏡17後的螢光光束進行濾波，以進一步濾去雜散光。 場鏡21，用於將經帶通濾波片20濾波後的螢光光束投射到探測器22的探測面上。探測器22，用於接收螢光光束，獲取螢光光強信號。上述裝置中，顯微物鏡18的數值孔徑NA=L 4 ;第二位相板11的結構參數θ ρ Θ 2、Θ 3、Θ 4 分別為 Θ !=0. I、θ 2=0. 4、Θ 3=0. 62、θ 4=0· 77。在上述受激發射損耗顯微裝置中第一位相板10的相位調製函數為/；(久爐)/(久妁=爐，其中，Θ為入射光束垂
直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。因此，經第一位相板10相位調製之後的第一調製光束的電矢量強度可由下式表
示
Ι'\φ,φ) = /』:!(沒，<7 )exp[//;(沒,爐)]=(<9,r/；)exp(/(/ ),其中，為⑷，史)為入射到第一位相板10上的第一切向偏振光在( 9,的處的電矢量強度，五「氏的為第一調製光束在(久爐)處的電矢量強度，Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，爐為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。
第二位相板11的相位調製函數為
(O ^<0<θ<θ3 04<θ<α時,φ ,當句 <Θ<Θ2 ^3 ^θ θ 4均為第二位相板η的結
構參數，α為由顯微物鏡的數值孔徑NA所決定的最大孔徑角，a = arcSin (―), η為待測
η 螢光樣品周圍介質的折射率。因此，經第二位相板11相位調製之後的第二調製光束的電矢量強度可由下式表
示
,\ΕΛΘ,φ) <θ<ΘΜΒ <O<θΜβ, <θ<αΗ
ΕΜφ)=ΕΜ<ρ)^ρ￥Μ<ρ)]=\u IL,
Λ Λ2[-E2(θ,φ) <θ<名或6 3 <θ<θ4 時其中，AM,)為入射到第二位相板11上的第一工作光束在(久妁處的電矢量強
度，<(武的為第二調製光束在(民外處的電矢量強度，Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點
所對應的孔徑角，P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角，θρΘ 2、Θ 3、Θ 4均為第二位相板11的結構參數，α為由顯微物鏡的數值孔徑NA所決定的最大
孔徑角，a = arCSin (―) , η為待測螢光樣品周圍介質的折射率。
η第三位相板12的相位調製函數為/3(民爐)
Wy^iTT
π，當0$爐<—或;r <爐<·~時
/Μψ) = \ π 22
O ,當一<φ< ——<φ<2π ^ 2 2其中，Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。因此，經第三位相板12相位調製之後的第三調製光束的電矢量強度可由下式表
示
,-E,(θ,φ),當OS爐<三或;T么識 <蘭三時
Ε'3 (θ, φ) = E3 (θ, φ) exp[//3 (θ, φ)] = I22
￡, (θ, φ)，當一 <爐<;^——<φ <2π^
I -22
其中，￡3(式爐)為入射到第三位相板12上的第二工作光束在(艮的處的電矢量強
度，￡丨(0，爐)為第三調製光束在作，的處的電矢量強度，Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點
所對應的孔徑角，P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。第一調製光束經第一二向色鏡16反射得到激發光束，激發光束經顯微物鏡18投射到螢光樣品上，形成激發光斑；第二調製光束經第一反射鏡13反射後垂直入射到第二分光稜鏡15上並反射得到第一 STED光束，第一 STED光束經第二二向色鏡17反射，之後透過第一二向色鏡16,由顯微物鏡18投射到突光樣品上,形成第一 STED光斑；第三調製光束垂直入射到第二分光稜鏡15上並透射得到第二 STED光束，第二 STED光束經第二二向色鏡17反射，之後透過第一二向色鏡16,由顯微物鏡18投射到突光樣品上,形成第二 STED光斑。第一 STED光斑和第二 STED光斑的中心點與激發光斑的中心點重合得到聚焦光斑。激發光斑、第一 STED光斑和第二 STED光斑的光場分布可由德拜積分確定，具體如下
Ε(Γ ,φ ,ζ )=ι€η(θ)· ΑΛ θ,φ)· Α {θ,φ)· ρν .θ+,^'ηθ φ-ψ'-)Λ θ φ
_ρζ_式中，(r2,p2，z2)是以顯微物鏡18的焦點位置為原點的柱坐標系，Ε(Γ2,φ2,ζ2)代
表了(r2#2,r2)處的電矢量強度，i為虛數單位，C為歸一化常數，Θ為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，爐為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的
Px
夾角，是入射光的振幅分布，表徵了顯微物鏡13的結構，py則表不了入
A1 (θ, φ)A2 (θ, φ)Pz __
射光的偏振信息，k = 2 π / λ，η為介質折射率。利用德拜積分計算發現在螢光樣品上，激發光斑為一個實心光斑，其半高全寬值為O. 34個波長。激發光斑的橫向歸一化光強分布曲線圖如圖5所不。同樣利用德拜積分可以計算得到螢光樣品上第一 STED光斑和第二 STED光斑的光場分布。將第一 STED光斑和第二 STED光斑的光場進行非相干疊加即可計算得到合STED光斑的光場分布。在突光樣品上，合STED光斑為一個橫向中空型光斑,其半高全寬值為O. 25個波長。與常規採用圓偏振光所形成的半高全寬值為O. 32個波長的STED光斑相比，本發明中採用切向偏振光所形成的STED光斑收斂更快，因此在相同的光強條件下，可以將有效螢光光斑壓縮得更小，可實現的解析度就越高。本發明中所生成的合STED光斑與常規圓偏振光所生成的STED光斑的橫向歸一化光強分布曲線比較示意圖如圖6所示。經計算發現，當合STED光斑的極值光強為370MW/cm2時，本發明採用切向偏振光的受激發射損耗顯微方法可實現的有效螢光光斑半高全寬值為1/28個波長。而相同的光強條件下，常規基於圓偏振光的受激發射損耗顯微方法可實現的有效螢光光斑的半高全寬值為1/18個波長。由此說明在相同的工作光強下，本發明可以實現的解析度更高。換句話說，為了實現相同的解析度，本發明與常規基於圓偏振光的受激發射損耗顯微方法相比，所需要的光強更低。本發明中有效突光光斑與 相同光強圓偏振光條件下的有效突光光斑的橫向歸一化光強分布曲線比較示意圖如圖7所示。
權利要求
1.一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法，包括將第一雷射光束和第二雷射光束分別轉換為第一切向偏振光和第二切向偏振光；所述第一切向偏振光經相位調製後投射到突光樣品上形成激發光斑；其特徵在於所述第二切向偏振光分解為第一工作光束和第二工作光束，所述第一工作光束和所述第二工作光束分別進行相位調製形成第一 STED光束和第二 STED光束，所述第一 STED光束和所述第二 STED光束經顯微物鏡投射到螢光樣品上通過非相干疊加形成相應的STED光斑，該STED光斑的中心點與所述激發光斑的中心點重合得到聚焦光斑；收集螢光樣品在該聚焦光斑作用下發出的螢光，經處理後得到相應的顯微圖像。
2.如權利要求I所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法，其特徵在於，所述的第一雷射光束進行相位調製的調製函數/t(0,的為/!(民爐)=@，所述9為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，所述的爐為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。
3.如權利要求I所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法，其特徵在於，所述的第一工作光束進行相位調製的調製函數滿(
4.如權利要求3所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法，其特徵在於，所述顯微物鏡的數值孔徑NA=L 4，所述位相板的結構參數0:、02、03、04分別為Q1=O. I、0 2=0. 4、9 3=0. 62、9 4=0. 77。
5.如權利要求I所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法，其特徵在於，所述的第二工作光束進行相位調製的調製函數Me,(p)為K , ^fAO,<P) = \2 3 2 所述0為入射光束垂直光軸剖面內各 I 0，<(p<點所對應的孔徑角，所述的P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與x軸的夾角。
6.一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置，包括沿第一光路依次布置的第一光源、第一切向偏振轉換器和第一位相板；沿第二光路依次布置的第二光源、第二切向偏振轉換器；用於承載螢光樣品的納米平移臺；用於將所述第一光路和第二光路的光線投射至螢光樣品的投射裝置；檢測所述螢光樣品發光的探測成像系統；其特徵在於，在所述第二切向偏振轉換器與投射裝置之間依次設有 用於將所述第二切向偏振轉換器的出射光分解為第一工作光束和第二工作光束的第一分光稜鏡； 用於將所述第一工作光束和所述第二工作光束分別進行相位調製的第二位相板和第三位相板； 用於匯聚所述第二位相板和第三位相板的出射光的第二分光稜鏡。
7.如權利要求6所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置，其特徵在於，所述第一位相板為(T2 !渦旋位相板,其對應的調製函數./!(武爐)為/I(民￠0 =爐，所述Q為入射光束垂直光軸剖面內各點所對應的孔徑角，所述的0為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。
8.如權利要求6所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置，其特徵在於，所述第二位相板為0/ 位相板，其對應的調製函數為 』所述9為入射光束垂直光軸翻內各點所對應的孔徑角，所述的P為入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角，e2、e3、04均為對應的位相板的結構參數，所述a為由顯微物鏡的數值孔徑NA所決定的最大孔徑角，a = arcsin (―) n為待測滅光樣品周圍介質的折射率。n
9.如權利要求6所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置，其特徵在於，所述第三位相板為四象限型0/Ji位相板，其對應的調製函數.m<p)為 ,所述9為入射光束垂直光軸剖面內各點 、 2 2 所對應的孔徑角，所述的<P力入射光束垂直光軸剖面內各點的極坐標位置矢量與X軸的夾角。
10.如權利要求6所述的基於切向偏振光的受激發射損耗顯微裝置，其特徵在於，在所述第一光源與所述第一切向偏振轉換器及所述第二光源與所述第二切向偏振轉換器之間依次設有用於對光束進行準直作用的單模光纖和準直透鏡。
全文摘要
本發明公開了一種基於切向偏振光的受激發射損耗顯微方法，包括將第一雷射光束和第二雷射光束分別轉換為第一切向偏振光和第二切向偏振光；第一切向偏振光經相位調製後投射到螢光樣品上形成激發光斑；第二切向偏振光分解為第一工作光束和第二工作光束，第一工作光束和第二工作光束分別進行相位調製形成第一STED光束和第二STED光束，且經顯微物鏡投射到螢光樣品上通過非相干疊加形成相應的STED光斑，該STED光斑的中心點與激發光斑的中心點重合得到聚焦光斑；收集螢光樣品在該聚焦光斑作用下發出的螢光，經處理後得到顯微圖像。本發明還公開了基於上述方法的受激發射損耗顯微裝置。本發明在相同工作光強下，能夠實現較高的解析度。
文檔編號G01N21/64GK102661938SQ20121014438
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者劉旭, 匡翠方, 李帥, 薛懿, 顧兆泰 申請人:浙江大學