一種穩定的酶法檢測唾液酸的方法及試劑盒的製作方法
2023-09-16 11:58:35
專利名稱：一種穩定的酶法檢測唾液酸的方法及試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及穩定的酶法檢測唾液酸的方法及試劑盒。具體而言，本發明涉及通過 檢測NADH生成量檢測唾液酸含量的方法，及根據該方法製備的單試劑或雙試劑液體試劑盒。
背景技術：
唾液酸(Sialic acid, SA)是多種天然神經氨酸衍生物之一，其母體結構是九個碳 原子組成的內環胺基酸，是一族化合物的總稱，化學名稱為N-乙醯神經氨酸。它由於最初 從頌下腺粘蛋白中分離而出而得名。唾液酸分布於哺乳動物體內，血管內皮細胞內含量尤其豐富。血清總唾液酸 (total sialic acid，TSA)含量約為1. 5 2. 5mmol/L，包括游離唾液酸和結合唾液酸。遊 離唾液酸的含量較低，約為1 3umol/L ；與脂蛋白和糖蛋白結合的唾液酸為結合唾液酸， 主要以唾液酸鹽的形式存在。唾液酸位於糖蛋白、糖脂的寡糖鏈的末端，與細胞識別、分化 以及黏附有關，參與受體組成，並誘導細胞增殖、死亡。正常代謝時，血清的唾液酸含量穩定，當組織細胞惡變時，細胞表面糖蛋白在結構 和功能上均發生明顯改變，結合在糖蛋白上的唾液酸隨異常表達的糖蛋白脫落入血，是血 液中唾液酸升高的可能原因。許多研究發現帶瘤動物及腫瘤患者的瘤體及血液中SA含量增加並隨病情的加重 而升高，隨著病情的緩解而降低，因此SA被作為惡性腫瘤存在和發展監控的一個指標，並 且廣泛的應用於很多腫瘤的診斷和監控中。除此之外，唾液酸含量檢測也可應用在食品安 全和健康領域，如燕窩、奶粉中的唾液酸含量檢測。檢測總唾液酸含量的方法有很多，例如HPLC、酶法、化學比色法(常見的有硫代巴 比妥酸法、間苯二酚法)。HPLC方法具有靈敏度高、特異性好的優點，但是儀器昂貴且不適 合臨床批量檢測。化學比色法雖然價格較低，但是特異性低，操作複雜繁瑣，需要高溫萃取， 不適合自動化分析，其試劑成分具有一定的腐蝕性和人體危害性。酶分析法具有特異性高， 操作簡單快捷、準確安全、可自動化分析的優點。酶法中常用的是神經氨酸醛縮酶斷裂結 合唾液酸的糖苷鍵，產生游離的N-乙醯神經氨酸，N-乙醯神經氨酸在神經氨酸苷酶的作用 下生成丙酮酸和甘露糖胺，丙酮酸與NADH在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸和NAD，NADH在 340nm有特異性吸收，通過檢測NADH的減少量來檢測樣本中的總唾液酸。該方法穩定周期 短，大多為乾粉試劑，由於以往自動生化分析儀未普及，試劑用量大、乾粉復溶後穩定時間 短、適用機型少，導致用戶適用成本高、無法滿足臨床檢測需求。因此，臨床上依然存在對方 便適用、成本低廉、穩定可靠的SA含量檢測的試劑盒及檢測方法的需求。
發明內容
因此，本發明的技術目的在於提供一種方便適用、成本低廉、穩定可靠的SA含量 檢測的試劑盒及檢測方法。
因此，本發明的第一方面涉及一種穩定的酶法檢測唾液酸的方法，其包括以下步 驟a)向樣品中加入神經氨酸醛縮酶，使樣品中的結合唾液酸在神經氨酸醛縮酶的催 化下生成N-乙醯神經氨酸；b)向步驟a)的混合物中加入神經氨酸苷酶，使N-乙醯神經氨酸在神經氨酸苷酶 催化下轉變為N-乙醯甘露糖胺和丙酮酸；C)向步驟b)的混合物中加入甘露糖胺脫氫酶和氧化型輔酶NAD，使N-乙醯甘露 糖胺和氧化型輔酶NAD在甘露糖胺脫氫酶的催化下轉變為N-乙醯甘露糖內酯、NADH和氫 離子，d)檢測NADH的生成量對唾液酸進行定量，優選地，所述樣品為血清樣品，優選地，所述甘露糖胺脫氫酶為N-醯基甘露糖胺 1-脫氫酶，優選地，檢測NADH生成量的方法為分光光度法。優選地，所述神經氨酸醛縮酶、 神經氨酸苷酶、甘露糖胺脫氫酶、氧化型輔酶NAD同時加入到樣品中，或者將神經氨酸醛縮 酶和甘露糖胺脫氫酶以及神經氨酸苷酶和氧化型輔酶NAD先後加入到樣品中。優選地，所述神經氨酸苷酶的用量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/ L ；優選地，所述神經氨酸醛縮酶的用量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/L ；優 選地，所述氧化型輔酶NAD的用量為0. 02-5mmol/L，更優選0. 05-2mmol/L，最優選0. Immol/ L ；優選地，所述甘露糖胺脫氫酶的用量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/L。本發明的第二方面涉及一種穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其包括
神經氨酸苷酶0.1-100KU/L,
神經氨酸醛縮酶0.1-100KU/L,
氧化型輔酶NAD0.01-10mmol/L,
甘露糖胺脫氫酶0.1-100KU/L,
緩衝液l-500mmol/L,
保護劑0. 01-10%,
防腐劑0. 01-10%,
其中所述百分比為]重量體積比。
優選地，所述試劑羞 為單試劑液體試劑盒或為由試劑ι和試劑2組成的液體雙試
劑試劑盒，其中試劑1由緩衝液，神經氨酸苷酶，氧化型輔酶NAD組成，試劑2由緩衝液，神 經氨酸醛縮酶，N-醯基甘露糖胺1-脫氫酶組成，防腐劑和保護劑存在於試劑1或試劑2中， 或同時存在於試劑1和試劑2中。優選地，試劑1和試劑2的體積比在2-6範圍內。優選 地，所述緩衝液選自PH3-11範圍內的三羥甲基氨基甲烷緩衝液、甘氨酸-NaOH緩衝液、檸檬 酸-檸檬酸鈉緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、MES緩衝液、Good』 s緩衝液或硼酸緩衝 液中的一種或多種。優選地，所述防腐劑選自山梨酸鉀、苯甲酸鈉、疊氮鈉、亞硝酸鈉、PC300 中的一種或多種。優選地，所述保護劑選自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇 中的一種或多種。優選地，所述試劑盒還包括表面活性劑，優選地，所述表面活性劑為非離 子表面活性劑，更優選地，所述非離子表面活性劑選自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列。
優選地，所述神經氨酸苷酶的含量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/ L ；優選地，所述神經氨酸醛縮酶的含量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/L ；優選地，所述氧化型輔酶NAD的含量為0. 02-5mmol/L，更優選0. 05-2mmol/L，最優選0. Immol/ L ；優選地，所述甘露糖胺脫氫酶的含量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/L ； 優選地，所述緩衝液的濃度為25-300mmol/L，更優選50-200mmol/L，最優選100mmol/L ； 優選地，所述保護劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優選0. 03-1 %重量體積比，最優選 0. 05%重量體積比；優選地，所述防腐劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優選0. 03-1% 重量體積比，最優選0. 05 %重量體積比。最優選地，所述試劑盒為單試劑液體試劑盒，其由下述成分組成神經氨酸苷酶50KU/L，神經氨酸醛縮酶50KU/L，氧化型輔酶NAD0. lmmol/L,甘露糖胺脫氫酶50KU/L，MES 緩衝液100mmol/L，聚乙二醇0.05%，疊氮鈉0.05%，試劑pH為7. 0，其中所述百分比為重量體積比；或所述試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體雙試劑試劑盒，其成分如下試劑1成分及濃度如下神經氨酸苷酶80KU/L，氧化型輔酶NAD4mmol/L,HEPES 緩衝液1 OOmmol/L，聚乙二醇0.1%，苯甲酸鈉0.1%，試劑1的pH為6. 5，，其中所述百分比為重量體積比，試劑2成分及濃度如下神經氨酸醛縮酶10KU/L，甘露糖胺脫氫酶60KU/L，HEPES 緩衝液400mmol/L，丙三醇5%，疊氮鈉0.1%，試劑2的pH為7. 2，其中所述百分比為重量體積比。換言之，發明人通過對現有酶法檢測唾液酸含量的方法和試劑盒的試劑主要成 分神經氨酸苷酶、神經氨酸醛縮酶、甘露糖胺脫氫酶、氧化型輔酶NAD的特性進行仔細研 究發現，進口乾粉試劑成本過高的主要原因是當時試劑的系統設計無法滿足反應得最佳條 件，主要表現在①反應關鍵工具酶神經氨酸苷酶與神經氨酸醛縮酶在該反應條件下活性 只有最佳狀態的50%左右，而且這兩個工具酶的價格十分昂貴，致使試劑成本過高；②試 劑中使用的還原性輔酶NADH在該反應條件下不穩定，必須製成乾粉試劑才能達到長期保 存穩定，復溶後必須儘快使用，否則在保存過程中由於NADH降解速度較快對試劑性能會造 成很大影響；③由於進口乾粉試劑都是大包裝，中小用戶復溶後如不及時用完，造成試劑浪 費，在很大程度上增加了檢測成本。
因此，為了改進現有酶法檢測唾液酸方法和試劑盒的缺點，探尋一種穩定的酶法 測定唾液酸方法和液體試劑盒，發明人更改了試劑反應原理，把不穩定的NADH換為穩定的 NAD來進行檢測；該液體試劑可為單試劑，也可為雙試劑。所述單試劑包括 優選地，所述神經氨酸苷酶的含量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/ L ；優選地，所述神經氨酸醛縮酶的含量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/L ；優 選地，所述氧化型輔酶NAD的含量為0. 02-5mmol/L，更優選0. 05-2mmol/L，最優選0. Immol/ L ；優選地，所述甘露糖胺脫氫酶的含量為10-80KU/L，更優選30-60KU/L，最優選50KU/L ； 優選地，所述緩衝液的濃度為25-300mmol/L，更優選50-200mmol/L，最優選100mmol/L ； 優選地，所述保護劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優選0. 03-1 %重量體積比，最優選 0. 05%重量體積比；優選地，所述防腐劑的含量為0. 02-5%重量體積比，更優選0. 03-1% 重量體積比，最優選0. 05 %重量體積比。
神經氨酸醛縮酶 甘露糖胺脫氫酶 緩衝液 保護劑 防腐劑
本發明的試劑盒與現有的通過檢測NADH減少量而檢測唾液酸含量的試劑盒相 比，其數據擬合度很高，而本發明試劑盒的穩定性則優於現有的通過檢測NADH減少量而檢 測唾液酸含量的試劑盒。本發明的方法和試劑盒可以用於腫瘤篩查、腫瘤治療、腫瘤復發轉移檢測或唾液 酸檢測。
圖1 顯示了本發明試劑盒與使用乳酸脫氫酶方法的試劑盒的相關性研究結果。圖2 顯示了本發明試劑盒與使用乳酸脫氫酶的試劑盒的37°C加速穩定性研究結
果 ο圖3 顯示了實施例3和實施例4的試劑盒之間的相關性研究結果。
具體實施例方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不 背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的範圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均 可容易地從商業公司獲取。實施例實施例1採用單試劑的SA檢測試劑盒該試劑盒的試劑採用單試劑，試劑成分及濃度如下神經氨酸苷酶50KU/L神經氨酸醛縮酶50KU/L氧化型輔酶NAD0. lmmol/L甘露糖胺脫氫酶50KU/LMES 緩衝液IOOmmol/L聚乙二醇0.05%疊氮鈉0.05%試劑pH為7. 0，其中所述百分比為重量體積比。單試劑使用方法如下表1 單試劑的使用方法
權利要求
1.一種穩定的酶法檢測唾液酸的方法，其包括以下步驟a)向樣品中加入神經氨酸醛縮酶，使樣品中的結合唾液酸在神經氨酸醛縮酶的催化下 生成N-乙醯神經氨酸；b)向步驟a)的混合物中加入神經氨酸苷酶，使N-乙醯神經氨酸在神經氨酸苷酶催化 下轉變為N-乙醯甘露糖胺和丙酮酸；c)向步驟b)的混合物中加入甘露糖胺脫氫酶和氧化型輔酶NAD，使N-乙醯甘露糖胺 和氧化型輔酶NAD在甘露糖胺脫氫酶的催化下轉變為N-乙醯甘露糖內酯、NADH和氫離子，d)檢測NADH的生成量對唾液酸進行定量，優選地，所述樣品為血清樣品，優選地，所述甘露糖胺脫氫酶為N-醯基甘露糖胺1-脫 氫酶，優選地，檢測NADH生成量的方法為分光光度法。
2.根據權利要求1所述的穩定的酶法檢測唾液酸的方法，其特徵在於所述神經氨酸醛 縮酶、神經氨酸苷酶、甘露糖胺脫氫酶、氧化型輔酶NAD同時加入到樣品中，或者將神經氨 酸醛縮酶和甘露糖胺脫氫酶以及神經氨酸苷酶和氧化型輔酶NAD先後加入到樣品中。
3.一種穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其包括神經氨酸苷酶 神經氨酸醛縮酶 氧化型輔酶NAD 甘露糖胺脫氫酶 緩衝液 保護劑 防腐劑0.1-100KU/L, 0.1-100KU/L, 0.01-10mmol/L, 0.1-100KU/L, l-500mmol/L, 0. 01-10%, 0. 01-10%,其中所述百分比為重量體積比。
4.根據權利要求3所述的穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特徵在於其為由試劑1 和試劑2組成的液體雙試劑試劑盒，試劑1由緩衝液，神經氨酸苷酶，氧化型輔酶NAD組成， 試劑2由緩衝液，神經氨酸醛縮酶，N-醯基甘露糖胺1-脫氫酶組成，防腐劑和保護劑存在 於試劑1或試劑2中，或同時存在於試劑1和試劑2中。
5.根據權利要求4所述的穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特徵在於試劑1和試劑 2的體積比在2-6範圍內。
6.根據權利要求3至5任一項所述的穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特徵在於 所述緩衝液選自PH3-11範圍內的三羥甲基氨基甲烷緩衝液、甘氨酸-NaOH緩衝液、檸檬 酸-檸檬酸鈉緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、MES緩衝液、Good』 s緩衝液或硼酸緩衝 液中的一種或多種。
7.根據權利要求3至6任一項所述的穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特徵在於所 述防腐劑選自山梨酸鉀、苯甲酸鈉、疊氮鈉、亞硝酸鈉、PC300中的一種或多種。
8.根據權利要求3至7任一項所述的穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特徵在於所 述保護劑選自聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇中的一種或多種。
9.根據權利要求3至8任一項所述的穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特徵在於所 述試劑盒還包括表面活性劑，優選地，所述表面活性劑為非離子表面活性劑，更優選地，所 述非離子表面活性劑選自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列。
10.根據權利要求3至9任一項所述的穩定的酶法檢測唾液酸的試劑盒，其特徵在於所 述試劑盒為單試劑液體試劑盒，其由下述成分組成神經氨酸苷酶 神經氨酸醛縮酶 氧化型輔酶NAD 甘露糖胺脫氫酶 MES緩衝液 聚乙二醇 疊氮鈉、50KU/L, 50KU/L,、0.lmmol/L, 50KU/L, 1OOmmo1/L, 0. 05%, 0. 05%,試劑PH為7. 0，其中所述百分比為重量體積比；或所述試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體雙試劑試劑盒，其成分如下 試劑1成分及濃度如下神經氨酸苷酶 氧化型輔酶NAD HEPES緩衝液聚乙二醇 苯甲酸鈉、80KU/L, 4mmol/L, IOOmmo1/L, 0. 1%, 0. 1%,試劑1的PH為6. 5，，其中所述百分比為重量體積比， 試劑2成分及濃度如下神經氨酸醛縮酶 甘露糖胺脫氫酶 HEPES緩衝液丙三醇 疊氮鈉試劑2的pH為7,、10KU/L, 60KU/L, 400mmol/L, 5%, 0. 1%,、2，其中所述百分比為重量體積比,
全文摘要
本發明涉及一種穩定的酶法檢測唾液酸的方法及試劑盒。具體而言，本發明的方法為結合唾液酸在神經氨酸醛縮酶催化下生成N-乙醯神經氨酸，後者在神經氨酸苷酶催化下轉變為N-乙醯甘露糖胺，該產物與甘露糖胺脫氫酶和氧化型輔酶NAD反應生成NADH，通過檢測NADH生成量測得唾液酸含量。本發明也涉及根據該方法製備的試劑盒。本發明的方法和試劑盒使用方便快捷，無需溶解液復溶，長期穩定，瓶間變異小，適用於各類生化分析儀，避免二次汙染，簡化生產工藝方法。
文檔編號C12Q1/25GK102072953SQ20101061521
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者劉希, 劉瑤, 杜愛銘 申請人:北京九強生物技術有限公司