耐氯菌株v430的基因的製作方法
2023-09-19 18:19:25 2
專利名稱：耐氯菌株v430的基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及耐氯菌株V430的基因，它是腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430的16S rDNA基因。其中，腐生葡萄球菌V430已由中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏日期是2005年12月9日，保藏號是CCTCC NO.M205145。通過經典表型鑑定和16S rDNA核苷酸序列分析相結合的方法，對耐氯菌株V430進行了生理生化和16S rDNA分子水平的鑑定，由此確定它為腐生葡萄球菌。
背景技術：
自然界中，存在著一些可以在含有高濃度甚至是極端高濃度氯離子的環境中正常生長的微生物。經過研究發現，這些微生物並非都可以應用於含高濃度氯離子廢水(氯離子濃度為5000-80000mg/L)的處理，只有對其經過嚴格的篩選和馴化後得到的耐氯微生物才能做到。耐氯微生物既可耐受高濃度氯離子環境，又可降解廢水中高濃度的有機物。篩選耐氯微生物的首選取樣點就是所要處理的廢水中，因為在廢水中存在著一定數量的微生物，這些微生物對廢水環境有較好的適應能力。初篩選出來的耐氯微生物經過馴化後，即可作為耐氯微生物菌株應用到廢水處理實踐中。
微生物的分類方法常用的有經典分類方法和分子生物學分類法。經典分類方法主要指依據形態特徵(Morphological characteristics)、培養特徵(Cultural characteristics)及生理生化特徵(Physiological characteristics)等分類的方法。分子生物學分類法，又稱分子分類方法，是指在分子水平上對生物個體的核酸及蛋白質進行研究，並據此對生物個體進行分類的方法。由於16S rDNA序列分析具有突出的作用，因此常被分子分類方法採用。
目前，16S rDNA序列分析的方法主要有兩種一種是16S rDNA提純後用反轉錄酶和保守引物進行測序，另一種是擴增16S rDNA基因對應的DNA序列，然後將PCR產物回收後直接測序。
耐氯菌由於具有耐氯特性，其形態、胞壁、細胞內蛋白、脂肪酸等大分子組成在有鹽存在的情況下會發生不同程度的改變，在菌株鑑定過程中，僅從形態上很難判斷它們的歸屬，而從生理特徵和化學特徵上鑑定又十分費時費力，對於大量的分離菌株更是如此。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是通過16S rDNA序列分析方法，快速對耐氯菌株V430進行分子水平的鑑定，確定其為腐生葡萄球菌。該菌株是新發現的能夠在高濃度氯離子環境下生存的耐氯菌株，它有助於降解廢水中的有機物。
本發明所採用的技術方案如下
耐氯菌株V430的基因，其特徵徵在於為腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的16S rDNA基因，其菌株的16S rDNA全序列如下GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 1423上述16S rDNA序列全長1423個核苷酸。
採用BLAST分析法，將腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列與GenBank資料庫比較，該菌株與腐生葡萄球菌的同源性為98.0-99.0％。
一種獲取耐氯菌株V430的基因的方法，其採用了提取細菌核DNA、16S rDNA基因的PCR擴增、PCR產物的回收，以及16S rDNA的全序列測定和分析步驟，其特徵在於(1)在提取細菌核DNA的過程中，採用了如下的緩衝液，TE緩衝液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE緩衝液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0，(2)在16S rDNA基因的PCR擴增過程中，採用了如下的擴增條件和擴增的引物PCR擴增條件為94℃預變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環30次；最後72℃終延伸10min，PCR擴增的引物是P1正向引物為5』AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3』，P2反向引物為5』GGTTACCTTGTTACGACTT3』，(3)PCR產物的回收將PCR產物以1％瓊脂糖凝膠進行電泳後，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘後加等體積水飽和酚抽提一次離心後取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉澱，離心，用70％乙醇洗沉澱一次，風乾後溶於適量滅菌雙蒸水，(4)16S rDNA的全序列測定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴增30個循環，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；採用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應；然後，在AppliedBiosystem 373ADNA測序儀上測序；然後採用BLAST軟體，將測得的16S rDNA全序列與GenBank資料庫比較分析，最終確定其為腐生葡萄球菌株的基因全序列，在PCR測序時，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
提供腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的16S rDNA基因。本發明基因序列，通過提取細菌核DNA，16S rDNA基因的PCR擴增，PCR產物的回收，以及16S rDNA的全序列測定和分析而獲得。本發明具有快速、簡便的優點。
圖1是本發明腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列2-1a是菌株V430菌株電鏡圖片圖2-1b是菌株V430菌株電鏡圖片圖2-1c是菌株V430菌株電鏡圖片圖2-2是菌株V430在液體不同氯離子濃度的SC培養基上生長情況2-3是菌株V430 PCR擴增瓊脂糖電泳圖(1核DNA，2擴增產物，MMarker)圖2-4a是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率2-4b是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率2-4c是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率2-4d是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率圖具體實施方式
下面結合實施例及附圖對本發明作進一步說明。
本發明提供的腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的基因，其16S rDNA全序列如圖1所示。
採用BLAST分析法，將腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S rDNA全序列與GenBank資料庫比較，該菌株與腐生葡萄球菌的同源性為98.0-99.0％，由此可以從分子水平確定本菌株是腐生葡萄球菌。同時，結合經典分類方法所獲得的形態及生理生化特徵，最終確定本菌株是腐生葡萄球菌。
本發明採用提取細菌核DNA、16S rDNA基因的PCR擴增、PCR產物的回收，以及16S rDNA的全序列測定和分析步驟，來獲取CCTCC NO.M205145菌株的16S rDNA基因全序列。
上述步驟具體如下(1)細菌核DNA的提取1)用高壓滅菌的牙籤挑單菌落接種於LB液管內培養過夜，取1.5ml菌液於Eppendorf管內，8,000rpm室溫離心5min，徹底除去上清。
2)加STE溶液1.5ml洗滌一次，離心棄上清，再加入0.6mlTE溶液，重懸細菌。
3)加30ul10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min4)加65μl10％的SDS，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃水浴2小時，至溶液變清。
5)加入等積體酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白層為止。
6)在上清液中加入1/10體積的3M的NaAc(pH5.2)。
7)加入等體積的異丙醇，沉澱DNA。用玻璃棒纏繞挑出DNA細絲，在用70％的乙醇洗滌一次，自然涼幹，並將DNA溶於100μl TE溶液中。
8)加入終濃度為50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存備用。
(2)16S rDNA基因的PCR擴增在50μL反應體積中加入1μL模板DNA，0.1μg；0.5μLP1和P2，終濃度為0.5μM；1μLdNTP，每種NTP0.2mM；0.5μLTaq聚合酶，2U；5μL 10×PCR緩衝液。
PCR擴增條件為94℃預變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環30次；最後72℃終延伸10min。
PCR擴增的引物是P1正向引物為5』AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3』，P2反向引物為5』GGTTACCTTGTTACGACTT3』。
(3)PCR產物的回收將PCR產物以1％瓊脂糖凝膠進行電泳後，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘後加等體積水飽和酚抽提一次離心後取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉澱，離心，用70％乙醇洗沉澱一次，風乾後溶於適量滅菌雙蒸水。
(4)16S rDNA的全序列測定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴增30個循環，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；採用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應；然後，在AppliedBiosystem 373ADNA測序儀上測序；然後採用BLAST軟體，將測得的16S rDNA全序列與GenBank資料庫比較分析，最終確定其為腐生葡萄球菌株的基因全序列。
在PCR測序時，使用如下的正反向引物
P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
本發明採用對16S rDNA序列測定和分析的方法對細菌進行分子水平的鑑定。以細菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，(用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖2-3所示。
耐氯菌株V430的篩選方法及應用如下一、一株耐氯菌株V430的篩選方法(一)、材料準備1、菌源和實驗廢水(1)菌源處理皂素廢水的生化系統中的活性汙泥；(2)實驗廢水(即混合皂素廢水)本實驗廢水取自湖北省十堰市方坤置業有限公司皂素生產廢水；經內電解和CaO調配後，具體指標為pH＝7.5-8.2，COD＝4000-17000mg/L，Cl-＝8000-30000mg/L，NH4-N 140-300mg/L。
2、培養基分離(完全)培養基蛋白腖10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml。
篩選培養基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水(COD濃度為1000mg/L)，pH＝7.5；微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
擴大培養基蛋白腖10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培養基蛋白腖10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl2加入量為12.6g-140g；當CaCl2加入量為12.6g時，SC培養基內[Cl-]＝10000mg/L。
斜面培養基蛋白腖10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培養基分別於121℃高壓滅菌30min後備用。
3、實驗儀器和設備國華SHA-B恆溫振蕩器，SHH150G光照生物培養箱，臥式壓力蒸汽滅菌器，WMX-1型微波密封消解COD速測儀，722S分光光度計，光學顯微鏡，pH計，超淨工作檯，鼓風乾燥箱，超薄切片機，日立H-7000FA投射顯微鏡，PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠紫外觀測儀等。
(二)、菌株的分離與篩選1、菌膠團的破碎取2g皂素廢水處理系統中的厭氧活性汙泥，加入事先滅菌好的裝有100ml無菌水的250ml的三角瓶內，並加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團打碎，得泥水混合物，備用。
2、耐氯離子優勢菌種的分離利用無菌移液管吸取0.5ml上述泥水混合物，加入分離培養基4.5ml，35℃厭氧恆溫培養5-7天，待試管培養基變混濁，說明細菌已經生長，然後平板稀釋塗布，挑取在菌落特徵上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，並於斜面培養基上斜面保存。
3、耐氯離子優勢菌種的篩選挑取上述分離出的單菌落，分別接種於篩選培養基內，35℃厭氧恆溫培養5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐高氯離子的菌株。經過篩選，最後得到一株編號為菌株V430的菌株，即耐氯菌株V430。耐氯菌株V430在加入不同濃度氯離子的液體SC培養基上生長情況如圖2-2所示(同時輔以[Cl-]＝3000mg/L時的OD600nm為對照值)。
二、耐氯菌株V430的菌落形態、生理和生化特徵見表1。細胞形態見圖2-1a、圖2-1b、圖2-1c。
表1菌株V430的菌落形態特徵以及主要的生理特徵
表中符號說明「+」90％以上的菌株為陽性，「-」90％以上的菌株為陰性。
三、菌株V430為新的菌株將菌株V430的16S rDNA基因序列與國際GenBank資料庫中的序列進行網上同源性比較發現，細菌V430與腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)多個菌株的同源性高達98-99％以上。綜合菌株V430的生理生化以及分子鑑定結果，可確定細菌V430為腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，菌株V430命名為腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430(即耐氯菌株V430)，查閱有關資料，尚無腐生葡萄球菌屬有關高濃度氯離子條件下難降解有機廢水以及對其耐氯能力研究的報導。腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430為新的菌株，已於2005年12月9日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205145。
本發明分離、篩選出的菌株V430，具有較好降解高濃度氯離子難降解皂素廢水的功能。這就拓寬了人們對腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)在其功能方面的應用研究思路，並為降解含高濃度氯離子皂素廢水提供了有用的菌源和技術，具有較強的實際應用價值。
四、耐氯菌株V430的應用挑取腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430單菌落，於擴大培養基中培養24h，取皂素混合廢水([Cl-]＝8000-20000/L，COD＝8000-10000mg/L)50ml分別加入250ml的錐形瓶中，分別加入菌株的菌懸液1ml，35℃、pH值＝7.5，厭氧反應5天，計算菌株對廢水的COD的去除情況，降解因素實驗除了所考察的因素外，其餘均同以上條件。菌株V430去除COD的效率好，為50-60％；結果見圖2-4a、圖2-4b、圖2-4c、圖2-4d。
所述的擴大培養基為蛋白腖10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L，pH＝7.5。
1)為了考察菌株在不同氯離子濃度下，對COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調節氯離子濃度分別為9864.2、14980、21061、24780、30080mg/L。耐氯菌株V430去除效果結果如圖1-4a。
從圖2-4a可以看出，當[Cl-]＝9864.2mg/L時，反應時間為3d，菌株V430對COD的去除率僅為39.31％，但是隨著廢水中氯離子濃度的升高，菌株V430對COD的去除率增加，當廢水中氯離子濃度達到2.5萬mg/L時，菌株V430對COD的去除率可達64.38％，並且菌株V430對COD的去除率隨著廢水中氯離子濃度的繼續增加而變化不大，當廢水中氯離子濃度高達3萬mg/L時，菌株V430對COD的去除率仍保持在60％。
2)為了考察菌株在不同COD濃度下(6610.4、7906.4、11209.6、13420.0、16196.2mg/L)，對COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調節氯離子濃度分別為20000mg/L。耐氯菌株V430去除效果結果如圖2-4b。通過實驗可知當廢水中[Cl-]＝20000mg/L、COD濃度達到1萬mg/L時，菌株V430對COD的去除率較好，可達62.37％。
3)從圖2-4c和2-4d可以看出，菌株V430對COD的去除率隨pH的增加先增加後下降，其最高去除率在pH為7.5-8時，達到62％。離心處理後的廢水，發現pH為7-8時，溼菌體量明顯高於pH為9、10、11時，可見在pH在中性時，有利於菌株的生長；當接種量在1-4ml之間變化時，菌株V430對COD的去除率無明顯變化，基本為60％，當接種量為1ml時，其去除率最好。這是因為菌株的生長需要一定的營養物質，當菌懸液為1ml時，其需要的物質容易得到滿足。
110中國地質大學(武漢)120耐氯菌株V430的基因160142321012111423bp212DNA213腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)220
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4001GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320
TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 142權利要求
1.耐氯菌株V430的基因，其特徵徵在於為腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的16S r DNA基因，其菌株的16S r DNA全序列如下GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 1423上述16S r DNA序列全長1423個核苷酸。
2.根據權利要求1所述的耐氯菌株V430的基因，其特徵在於採用BLAST分析法，將腐生葡萄球菌V430 CCTCC NO.M205145的菌株的16S r DNA全序列與GenBank資料庫比較，該菌株與腐生葡萄球菌的同源性為98.0-99.0％。
3.一種獲取權利要求1或2所述耐氯菌株V430的基因的方法，其採用了提取細菌核DNA、16S rDNA基因的PCR擴增、PCR產物的回收，以及16S rDNA的全序列測定和分析步驟，其特徵在於(1)在提取細菌核DNA的過程中，採用了如下的緩衝液，TE緩衝液10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA-Na2，pH8.0，STE緩衝液0.1mol/L NaCl；10mmol/L Tris-Cl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0，(2)在16S rDNA基因的PCR擴增過程中，採用了如下的擴增條件和擴增的引物PCR擴增條件為94℃預變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環30次；最後72℃終延伸10min，PCR擴增的引物是P1正向引物為5』AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3』，P2反向引物為5』GGTTACCTTGTTACGACTT3』，(3)PCR產物的回收將PCR產物以1％瓊脂糖凝膠進行電泳後，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘後加等體積水飽和酚抽提一次離心後取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉澱，離心，用70％乙醇洗沉澱一次，風乾後溶於適量滅菌雙蒸水，(4)16S rDNA的全序列測定和分析加入1μL模板DNA，＜0.1μg；PCR擴增30個循環，其條件是94℃1min，55℃30s，72℃2min；採用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應；然後，在AppliedBiosystem 373 A DNA測序儀上測序；然後採用BLAST軟體，將測得的16S rDNA全序列與GenBank資料庫比較分析，最終確定其為腐生葡萄球菌株的基因全序列，在PCR測序時，使用如下的正反向引物P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC，P-rGGATAACA ATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
全文摘要
本發明涉及耐氯菌株V430的基因，它是腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430的16S rDNA基因，本發明基因序列，通過提取細菌核DNA，16S rDNA基因的PCR擴增，PCR產物的回收，以及16S rDNA的全序列測定和分析而獲得。本發明具有快速、簡便的優點。
文檔編號C12N1/20GK1900283SQ20061001813
公開日2007年1月24日 申請日期2006年1月10日 優先權日2006年1月10日
發明者信欣, 王焰新, 鮑建國, 劉慧 , 李平, 楊雪芬 申請人:中國地質大學(武漢)