菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法

2023-09-19 23:15:10

專利名稱：菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它屬於生物技術領域， 專用於口岸檢驗檢疫和農業植檢部門等對大豆上菜豆莢斑駁病毒的快速檢測。
背景技術：
菜豆莢斑駁病毒(BPMV)屬於豇豆花葉病毒科(a)歷oWn'flfee)、豇豆花葉病毒屬 (Co/w w'/YA9)成員，病毒基因組為二分體線形正義單鏈RNA， RNA-l長約6kb， RNA-2長約 3.6kb。 BPMV最早是1948年報導於美國査爾斯頓的菜豆Tendergreen品種上，現主要分布於 北美地區，在美國的阿肯色州、北卡羅來納州、維吉尼亞州、肯塔基州、密西西比州、路 易斯安那州、愛荷華州、伊利諾斯州和印地安那州等大豆種植地區分布廣泛。除美國外， 近年來加拿大、巴西、秘魯也己有BPMV在大豆上發生的報導。菜豆莢斑駁病毒侵染大豆引 起的菜豆莢斑駁病，不僅影響大豆的正常生長，引起產量損失，還使大豆種子質量明顯下 降。據統計，BPMV侵染大豆造成的產量損失範圍為3y。一52y。，侵染時間越早，損失越嚴重， 若與大豆花葉病毒(6bj^e朋ifos&'c SMV)複合侵染，則大豆產量損失可高達85%，
給大豆生產帶來嚴重威脅。此外，BPMV侵染大豆後，還可導致大豆更易受到擬莖點黴屬 (州OT叩w's)真菌的危害，致使大豆種子品質進一步降低。BPMV作為危險性有害生物，已 被正式列入我國新增進境植物檢疫性病毒名錄。迄今為止，我國尚未見BPMV發生的報導， 但隨著我國對外貿易和大豆加工業的的迅速發展，每年從國外(特別是美國)進口大量大 豆，BPMV隨進口大豆傳入的風險越來越大。為避免BPMV傳入我國，給我國農業生產，特別 是大豆種植業帶來巨大危險，迫切需要加強對BPMV的口岸檢疫，因此提高該病毒檢測技術 具有極其重要的現實意義。
當前，用於植物病毒檢測的方法主要包括生物學檢測、電鏡檢測、血清學檢測和分子 生物學檢測。通過接種指示植物可以檢測BPMV，該病毒接種大豆、菜豆Tendergreen後產 生斑駁症狀，而接種菜豆Pinto和Bountiful品種後產生局部枯斑，但該方法檢測時間長， 並且結果易受人為因素和環境條件的影響。電鏡觀察由於需要昂貴的儀器和專門的操作人 員，並且材料前處理較為複雜，因此在BPMV的快速檢測上具有較大局限性。血清學檢測具 有所需設備簡單、操作簡便、成本低廉和反應靈敏的優點，目前已成為BPMV最常用的檢測 方法，但該方法的使用前提是需要有價格昂貴、特異性強的抗血清。與血清學檢測方法相比，基於核酸水平的RT-PCR分子檢測方法具有靈敏度更高、特異性更強、結果更可靠等優 點，國內外已有多篇關於利用RT-PCR方法檢測BPMV的研究報導，包括普通RT-PCR、免疫 捕獲巢式RT-PCR和半巢式RT-PCR等(Gu等，Phytopathology, 2002, 92 (4): 446 452; 於翠等，植物檢疫，2006， 20 (4): 201 204;聞偉剛等，植物病理學報，2006， 36 (4): 296 300)。但是，至今尚未見應用TC-RT-PCR (試管捕捉RT-PCR)技術檢測BPMV的報導， 更未見專門用於檢測BPMV的TC-RT-PCR檢測試劑盒。

發明內容
本發明的目的是提供一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它可對口岸進 境大豆種子及田間大豆上菜豆莢斑駁病毒進行快速、準確、有效的檢疫鑑定。 本發明技術方案由以下兩部分構成 (一) 一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特徵在於其組成為
(1) 1#液，含有病毒抽提試劑PBS緩衝液，濃度1X， pH7.4;
(2) 2*液，含有菜豆莢斑駁病毒上遊引物5， -GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3，， 濃度10timol/L;
(3) 3*液，含有菜豆莢斑駁病毒下遊引物5， -GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3，， 濃度10umol/L;
(4) 4*液，含有RT Buffer,濃度5X;
(5) 5*液，含有RNA酶抑制因子，濃度40U/PL;
(6) 6#液，含有反轉錄酶，濃度200U/iiL;
(7) 7*液，含有dNTPs，濃度10咖ol/L:
(8) 8"液，含有PCR Buffer,濃度10X;
(9) 9*液，含有Mgcl2，濃度25mmol/L;
(10) l(f液，含有Taq DNA聚合酶，濃度5U/uL;
(11) ir液，含有菜豆莢斑駁病毒陽性對照；
(12) 12#液，含有菜豆莢斑駁病毒陰性對照；
(13) 13#液，含有PBST緩衝液，濃度1X;
(14) 14*液，含有RNase-free ddH20。
上述1#液-14#液分別為1管，其中r液的含量為10mL， 2-液的含量為100nL， 3*液的含量 為100yL， 4"液的含量為150nL， 5^液的含量為25uL， 6#液的含量為25 ix L, 7#液的含量為 100uL， 8"液的含量為100uL, 9"液的含量為100uL， l(f液的含量為lOii L， 11#液的含量為 2mL， l"液的含量為2mL， lY液的含量為10mL, 14-液的含量為10mU(二)方案(一)所述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於包括如 下步驟
(1) 病毒提取液的製備
① 如果待測樣品為大豆葉片，則稱取一定量葉片組織，按樣品與抽提緩衝液的重 量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試劑r液，充分研磨後，4'C下10000g離 心10min,取上清液作為病毒提取液；
② 或者如果待測樣品為大豆種子，則先將大豆種子用水浸泡2h後，剝取其種皮作 為樣品，再按樣品與抽提緩衝液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試 劑1#液，充分研磨後，4'C下10000g離心10min，取上清液作為病毒提取液；
(2) 反轉錄反應取步驟(1)製備的病毒提取液50uL包被PCR管，並以50wL 11#液 和50uL 1Y液分別作為陽性對照和陰性對照包被PCR管，每管37'C下孵育3h、 13#液洗管3次 和14#液洗管2次後，接著進行反轉錄反應；反轉錄反應程序為按每管加luL3-液和9uL14' 液，7(TC水浴10min後立即置於冰上冷卻3min，再按每管加5uL 4#液、luL 5#液、1 u L 6# 液、2uL 7*液，經42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;
(3) PCR反應以病毒提取液、lr液及12"液分別通過反轉錄反應得到的各5yL cDNA 為模板，按每管加2. 5P L 8*液、2uL9"液、0.5uL7-液、2uL2'液、2uL3"液、10.75uL 14，和0.25uL l(f液，然後進行PCR反應；PCR反應程序為94。C變性3min後進入以下循環 94。C變性30s、 52匸退火45s、 72。C延伸lmin，共35個循環，最後一輪循環結束後72。C延伸 10miru
(4) PCR擴增產物電泳檢測PCR反應結束後，取產物10iiL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳 進行檢測，溴化乙錠染色後在凝膠成像系統上觀察並記錄實驗結果。
含有菜豆莢斑駁病毒樣品的電泳檢測結果為在542bp處出現明亮的DNA條帶。 本發明根據菜豆莢斑駁病毒基因的保守區域設計特異性引物，利用TC-RT-PCR (試管捕
捉RT-PCR)技術對菜豆莢斑駁病毒進行檢測，與現有技術相比，本發明所提供的菜豆莢斑
駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法具有如下優點
1) 本發明應用TC-RT-PCR技術，省去了常規RT-PCR中繁瑣的RNA提取步驟，可直接對 病毒提取液進行RT-PCR，不僅簡化操作程序、降低操作要求，而且避免了使用有機溶劑， 減少環境汙染；與IC-RT-PCR (免疫捕獲RT-PCR)相比，本發明不需要價格昂貴的抗血清， 而是用PCR管直接去吸附病毒，大大節約了檢測成本。
2) 本發明提供的檢測方法檢測菜豆莢斑駁病毒，樣品用量少、特異性強、靈敏度高、 準確度好、操作簡便、結果穩定，不僅能檢測單粒大豆種子，同時適於大量樣品的快速檢測。
3)本發明設計的檢測試劑盒製作方法簡單、使用經濟，具有重要實際應用價值。


圖l為帶病大豆葉片的檢測結果。其中M: DNA分子量標準(100bp); 1:檢測樣品(帶 病大豆葉片)；2: BPMV陽性對照；3: BPMV陰性對照；
圖2為帶病大豆種子的檢測結果。其中M: DNA分子量標準(100bp); 1:檢測樣品(帶 病大豆種子)；2: BPMV陽性對照；3: BPMV陰性對照。
圖3為帶病大豆幼苗的檢測結果。其中M: DNA分子量標準(100bp); 1:檢測樣品I (帶 病大豆幼苗)；2:檢測樣品II (帶病大豆幼苗)；3:檢測樣品III (帶病大豆幼苗)；4: BPMV 陽性對照；5: BPMV陰性對照。
具體實施例方式
以下通過具體實施例對本發明作進一步說明。 實施例1:菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒
一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特徵在於其組成為
(1) r液，含有病毒抽提試劑PBS緩衝液，濃度1X, pH7.4;
(2) 28液，含有菜豆莢斑駁病毒上遊引物5， -GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3，， 濃度10umol/L;
(3) 3*液，含有菜豆莢斑駁病毒下遊引物5' -GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3，， 濃度10pmol/L;
(4) 4*液，含有RT Buffer,濃度5X;
(5) 5"液，含有RNA酶抑制因子，濃度40U/uL;
(6) 6*液，含有反轉錄酶，濃度200U/uL;
(7) 7*液，含有dNTPs，濃度10咖ol/L;
(8) 8*液，含有PCR Buffer,濃度10X;
(9) 9*液，含有Mgcl"濃度25ranol/L;
(10) 10#液，含有Taq DNA聚合酶，濃度5U/uL;
(11) 11#液，含有菜豆莢斑駁病毒陽性對照；
(12) 12#液，含有菜豆莢斑駁病毒陰性對照；
(13) 13#液，含有PBST緩衝液，濃度1X;
(14) 14*液，含有RNase-free ddH20。
所述1"液_14#液分別為1管，其中f液的含量為10mL， 2"液的含量為100uL， 3'液的含量為100uL， ^液的含量為150uL， 5，的含量為25uL， 6"液的含量為25uL， 7"液的含量為 100 uL， 8'液的含量為10(^L，薩液的含量為lOOiiL, 10#液的含量為10 ix L, ll'液的含量為 2mL， 12，的含量為2mL， 13'液的含量為10mL， K液的含量為10mL。 實施例2對菜豆莢斑駁病毒的檢測方法
上述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒用於檢測菜豆莢斑駁病毒(BPMV)的檢測方法，包
括
1) 稱取0.05g大豆病葉，按樣品與抽提緩衝液的重量體積比為1: 10 (克/毫升)加 入病毒抽提試劑1"液，充分研磨後，4。C下10000g離心10min,取上清液作為病毒提取液；
2) 取50uL大豆病葉上清液(病毒提取液)包被PCR管，並以50uLll、液、50uL12# 液分別作為陽性對照和陰性對照包被PCR管。每管37'C下孵育3h、 13#液洗管3次和14#液 洗管2次後進行反轉錄反應；反轉錄反應程序為按每管加luL 3"液和9uL 14#液，70°C 水浴10min後立即置於冰上冷卻3min，再按每管加5 u L 4*液、1 u L 5*液、luL6"液、2wL 7#液。經42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;
3) 取以病毒提取液、lr液及12、液分別通過反轉錄反應得到的各5!iL cDNA為模板， 按每管加2. 5uL 8#液、2uL 9#液、0. 5uL 7"液、2uL 2'液、2uL 3#液、10. 75pL 14#液 和0. 25u L 10#液，然後進行PCR反應。PCR反應程序為94。C變性3min後進入以下循環 94X:變性30s、 52。C退火45s、 72'C延伸lmin，共35個循環，最後一輪循環結束後72。C延 伸10min;
4) PCR反應結束後，取產物10"L，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠染色 後在凝膠成像系統上觀察並記錄實驗結果。
含有菜豆莢斑駁病毒(BPMV)樣品的電泳檢測結果為在542bp處出現明亮的DNA條帶 (圖1)，否則無。 實施例3 口岸截獲美國進境帶病大豆種子的檢測
與實施例2區別在於檢測對象是大豆的種子。先將大豆種子用水浸泡2h後，剝取其種皮
作為樣品，再按樣品與抽提緩衝液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)加入病毒抽提試劑1#
液，充分研磨後，4'C下10000g離心10min，取上清；其餘步驟同實施例2，含有菜豆莢斑駁 病毒(BPMV)樣品的電泳檢測結果為在542bp處出現明亮的DNA條帶(圖2)，否則無。 實施例4進境美國大豆幼苗的檢測
在進境大豆隔離種植基地，隨機選取具有斑駁症狀的大豆幼苗，每5株幼苗的葉片作為 一份樣品，共3份。其餘步驟同實施例2，含有菜豆莢斑駁病毒(BPMV)樣品的電泳檢測結 果為在542bp處出現明亮的DNA條帶(圖3),否則無。序列表.SEQ.txt
2008-5-30
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福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心

菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法
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權利要求
1. 一種菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特徵在於其組成為(1)1#液，含有病毒抽提試劑PBS緩衝液，濃度1×，pH7.4；(2)2#液，含有菜豆莢斑駁病毒上遊引物5』-GGCAATTTTAGAGCAAGTGTTG-3』，濃度10μmol/L；(3)3#液，含有菜豆莢斑駁病毒下遊引物5』-GCATTTGGCATATTCATGAGAAT-3』，濃度10μmol/L；(4)4#液，含有RT Buffer，濃度5×；(5)5#液，含有RNA酶抑制因子，濃度40U/μL；(6)6#液，含有反轉錄酶，濃度200U/μ L；(7)7#液，含有dNTPs，濃度10mmol/L；(8)8#液，含有PCR Buffer，濃度10×；(9)9#液，含有Mgcl2，濃度25mmol/L；(10)10#液，含有Taq DNA聚合酶，濃度5U/μL；(11)11#液，含有菜豆莢斑駁病毒陽性對照；(12)12#液，含有菜豆莢斑駁病毒陰性對照；(13)13#液，含有PBST緩衝液，濃度1×；(14)14#液，含有RNase-free ddH2O。
2、 根據權利要求l所述的菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒，其特徵在於所述r液-i4"液 分別為1管，其中r液的含量為10mL， 2"液的含量為100uL, 3#液的含量為100 P L， 4#液的含 量為150uL， 5"液的含量為25uL， 6"液的含量為25uL，"液的含量為IOO u L， 8#液的含量 為100uL， 9'液的含量為100nL， 1(^液的含量為10uL， lr液的含量為2mL， 12#液的含量為 2mL， 13"液的含量為10mL， K液的含量為10mL。
3、 權利要求l所述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於包括如下步驟(1)病毒提取液的製備① 如果待測樣品為大豆葉片，則稱取一定量葉片組織，按樣品與抽提緩衝液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試劑r液，充分研磨後，4-C下10000g離 心10min，取上清液作為病毒提取液；② 或者如果待測樣品為大豆種子，則先將大豆種子用水浸泡2h後，剝取其種皮作為樣品，再按樣品與抽提緩衝液的重量體積比為l: 10 (克/毫升)的比例加入病毒抽提試 劑1"液，充分研磨後，4'C下10000g離心10min,取上清液作為病毒提取液；(2) 反轉錄反應取步驟(1)製備的病毒提取液50uL包被PCR管，並以50wL 11#液 和50uL lf液分別作為陽性對照和陰性對照包被PCR管，每管37。C下孵育3h、 13#液洗管3次 和14"液洗管2次後，接著進行反轉錄反應；反轉錄反應程序為按每管加lPL3"液和9uL14" 液，70。C水浴10min後立即置於冰上冷卻3min,再按每管加5uL 4"液、luL 5'液、1 u L 6' 液、2uL 78液，經42。C lh， 70°C 10min合成cDNA;(3) PCR反應以病毒提取液、l"液及12"液分別通過反轉錄反應得到的各5uL cDNA 為模板，按每管加2.5uL亂2uL9"液、0.5uL7"液、2uL2'液、2"3#液、10.75" 14"液和0.25uL IO"液，然後進行PCR反應；PCR反應程序為94'C變性3min後進入以下循環 94'C變性30s、 52'C退火45s、 72'C延伸lmin,共35個循環，最後一輪循環結束後72i:延伸 10mins(4) PCR擴增產物電泳檢測PCR反應結束後，取產物10uL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠染色後在凝膠成像系統上觀察並記錄實驗結果。
4、根據權利要求3所述菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於含有 菜豆莢斑駁病毒樣品的電泳檢測結果為在542bp處出現明亮的DNA條帶。
全文摘要
本發明涉及菜豆莢斑駁病毒的檢測試劑盒及其檢測方法，它專用於菜豆莢斑駁病毒的檢測。該試劑盒包括引物、病毒抽提試劑、RT Buffer、RNA酶抑制因子、反轉錄酶、dNTPs、PCR Buffer、Mgcl2、Taq DNA聚合酶、陽性對照、陰性對照、PBST緩衝液和RNase-free ddH2O。本發明根據菜豆莢斑駁病毒基因的保守區域設計特異性引物，利用TC-RT-PCR技術對菜豆莢斑駁病毒進行檢測，無需繁瑣的RNA提取步驟，直接對病毒提取液進行反轉錄和PCR，不僅操作簡便、結果穩定、特異性強、靈敏度高，而且檢測成本相對較低，因此具有較高的實用價值。
文檔編號C12Q1/68GK101285104SQ20081007115
公開日2008年10月15日 申請日期2008年5月30日 優先權日2008年5月30日
發明者沈建國, 王念武, 贇 虞, 郭瓊霞, 黃可輝 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心