轉基因油菜Oxy－235事件外源插入載體左邊界旁側序列及其應用的製作方法
2023-09-20 03:06:00
專利名稱：轉基因油菜Oxy－235事件外源插入載體左邊界旁側序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域中轉基因油菜的檢測，具體地說，涉及一種轉基因油菜外源基因整合事件Oxy-235的外源插入載體左邊界旁側序列及其應用。
背景技術：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉基因作物已在很多國家獲準種植和生產，有的被加工成食品、飼料或用作食品添加劑。由於轉基因產品的生態安全和食用安全一直備受爭議，30多個國家和地區相繼實施轉基因產品標識制度。
根據轉基因產品中外源基因的序列信息，外源基因在轉基因構建體上的組合方式，以及構建體在基因組上的整合位點，可以採用基因特異性、載體特異性和事件特異性的檢測方法。
1、基因特異性檢測方法由於大量的轉基因載體使用了相同的外源基因，因此基因特異性檢測方法並不適合當前轉基因產品不斷湧現的現實。
2、載體特異性檢測方法載體特異性檢測方法利用基因元件之間的邊界序列特徵，能夠有效鑑定使用類似基因元件的不同構建體，而且存在序列信息容易獲得的特點，因此被很多研究者所使用。但是，由同一構建體可能獲得不止一個不同特性的轉化株，甚至可能被轉化到不同的物種中，而這些轉化株未必全部經過了安全評估。因此載體特異性檢測方法不能識別不同的轉基因品系，也不能判別該轉基因品系是否已經過安全評估。
3、事件特異性的檢測方法事件特異性檢測的基礎是轉基因構建體在基因組DNA序列上的整合位點具有高度特異性，即使是相同的載體多次轉化，整合的位置和整合位點特徵也是不可重複的。因此，根據不可重複的整合位點特徵序列，開發出了事件特異性的檢測方法。與前兩種方法相比，事件特異性檢測具有最高的特異性，最適合做轉基因產品的定性和定量檢測。但轉基因構建體的完整信息通常難以獲得，而已知序列基因元件可能距邊界有相當的距離，而且在整合的過程中，載體和基因組之間可能發生複雜的重組，因此，分離旁側序列成為事件特異性檢測的關鍵。2000年2月，歐盟為此資助了Qpcrgmofood European Project項目，該項目現已成功分離獲得多個品種旁側序列並用於建立事件特異性檢測方法。當前，事件特異性檢測方法已經被用於轉基因Roundup Ready soybean，Mon810 maize等一系列轉基因商品化品種的檢測。
經對現有專利和其他文獻的檢索，尚未發現任何關於轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列和利用此序列建立事件特異性定性、定量PCR(聚合酶鏈式反應)檢測的報導。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術在檢測轉基因油菜Oxy-235事件和轉基因油菜品種Oxy-235中存在的不足，提供一種轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列及其應用。
本發明的目的是這樣實現的本發明以轉基因油菜品種Oxy-235為材料，利用Invitrogen公司GenomeWalker試劑盒構建基因組文庫，並利用引物OXYLB-15』CACTGTCGGCAGAGGCATCTTCAACG3』和OXYLB-25』AGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGT3』與試劑盒提供的接頭引物，以PCR技術(聚合酶鏈式反應)擴增獲得Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列SEQ NO.1。
轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列的特徵是(1)第1至831個鹼基來源於外源插入載體序列；(2)第832至923個鹼基來源於油菜基因組序列；(3)由來源於外源插入載體的第1至831個鹼基和來源於油菜基因組序列的第832至923個鹼基共同組成油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列。
上述轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列的應用研究(1)利用該序列特徵設計轉基因油菜外源基因整合事件Oxy-235的事件特異性定性PCR檢測方法；(2)利用該序列特徵設計轉基因油菜外源基因整合事件Oxy-235的事件特異性定量PCR檢測方法；(3)利用該序列特徵設計轉基因油菜品種Oxy-235的品系特異性定性PCR檢測方法；(4)利用該序列特徵設計轉基因油菜品種Oxy-235的品系特異性定量PCR檢測方法。
與現有技術相比，本發明具有的優點和效果如下1、本發明首次測序公布轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列。
2、本發明首次分析並確認轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列中不同鹼基的來源，並確定外源插入載體序列和油菜基因組序列的接合位點。
3、利用本發明發現的序列特徵，建立轉基因油菜Oxy-235事件以及轉基因油菜品種Oxy-235的事件特異性定性、定量PCR檢測方法。
4、本發明適用於建立轉基因油菜Oxy-235事件以及轉基因油菜品種Oxy-235的其他事件特異性PCR檢測方法等方面。
圖1—轉基因油菜Oxy-235事件左邊界結合位點，其結合位點特徵序列。
圖2—轉基因油菜Oxy-235事件特異性定性PCR擴增，其中M分子量Marker；1—轉基因油菜Ms8Rf3基因組DNA模板；2—轉基因油菜Ms1Rf1基因組DNA模板；
3—轉基因油菜Ms1Rf2基因組DNA模板；4—轉基因油菜Oxy-235基因組DNA模板；5—轉基因油菜T45基因組DNA模板；6—轉基因油菜Topas 19/2基因組DNA模板；7—轉基因油菜RT45基因組DNA模板8—非轉基因油菜中油821模板。
圖3—轉基因油菜Oxy-235事件特異性定量PCR擴增。
具體實施例方式
1、轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列的PCR擴增先將20％SDS預熱到65℃，取15ml SDS抽提buffer(0.1TrisHCl，0.05MEDTA，1M NaCl pH8.0)加入到50ml離心管，再加入2.5μl β-巰基乙醇，混勻；液氮研磨3g左右的葉片，將粉末轉至50ml含抽提buffer的50ml離心管中，在振蕩器上振蕩混勻，加入2ml預熱的20％SDS，混勻，65℃水浴至少30分鐘，其間要輕輕搖動試管；水浴後，迅速將離心管置於冰上，加入3ml 3M KAc，混勻，在冰上放置30分鐘；4℃ 5000g離心5min；將上清轉移到新的50ml離心管中，加入2/3體積的異丙醇，混勻，-20℃放置30min以上；6000g，4℃離心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗一遍，真空乾燥，用超純水溶解DNA，溶解後，將溶液轉移到15ml的離心管中；按DNA溶解體積的1％加蛋白酶K，55℃水浴30min；加入等體積苯酚，混勻，輕搖30min，8000g離心10min；轉移上清至新的tube中，加等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)，輕搖20min，8000g離心15min；轉移上清至新的tube中，加等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，輕搖20min，8000g離心15min；吸取上清，每管加入5μl RNase，混勻，37℃水浴1hr降解RNA；用等體積的苯酚抽提一次，輕搖20min，8000g離心15min；轉移上清至新的離心管中，加等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)，輕搖20min，8000g離心15min；吸上清加入1/10體積3M NaAC，混勻，加入等體積異丙醇，-20℃放置30min，沉澱DNA；6000g，4℃離心15min，倒掉上清，用75％乙醇洗2遍，離心去掉75％乙醇，真空乾燥；乾燥後，用超純水溶解DNA備用利用Invitogen公司GenomeWalker試劑盒，以油菜Oxy-235基因組DNA為材料，根據試劑盒提供的方法構建油菜Oxy-235基因組文庫。
合成引物序列如下OXYLB-15』CACTGTCGGCAGAGGCATCTTCAACG3』和OXYLB-25』AGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGT3』。
以Oxy-235基因組文庫為模板，利用試劑盒提供的接頭引物AP1和OXYLB-1進行PCR擴增。在50ul反應體系中，取Oxy-235基因組文庫DNA 1ul，其他各組分終濃度為，KOD Plus Buffer 1x，dNTPs每種200uM，MgSO4 1mM，引物各100nM，KOD Plus酶1u。反應條件為，94℃ 2分鐘預變性，94℃ 15秒，68℃ 3分鐘，循環45次，68℃保溫7分鐘。取1ul PCR產物，用水稀釋50倍，從中取1ul作為第二輪PCR的模板。第二輪反應以試劑盒提供的AP2和OXYLB-2為引物，反應體系與第一輪相同。反應條件為，94℃ 2分鐘預變性，94℃ 15秒，68℃ 3分鐘，循環25次，68℃保溫7分鐘。瓊脂糖電泳分離DNA，EB染色鑑定。
以QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit純化PCR產物。
將PCR產物與EcoRV酶切的pZero2(Invitrogen)載體連接。連接體系DNA mixture 22μl；2.5μl 10×T4 DNA Ligase Buffer with 1mM ATP；0.5μlT4 DNA Ligase(NEB)。22℃連接至少1hr。
根據《分子克隆實驗指南》提供的方法製備大腸桿菌TOP10(Invitrogen)感受態細胞，並以連接產物轉化。挑取單克隆，以突變位點特異引物進行菌落PCR檢測重組子。將篩選出的克隆擴大培養，小量製備質粒，酶切驗證。
將篩選出的克隆送測序公司測序。將獲得的序列信息，利用NCBI提供的Blastn軟體，分析不同部分序列的來源，從而判斷基因組和載體的結合位點。
2、應用方法1)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Oxy-235事件和轉基因油菜品種Oxy-235的事件特異性定性PCR檢測方法合成引物序列如下OXYLG5』AGAGAATCGTGAAATTATCTCTACCG3』和OXYLV5』ATTGACCATCATACTCATTGCTGA3』。
分別取轉基因油菜品種Ms8Rf3，Ms1Rf1，Ms1Rf2，Oxy-235，T45，Topas 19/2，GT73；非轉基因油菜品種中油821，以及擬南芥，白菜，甘藍，芥菜，大豆，水稻、玉米、棉花基因組DNA為模板，分別利用OXYLG/OXYLV引物組合進行PCR擴增。在25ul反應體系中，以100ng不同來源基因組DNA為模板，其他各組分終濃度為，PCR Buffer 1x(含10mM Tris·HCl pH8.3，KCl 50mM)，dNTPs每種200uM，MgCl22.5mM，引物各250nM，Hot Start Taq酶1u。反應條件為，94℃ 2分鐘預變性，94℃ 15秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，循環35次，72℃保溫2分鐘。PCR產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色後鑑定是否存在擴增產物。
2)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Oxy-235事件和轉基因油菜品種Oxy-235的事件特異性定量PCR檢測方法合成TaqMan探針序列如下OXYLP5』FAM-CCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCC-TAMRA3』。
針對Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列的引物、探針組合被用於螢光定量PCR分析。螢光定量PCR分析在一臺MJR DNA Engine Opticon 2 ContinuousFluorescence Detector上進行，檢測及分析軟體為Opticon Monitor 2 Version2.02。
Oxy-235事件定量檢測反應體積20ul，含模板DNA 100ng，其他組分含量為TaqMan Buffer 1x(50mM KCl，10mM.Tris-HCl，10mM EDTA，pH 8.3)，MgCl24mM，引物OXYLG和OXYLV 300uM，探針OXYLP 150uM，dATP dCTP dGTP各200uM，dUTP 400uM，Amperase Uracil N-glycosylase(UNG)0.2u，AmpliTaq Gold 1.25u。
TaqMan反應條件為50℃ 2分鐘和95℃ 10分鐘預變性以後，進行50次PCR循環95℃ 15秒變性，60℃ 1分鐘退火及延伸，讀板。
轉基因油菜Oxy-235基因組DNA被相同濃度非轉基因油菜821 DNA稀釋至不同含量，以100ng的混和油菜基因組DNA為模板，進行螢光定量PCR反應。不同稀釋倍數，分別含100，13，1.3，0.13，0.013，0.0065ng Oxy-235基因組DNA的混和DNA樣品被用於建立標準曲線。所有的螢光定量反應都重複3次。
根據標準曲線優化的結果，利用與建立標準曲線相同的PCR反應條件，以標準曲線為參照測定含有Oxy-235基因組DNA的混和油菜DNA樣品中Oxy-235基因組DNA的量。取100ng基因組DNA為模板，利用不同含量標準樣品做標準曲線，根據獲得的標準曲線和轉基因樣品的Ct值，計算Oxy-235基因組DNA的質量，從而計算出Oxy-235在樣品中的含量。所有螢光定量反應都重複3次。
3.實驗結果
1)轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列的PCR擴增和測序分析利用AP1/OXYLB-1和AP2/OXYLB-2引物組合，以Oxy-235基因組DNA構建的GenomeWalker文庫為模板，成功擴增獲得923bp擴增產物。對PCR產物測序，並經Blastn分析，發現其中831個鹼基對與不同來源載體序列同源，其左邊界重複序列丟失，而其餘92個鹼基對與白菜基因組序列同源被認為是油菜基因組序列。具體轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列見SEQ NO.1。
根據以上分析，本發明分離獲得的序列包含轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界結合位點，其結合位點特徵序列如圖1所示。
2)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Oxy-235事件和轉基因油菜品種Oxy-235的事件特異性定性PCR檢測方法以不同來源轉基因油菜、非轉基因油菜基因組DNA為模板，利用Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列特異性引物組合OXYLG/OXYLV，進行PCR擴增，結果如圖2。只有Oxy-235基因組DNA可以擴增出特異的PCR產物，而其他轉基因和非轉基因油菜DNA做模板時都沒有擴增產物可觀察到。同時以其他非油菜植物基因組DNA為模板，也沒有可見的PCR擴增產物。因此，我們認為，該引物組合具有良好的特異性，適合用於事件特異性的檢測。
3)利用本發明中所提供序列設計轉基因油菜Oxy-235事件和轉基因油菜品種Oxy-235的事件特異性定量PCR檢測方法根據梯度稀釋模板，3次重複獲得的螢光曲線信息，針對Oxy-235事件的特異性螢光定量PCR反應標準曲線被建立起來，如圖3所示，其R2值為0.992，表明外源基因的拷貝數與螢光強度都具有良好的對應關係，適合用於外源基因的精確定量。
為了驗證本研究中建立的定量方法的精確性，我們使用了從標準轉基因油菜Oxy-235產品中提取的基因組DNA用非轉基因油菜基因組DNA稀釋至一定含量，並以不含轉基因油菜Oxy-235基因組DNA的相同量基因組DNA做對照，作為實時螢光定量PCR反應的模板，並根據相同條件下獲得的標準曲線，計算不同樣品中轉基因油菜Oxy-235基因組DNA的含量。
以不含轉基因油菜Oxy-235的非轉基因油菜基因組DNA為模板，沒有擴增產物被檢測到。對於混和實驗樣品，用本研究中建立Oxy-235事件特異性螢光定量檢測方法來檢測，都和理論值非常接近，誤差小於15％。
以上結果可以看出，本發明為轉基因油菜事件Oxy-235以及轉基因油菜Oxy-235的定量檢測分析提供了基於簡單、可靠的測定方法，可以用於不同來源、不同含量的混和產品中轉基因油菜Oxy-235事件以及轉基因油菜品種Oxy-235的定量。本發明為轉基因標識提供了一種有用的參考，對轉基因產品的控制提供了必要的手段。
序列表110中國農業科學院油料作物研究所120轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列及其應用16012101211923212DNA213油菜(Brassica napus cv.Oxy-235)400
gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg gatattaccc tttgttgaaa agtctcaatc 60gatggaactg ttcgccagtc tttacggcga gttctgttag gtcctctatt tgaatctttg 120actccatggc ctttgattca gtgggaacta cctttttaga gactccaatc tctattactt 180gccttggttt gtgaagcaag ccttgaatcg tccatactgg aatagtactt ctgatcttga 240gaaatatatc tttctctgtg ttcttgatgc agttagtcct gaatcttttg actgcatctt 300taaccttctt gggaaggtat ttgatctcct ggagattatt gctcgggtag atcgtcttga 360tgagacctgc tgcgtaagcc tctctaacca tctgtgggtt agcattcttt ctgaaattga 420aaaggctaat cttctcatta tcagtggtga acatggtatc gtcaccttct ccgtcgaact 480tcctgactag atcgtagaga tagaggaagt cgtccattgt gatctctggg gcaaaggaga 540tccccgggcg cgaattgacc gggatcntcg atagagtcga gacacgtcga aataaagatt 600tccgaattag aataatttgtt tattgcttt cgcctataaa tacgacggat cgtaatttgt 660
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1.一種轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列，其特徵是(1)第1至831個鹼基來源於外源插入載體序列，SEQ NO.1；(2)第832至923個鹼基來源於油菜基因組序列，SEQ NO.1；(3)由來源於外源插入載體的第1至831個鹼基和來源於油菜基因組序列的第832至923個鹼基共同組成的DNA序列，轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列；
2.轉基因油菜Oxy-235事件外源插入載體左邊界旁側序列的應用，其特徵是(1)利用該序列特徵設計轉基因油菜外源基因整合事件Oxy-235的事件特異性定性PCR檢測方法；(2)利用該序列特徵設計轉基因油菜外源基因整合事件Oxy-235的事件特異性定量PCR檢測方法；(3)利用該序列特徵設計轉基因油菜品種Oxy-235的品系特異性定性PCR檢測方法；(4)利用該序列特徵設計轉基因油菜品種Oxy-235的品系特異性定量PCR檢測方法；
全文摘要
本發明公開了一種轉基因油菜Oxy－235事件外源插入載體左邊界旁側序列及其應用，涉及生物工程技術領域中轉基因油菜的檢測。本發明以轉基因油菜品種Oxy－235為材料，獲得Oxy－235事件外源插入載體左邊界旁側序列，序列為SEQNO.1。其中第1－831位鹼基與插入載體序列相同，第832－923位鹼基與插入載體無同源性，為油菜基因組序列。本發明建立了轉基因油菜外源基因整合事件Oxy－235的事件特異性定性、定量檢測方法，用於建立轉基因油菜Oxy－235的其他事件特異性PCR檢測方法研究。
文檔編號C12N15/29GK101020903SQ20071005135
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月24日 優先權日2007年1月24日
發明者盧長明, 吳剛, 武玉花, 肖玲 申請人:中國農業科學院油料作物研究所