抗獨特型抗cea抗體分子及其作為癌疫苗的用途的製作方法

2023-09-19 09:52:00 2

專利名稱：抗獨特型抗cea抗體分子及其作為癌疫苗的用途的製作方法
技術領域：
本發明提供了適用作針對CEA(癌胚抗原)陽性腫瘤的抗獨特型疫苗的分子，優選地為經設計的免疫球蛋白。所述分子對CEA荷瘤細胞均可誘導MHC I類和MHC II類介導的免疫反應，以產生有效且持久的宿主抗腫瘤反應。本發明提供了有改進疫苗特性的抗獨特型抗CEA抗體，優選地為小鼠抗體708的經修飾形式。該修飾涉及將來自例如CEA、CD55抗原和CEA癌特異MHC表位的序列段導入到所述抗體分子的可變區。
背景技術：
提供能刺激或增強人免疫系統與癌細胞相互作用以從身體中消除癌細胞的組合物是長久以來所期望的。與疫苗接種對傳染因子提供免疫不同，利用免疫系統消除癌細胞是更具有挑戰性的技術目的，不僅僅因為免疫系統需要針對已建立免疫耐受的細胞或在某些情況下，癌細胞自身可獲得使它們能逃避正常免疫檢測或清除的特性。
本發明涉及誘導針對癌細胞的T細胞依賴性免疫反應。以前的大部分工作集中於CD8陽性T細胞和MHC I類限制性抗原，但本發明認識到MHC II類限制性CD4陽性T細胞反應的重要性並在優選的實施方案中提供了均能遞呈I類和II類限制性癌抗原表位的疫苗。
本發明分子靶向的癌抗原為癌胚抗原(CEA)。CEA為大量實體癌過量表達的細胞表面蛋白質並且它已成為世界上許多不同研究小組作為疫苗研發靶的焦點。該分子為90％結腸直腸癌、70％胃癌、胰腺癌及非小細胞肺癌和50％乳腺癌表達的gpi-錨定的180kDa糖蛋白。該蛋白質顯示與正常粒細胞上發現的非特異交叉反應抗原(NCP)和膽糖蛋白(BGP)有很高的同源性。CEA可在大多數CEA陽性腫瘤的患者的循環中檢測到，並且它也在人胎兒的正常消化道中發現。該蛋白質似乎作為粘附分子起作用並且期望直接針對CEA的治療可在預防腫瘤轉移中是有好處的。CEA是癌免疫治療包括疫苗接種方案中的吸引人的靶，因為當它出現時，它一般在腫瘤表面以高水平存在。
許多以前的研究利用CEA來源的蛋白質序列用於治療的疫苗接種方法中。小鼠的研究已經證明了痘苗病毒表達的CEA(rV-CEA)比重組CEA作為疫苗更具優越性，並且已經顯示了誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應導致已建立的腫瘤退化[Kantor，J.等人(1992)，J.Natl.Cancer Inst.841084-1091]。當用於患有轉移癌的患者的I期臨床研究時，rV-CEA能誘導針對CEA的CTL反應而殺死腫瘤細胞[Tsang，K.Y.等人(1995)J.Natl.Cancer.Inst.87982-990]。然而也引起對痘苗的顯著免疫反應，這限制了對這些受試者繼續免疫以達到有用的臨床結果的前景。其它涉及初次劑量用rV-CEA及然後用禽痘病毒載體編碼的CEA加強的臨床研究對也應用GM-CSF和低劑量IL-2的患者中達到滿意反應[Marshall，J.L.等人(2000)J.Clin.Oncology.183964-3973]。在證實這種複合的疫苗接種方案的實用性前需要進一步的臨床研究。
另一用於靶CEA的方法是抗獨特型免疫。識別抗腫瘤抗體結合位點的抗獨特型抗體能作為抗原的功能性模擬物。因此可將它們均用於刺激體液反應和細胞反應。在患晚期結腸直腸癌的患者中進行了模擬CEA的小鼠抗獨特型3H1的I期臨床試驗。3H1抗體在美國專利US,5,977,315中進行了詳細描述，並且已經顯示了該抗體誘導患者的抗CEA抗體反應，一些患者顯示了對CEA的增殖反應[Foon，K.A.等人(1995)J.Clin.Invest.96334-342]。治療患有微小殘餘疾病的患者的其它研究顯示患者對抗獨特型抗體和CEA均有T細胞反應。但該研究中，抗獨特型不能引起CTL反應[Foon，K.A.，等人(1999)J.Clin.Oncology.172889-2895]。
已經對模擬除CEA外的其它腫瘤抗原的抗獨特型抗體作為治療疫苗的實用性進行了臨床研究。其實例包括GD2抗原和抗獨特型抗體1A7[US，6,509,016]，還包括GD3抗原的抗獨特型抗體[US，5,529,922；EP0473721]及黑素瘤相關的p97抗原的抗獨特型抗體[US，4,918,164]，這裡僅舉了幾個例子。利用抗獨特型抗體的更複雜的過繼免疫治療方法已進行深入化，如在US，5,766,588中的教導。
用抗獨特型抗體的疫苗接種方案的一個特定實例是通過對人單克隆抗體107AD5的研究提供的。已發現該抗體提供CD55蛋白的分子模擬物，CD55蛋白質也已知為結腸直腸癌細胞上發現的腫瘤相關抗原791T/gp72。CD55蛋白的功能是保護細胞免受補體介導的攻擊並且在癌細胞中通常發現該蛋白水平升高[Li，L.，等人(2001)Br.J.Cancer 8480-86]。在許多臨床試驗中顯示了107AD5抗體的前景並且在許多患者中能測量到包括IL-2誘導的抗腫瘤免疫反應[Robins，R.A等人(1991)Cancer Res.515425-5429；Denton，G.W.L.，等人(1994)Int.J.Cancer 5710-14；及W090/04415]。然而更多最近的試驗表明僅用抗體對大荷瘤患者可能無效，而有該抗體的疫苗接種策略對有微小殘餘疾病的患者可能更有好處[Maxwell-Armstrong，C.A.等人(2001)Bri.J.Cancer 841443-1446]。
儘管有明顯的進展，還需要能在總體上對人癌細胞及CEA陽性癌細胞和/或特別是CD55過量表達陽性的癌引起免疫反應的改進分子。
發明概述本發明提供了適合用作針對CEA陽性腫瘤的抗獨特型疫苗的多肽。發明人認識到對CEA荷瘤細胞需要誘導MHC I類和MHC II類介導的免疫反應的重要性，用於產生有效且持久的宿主抗腫瘤反應。文中的多肽組合物均能提供MHC I類和MHC II類限制性CEA表位。
本發明提供了修飾多肽，其中的多肽序列大部分來自小鼠抗獨特型抗體708。當多肽序列與抗體708的V-區有共同的序列段時，本發明提供的許多實施方案中還另外提供了來自CEA和/或CD55抗原的序列段。又一實施方案中提供了進行胺基酸替代導致去除不需要T細胞表位的多肽序列。在這些組合物中目的集中於對CEA和/或CD55表位組分誘導的免疫反應並去除對需要的抗癌反應無貢獻的競爭肽表位。
親本708抗體用抗CEA抗體NCRC23作為抗原而產生的。NCRC23單克隆抗體自身與CEA特異表位結合併顯示與正常組織的最小交叉反應性[Price，M.R.等人(1987)，Cancer，Immunology and Immunotherapy.2510-15]。抗獨特型抗體708特異識別NCRC23並能在小鼠和大鼠中誘導識別CEA的Ab3抗體。特別重要的是708抗獨特型抗體也能誘發癌患者的人T淋巴細胞識別CEA或表達CEA的腫瘤細胞[Durrant，L.G.等人(1992)，Int.J.Cancer.50811-816]。
已獲得了708抗體的可變區序列並分析了與CEA蛋白區同源的序列元件的存在。H-鏈的第一和第二互補決定區(CDRH2和CDRH3)與CEA顯示同源，但與密切相關分子NCA或BGP不同源。708可變區及H-鏈的互補決定區(CDRs)特別代表CEA分子特有元件的分子模擬物並且可能提供708抗體針對CEA的獨特型性質的基礎。
本發明包含親本抗體708的經修飾衍生物。在所有優選的實施方案中經修飾708分子包括替代了親本鼠C區的人C區結構域。在分子的V區進行了其它修飾。能將這些修飾總結為包括針對下列目標的一個或更多變化，其中至少包括針對CEA序列的變化I.將存在的CEA同源性區域轉變為CEA序列相同區。
II.將存在的短序列段用CEA衍生序列段代替。
III.將存在的短序列段用抗體107AD5衍生序列段代替。
IV.將存在的短序列段用CD55衍生序列段代替。
V.通過將特異的胺基酸殘基用另外的胺基酸殘基替代，去除不需要的T-細胞表位。
因此本發明提供了新的多肽序列，這些多肽序列每一序列按照一個或多個上述目的設計並且每一序列的特徵為具有與天然708V-區、人CEA分子和/或人CD55分子或以小鼠抗體107AD5形式的CD55分子的獨特型同一性或高同源性的序列元件。本發明引入了許多多肽序列，這些多肽序列一起包含所有上述所列「設計元件」。於此公開的每一多肽是本發明的總之，本發明涉及下列主題·衍生自親本抗獨特型抗CEA抗體並且包含人源恆定區及人工合成可變區的免疫球蛋白分子或其片段，其中所述人工合成可變區包含一個或多個來自人腫瘤抗原CEA(癌胚抗原)的多於4、優選5-20個連續胺基酸殘基的序列段。最優選有與對應的抗獨特型抗體的輕鏈或重鏈的CDR有同樣長度(胺基酸殘基數量)(例如5、7、8、9、10、11、12、17、18)的序列段。
·對應的免疫球蛋白分子，其中至少所述序列段之一為所述免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的互補決定區(CDR)的組分或與所述CDR鄰近的構架區鄰近殘基重疊。
·對應的免疫球蛋白分子，其中所述組分形成所述CDR的胺基酸殘基的30至100％，優選80-100％。
·對應的免疫球蛋白分子，其中所述親本抗獨特型抗體為小鼠抗體708。然而，按照本發明，其它抗獨特型抗CEA抗體也適合。
·對應的免疫球蛋白分子，可變區內還額外包含來自人CD55抗原或抗獨特型抗CD55抗體(其中優選抗體105AD7)高變區的5至25，優選10至20個連續胺基酸殘基的序列段。
·對應的免疫球蛋白分子，其中可變區內對CEA陽性人癌細胞的免疫反應無貢獻的潛在MHC II類表位已通過胺基酸替代去除。
·在可變區內額外包含CEA衍生序列段的對應免疫球蛋白分子，所述CEA衍生序列段為對CEA陽性人癌細胞反應的MHC I類表位，優選TLLSVTRNDV和YLSGANLNL，其中在本發明一個優選的實施方案中所述序列為所述免疫球蛋白輕鏈一個或多個CDR的部分或全部。
·可變區內額外包含CEA衍生序列段的對應免疫球蛋白分子，所述CEA衍生序列段為對CEA陽性人癌細胞免疫反應有貢獻的MHC II類表位。
·包含選自圖4至7描述的任一序列的可變重鏈和/或選自圖8和圖9描述的任一序列的可變輕鏈的對應免疫球蛋白分子。
·對應的免疫球蛋白分子，其中可變重鏈和/或輕鏈包含與選自下列序列段具同一性的一個或多個序列段。
(i)人CEA的345-354；(ii)人CEA的387-396(iii)人CEA的571-579(iv)人CEA的629-645(v)人CD55的148-167·包含生物學有效量的上述免疫球蛋白分子、佐劑、和任選地包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
·任何上述免疫球蛋白分子或藥物組合物的用途，用於製備對患CEA陽性實體腫瘤或轉移腫瘤的人個體進行疫苗接種的藥物，其中優選地所述疫苗接種在所述人個體中引起提高的刺激CD8和/或CD4陽性T細胞。
·用於產生適合用於治療患CEA(癌胚抗原)陽性實體腫瘤或轉移腫瘤的人個體的基於人工設計的免疫球蛋白分子的疫苗分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)選擇非人抗獨特型抗CEA抗體，優選小鼠抗體708，(ii)將非人恆定區用人恆定區代替，(iii)用衍生自CEA的序列段部分或完全替代一個或多個高變區(CDR)，由此可能包括與所述CDR鄰近的構架殘基，且所述方法任選地包括選自以下的一個或多個步驟(iv)將可變區內的序列段用來自CD55抗原或抗獨特型抗CD55抗體的CDRs的序列段替代，(v)將可變區內的序列段用對CEA陽性人癌細胞的免疫反應有貢獻的MHC I類和/或MHC II類表位序列段替代，(vi)去除可變區內對CEA陽性人癌細胞的免疫反應無貢獻的潛在MHC II類表位。
本發明的第一個實施方案提供的抗體分子包含具有人恆定區的抗體708。
第二個實施方案提供了具有人恆定區和V區結構域被特徵性修飾的抗體708。在所述分子的一個或多個CDR區內進行了優選的修飾並導致與人CEA具同一性序列段的存在。認為這些CEA序列元件為「目的」表位。又一實施方案中通過引入其它CEA衍生的序列元件進一步增加目的CEA表位數量。又一實施方案中通過胺基酸殘基替代又在序列內額外包括備選的目的表位。特別需要的備選表位是來自人CD55抗原或稱為105AD7的小鼠抗體的序列元件，稱為105AD7的小鼠抗體本身為可提供CD55蛋白分子模擬物的抗獨特型單克隆抗體[Maxwell-Armstrong，C.A.，等人(2001)Bri.J.Cancer 841433-1436]。這些另外的目的表位可在包括CDRs和或鄰近構架結構域的位置插入到抗體的V區。
在本發明的又一實施方案中，提供了在V區結構域內去除了不需要表位序列的包含一個或多個目的表位序列的抗體序列。在這種情況下這些序列為針對MHC II類的表位並且通過對人群中存在的至少一個MHC II類同種異型的配體構成的肽中通過公正的胺基酸替代而移出。
在本發明的方案下提供了4個不同H鏈V區序列和2個不同L鏈V區序列。本發明的公開對可提供組成完整抗體分子的H鏈和L鏈的可能組合沒有限制。完整抗體分子的組成可通過本領域公知的重組DNA技術及純化和處理抗體分子的方法完成。於此公開的編碼多肽序列的多核苷酸(例如DNA)分子同樣在本發明範圍內並為優選的實施方案。
本發明的抗體分子用於完整應用但這不表明是限制性的，並且抗體的免疫原性片段也可考慮應用。因此Fv、Fab或F(ab′)2或其它衍生物可用重組技術或用常規的抗體蛋白酶剪切和純化技術製備。
於此公開的抗體在包含免疫原性量及最優選治療量的至少一種本發明經修飾抗體分子的組合物中有實用性是本發明的一個目的。免疫原性量或治療量為抗體組合物能對接受治療的患者刺激免疫反應並且最優選患者的免疫反應有體液反應和細胞反應這兩者的量。最希望提供其治療量導致患者免疫系統對表達CEA的腫瘤細胞顯示增強活性的組合物。組合物在清除腫瘤細胞或阻止腫瘤生長中有治療作用。
附圖簡述

圖1提供了708抗獨特型抗體和CEA的CDR區序列比較。粗體胺基酸為顯示同一性的胺基酸並將下劃線標在下一個胺基酸中具同一性或相似性的胺基酸下。
圖2提供了708抗獨特型重鏈CDR2和CDR3可變區MHC結合基序分析的實例。粗體胺基酸為顯示同一性的胺基酸並將下劃線標在下一個胺基酸中具同一性或相似性的胺基酸下。
圖3顯示抗體708可變區的蛋白質序列(單字母代碼)。A＝重鏈；B＝輕鏈。有下劃線的序列為CDRs。FR＝構架序列。CDR名稱根據Kabat的方案[Martin，A.C.R.(1996)，蛋白質結構、功能和遺傳，25130-133]但根據本發明殘基編號已進行個別改變。
圖4顯示708VH1的蛋白質序列(單字母代碼)。該序列包含去除不需要表位的708VH。有下劃線的序列為CDRs。
圖5顯示708VH2的蛋白質序列(單字母代碼)，該序列包含去除不需要表位並摻入額外CEA相關序列的708VH。有下劃線的序列為CDRs。
圖6顯示708VH3的蛋白質序列(單字母代碼)，該序列包含去除不需要表位並摻入額外CEA和CD55衍生序列的708VH。有下劃線的序列為CDRs。
圖7顯示708VH4的蛋白質序列(單字母代碼)，該序列包含去除不需要表位並摻入額外CEA和105AD7衍生序列的708VH。有下劃線的序列為CDRs。
圖8顯示708VL1的蛋白質序列(單字母代碼)，該序列包含去除了不需要表位的708VL。有下劃線的序列為CDRs。
圖9顯示708VL2的蛋白質序列(單字母代碼)，該序列包含去除不需要表位並摻入額外CEA相關序列的708VL。有下劃線的序列為CDRs。
圖10顯示CEA的蛋白質序列(單字母代碼)。
圖11顯示CD55抗原的蛋白質序列(單字母代碼)。
發明詳述本發明的分子為作為抗癌疫苗的活性組分有實用性的經修飾抗體分子。本發明因此涉及治療性治療人疾病。該分子來源於稱為708的抗獨特型抗體。708單克隆抗體為針對抗CEA單克隆抗體NCRC23製備的。天然的708抗體能阻止NCRC23與其抗原的相互作用並均能誘導特異識別該抗原的抗體和T細胞反應，但自然小鼠708抗體不能刺激正常供體的淋巴細胞[Durrant，L.G.等人(1992)，出處同上]。已對天然708抗體進行了許多修飾以改進其作為抗癌疫苗的能力。修飾導致如此處公開的組合物並為本發明的實施方案。對天然(親本)小鼠708抗體的所有修飾可用本領域公知的基因工程方法進行。
第一個此種修飾對每一變體708分子是共同的。此修飾是對恆定區結構域的改造使它們為人恆定區蛋白質序列。本領域一般稱此改造的抗體為嵌合抗體。在本發明中，將小鼠708抗體轉變為嵌合抗體在經修飾708分子作為抗癌疫苗方面有非常顯著效果。本發明人認識到刺激幼稚T細胞反應需要對抗原呈遞細胞如樹突狀細胞的好的靶向作用。本發明的每一經修飾708分子的人恆定區結構域能通過樹突狀細胞和其它細胞上的Fc(CD64)受體而被攝入。通過此途徑攝取顯示了導致均引發輔助性T細胞反應和細胞毒性T細胞反應[Durrant，L.G.，等人(2001)，Int.J.Cancer.92414-420]。在本情況下將人IgG1同種型改造進708衍生的V區，儘管原則上理解為任何能被Fc受體系統識別的同種型均可用於本發明方案。
708抗體的第一個修飾是轉換為嵌合抗體並且因此涉及到恆定區的改造，下一個修飾並因此為本發明的實施方案，為直接對親本708抗體的V區進行改造。708的V區序列在以前已進行描述[W098/52976]並且又提供了如圖3中的蛋白質序列。將互補決定區(CDR)序列對與CEA和相關序列如NCA的同源區已進行分析。CDRH2顯示與CEA三個特異區有同源性並且其中兩個也與NCA有同源性。第三個區在CEA特異區中。由於最初Ab1 NCRC23與CEA特異區結合，發現抗獨特型708應包含CEA同源序列是可以預計的。除了CDRH2發現的區域外，CDRH3顯示與CEA的三個區有同源性，這些區域與NCA也有同源性。多肽序列和多核苷酸序列的比較分析是本領域公知的並且許多軟體工具能進行這些比較。用於比較如上所述抗體708和CEA序列的一個軟體是「DNAstar」(DNASTARInc，Madison，Wl，美國)，該軟體有幾個特別用於蛋白質序列相似性分析的比對算法，包括Lipman Pearson[Lipman Pearson(1985)，Science2271435-1441]的工具。
也對抗體708的重鏈和輕鏈區及與識別的T細胞表位基序一致的人CEA區進行分析。此分析可用本領域公知的方法進行，例如如在W098/52976中描述或參考資料庫SYFPEITHI[Rammensee，H.G.等人(1999)Immunogenetics 50213-219]。一個分析顯示CDRH2區包括HLA-A3、A11、Aw68、B35、B53、DR1、DR3、DR7和DR8結合基序。對CEA序列的平行分析證實HLA-A3、DR1和DR7基序也存在於與CDRH2同源的CEA特異區。CDRH3區包含HLA-A2、A3、A11、A24、B27、DQ7、pan DR和DR1結合基序。HLA-A3基序也在CEA的同源區發現。雖然該CEA區也顯示與NCA同源，但NCA有一個胺基酸不同，其中為從亮氨酸變為精氨酸。由於亮氨酸為A3結合的關鍵袋殘基，表達NCA的細胞不可能將該表位遞呈給HLA-A3。這些結果表明具HLA-DR1或7及HLA-A3表型的患者對天然708均顯示輔助T細胞反應和細胞毒性T細胞反應並最可能對其CEA陽性腫瘤作出反應。
總之，這些結果和觀測數據導致理解天然708V區序列提供了CEA分子的分子模擬物。此外，這些模擬物似乎針對CEA序列上的許多不同位點並且接下來這些序列與許多T輔助細胞和細胞毒性T細胞基序一致。本發明人通過將序列進行修飾以增加分子內CEA樣序列的程度來尋找增加天然708序列的內在CEA樣免疫原性特性。該方案延伸到包括在與將插入的CEA衍生序列沒有預先存在同源性的位點處將另外CEA衍生序列元件插入到親本708V區。這已通過免疫球蛋白V區能在特定區(CDRs)接受高變序列但仍保持總體結構完整性的內在靈活性及如任何其它免疫球蛋白分子那樣被表達和加工的能力成為可能。該過程進一步受益於不需要工程化抗體而保留任何形式的抗原結合活性，真正最優選與任何抗原特別是細胞結合抗原無相互作用，通過本發明的製劑是可能的。
本發明的多肽分子是為了向受試患者的免疫系統提供免疫原性表位，以使患者免疫系統成為重新針對消除表達CEA的細胞而設計的。因此重要的是引發免疫系統的體液和細胞免疫並且這通過遞送強效的T輔助表位和MHC I類限制性表位來提供。在CEA序列中以前已鑑定了許多MHC I類限制性表位並在某些情況下這些MHC I類限制性表位已作為臨床試驗的受試物[Kwong，Y.等人(1995)JNCI 87982-990]。在本發明中，已將已知為MHC I類表位的CEA衍生序列段TLLSVTRNDV(345-353位殘基)和YLSGANLNL(571-579位殘基)改造入輕鏈的CDRs中。
除了CEA衍生序列段的用途外，本發明的又一重要特徵是摻入CD55序列和以來自抗體105AD7序列段形式的部分CD55分子的模擬物。CD55分子在正常人組織中廣泛表達，它的功能是保護細胞免受補體和自然殺傷(NK)細胞介導的裂解作用。CD55作為免疫治療靶的確實性來源於觀察到的多種腫瘤類型CD55表達增加及用抗體105AD7的研究結果。該抗體模擬CD55上的表位並且臨床試驗證實在疫苗接種方案中，用完整105AD7抗體治療的患者刺激T細胞反應[W097/32021和其中所有參考文獻]。
本發明第一次提供了以來自CEA、CD55和/或105AD7免疫原性表位組合為特徵的組合物。此外，在刺激人免疫反應方面將經證實的具生物學效力的每一表位作為免疫球蛋白分子的部分進行提供，較例如作為合成肽單獨提供的同樣表位的方案相比有顯著的技術和生物學的優越性。作為分子實體能將本發明的多肽描述為「抗原化抗體」。在參考文獻中報導的抗原化抗體包括以MHC I類和MHC II類表為組合位特徵的抗體[Zaghouani，H.等人(1993)Eur.J.Immunol.232746-2750；Xiong，S.等人(1997)NatureBiotech.15882-886和其中參考文獻]。本發明人理解這些方法沒有針對自身抗原，沒有利用獨特型決定簇，也沒有根據本發明採取步驟去除不需要免疫原性表位的非改造序列。同樣，這些以前的研究沒有提供針對癌免疫治療的組合物。
因此本發明提供了包含與CEA分子區具有同一性的序列段的經修飾V區序列。本發明也公開了與CD55分子中存在序列段有同一性的V區序列。又在另一實施方案中公開了包含來自抗體107AD5序列段的經修飾V區序列。特別是提供了包含與來自CEA序列的345-354、386-397、571-579和629-645位殘基相同的殘基；並與CD55分子的148-167位殘基相同序列的V區序列。將對應於抗體107AD5 VH鏈構架1的多數序列合併到本發明公開的一個變體中。特別優選按照圖7的序列的組合物，所述組合物包含將文中描述的708VH3序列中的對應區用107AD5 VH構架1區代替的序列元件。
應當理解對於插入到經修飾708分子的VH鏈的CEA序列元件，是插入到與親本分子存在CEA序列有顯著同源性的區域。因此優選的圖5所示VH組合物包含在VH鏈含有CDRH2區的區域處插入的CEA629-645位殘基並且也包括在VH鏈含有CDRH3區的區域處插入的CEA386-397位殘基。優選的VL鏈組合物提供了在VL鏈含有CDRL1和CDRL3區的區域處分別插入的CEA序列元件345-354和571-579位殘基(圖9)。包含CD55序列元件如148-167區的優選組合物包括在VH鏈包含構架1的遠側部分和整個CDRH1區域中插入所述CD55序列(圖6)。
在此處術語「免疫原性」理解為在宿主動物及特別是「宿主動物」為人時，能引發、誘導或有助於體液反應和或T細胞介導的反應的能力。
在此處應用的「抗體」或「免疫球蛋白」是廣義上的並特別包括了完整單克隆抗體、多克隆抗體、來自至少兩個完整抗體分子的多特異抗體(例如雙特異抗體)和抗體片段，只要它們顯示所需要的生物學活性。該術語一般包括由連在一起的不同結合特異性的兩個或更多抗體或其片段組成的異種抗體。
取決於它們恆定區的胺基酸序列，完整抗體可指定為不同「抗體(免疫球蛋白)類型」。完整抗體有5個主要類型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些類型中一些可進一步分為「亞類」(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應於抗體不同類型的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。根據本發明抗體優選的主要類型為IgG，更具體為IgG1和IgG2。
抗體一般為分子量約為150,000的糖蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與一條重鏈連接，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有變化。每條重鏈和每條輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈在一端有可變結構域(VH)接著為許多恆定結構域。可變區包含含有抗原結合位點並負責抗體特異性的高變區或「CDR」區以及在抗體的親和力/親合力方面重要的「FR」區。高變區一般包含來自「互補決定區」或「CDR」 的胺基酸殘基(例如輕鏈可變域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位殘基及重鏈可變域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位殘基；和/或來自「高變環」的殘基(例如輕鏈可變域的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位殘基及重鏈可變域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位殘基；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。「FR」殘基(構架區)為除了如此處定義的高變區殘基外的可變域殘基。每條輕鏈在一端有一個可變域(VL)並在另一端有一個恆定域。輕鏈的恆定域與重鏈的第一個恆定域連在一起，並且輕鏈可變域與重鏈的可變域連在一起。認為特定的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間形成相互連結。來自任何脊椎動物物種抗體的「輕鏈」可根據它們的恆定域胺基酸序列分為兩個明顯不同類型稱為kappa(κ)和lambda(λ)中的一種。
術語「互補決定區」(CDR)是指相對於抗體V區結構域的其餘部分，其序列高變的抗體V區中的序列片段。抗原結合抗體的CDRs在決定抗體抗原相互作用中是決定性的。每個V區包含三個CDRs並且按規定來自VH的CDRs稱為CDRH1、CDRH2和CDRH3。同樣輕鏈CDRs稱為CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDRs通過稱為「構架」(FR)片段或結構域的相對不變序列的區域分散開。
在本發明中，對VH和VL鏈的CDRs及構架區均進行了修飾。一些修飾為分散的單個胺基酸的替代，而在其它情況下，已將新序列段插入到親本V區序列中。
如此處所用的，VH表示長約110至125個胺基酸殘基的多肽，它的序列對應於文中任何特定的VH鏈，與VL一起能組成免疫球蛋白分子。同樣，VL表示長約95-130個胺基酸殘基的多肽，它的序列對應於任何文中特定的VL鏈，與VH一起能共聯合併組成完全的免疫球蛋白四聚體。全長免疫球蛋白重鏈分子量約為50kDa並在N末端通過VH基因編碼及在C末端通過其中一個恆定區基因(例如γ)編碼。同樣，全長輕鏈分子量約為25kDa並在N末端通過V區基因編碼及在C末端通過κ或λ恆定區基因編碼。
本領域中術語「抗體」表示能結合、相互作用或此外與抗原連接的分子，並且應用的術語「抗原」是指能與抗體相互作用的物質。
在本發明上下文中容易認識到，構建的如以上定義及以下定義的經修飾免疫球蛋白序列是作為遞呈特定免疫原性肽序列的運載工具並且沒有預計或希望來自如此處公開的任何多肽序列組合形成的免疫球蛋白能作為抗原的結合實體。在除了抗原結合外的所有方面，如此處公開的分子保持了抗體的同樣結構域結構和恆定區序列並因此繼續認為是抗體。
如此處所用的術語「單克隆抗體」是指獲自一群基本同質抗體的抗體，即組成該群體的單個抗體除了可小量存在的可能自然發生的突變外是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，其針對單一的抗原性位點。此外，與包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑不同，每個單克隆抗體是針對抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體是有好處的因為它們可不汙染有其它抗體而合成。製備單克隆抗體的方法包括Kohler和Milstein的描述(1975，Nature 256，495)及在「單克隆抗體技術，嚙齒類和人雜交瘤的生產和特性」(1985，Burdon等人編輯，生物化學和分子生物學實驗室技術，第13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam)描述的雜交瘤方法，或可通過公知的重組DNA方法(參見，例如，US 4,816,567)進行製備。單克隆抗體例如也可用Clackson等人，Nature，352624-628(1991)和Marks等人J.Mol.Bill，22258，1-597(1991)描述的技術從噬菌體抗體庫中進行分離。
術語「嵌合抗體」是指這樣的抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類或亞類的抗體對應的序列相同或同源，而鏈的其餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體類或亞類的抗體及這些抗體的片段對應的序列相同或同源，只要它們顯示目的生物學活性(例如US 4,816,567；Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。製備嵌合抗體和人源化抗體的方法也是本領域已知的。例如，製備嵌合抗體的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)在專利中描述的方法(US 4,816,397；US 4,816,567)。
本發明的免疫球蛋白可為其中的完整抗體或其片段。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，優選包含抗原結合或其可變區部分。抗體片段的實例包括Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv和Fc片段、雙體、線性抗體、單鏈抗體分子和抗體片段形成的多特異抗體。「完整」抗體為包含抗原結合可變區以及輕鏈恆定域(CL)和重鏈恆定域CH1，CH2和CH3的抗體。優選地，完整抗體具有一個或多個效應子作用。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，每個片段包含單一抗原結合位點及CL和CH1區，以及殘餘的「Fc」片段，「Fc」片段的名稱反映了它容易結晶的能力。抗體的「Fc」區通常包含CH2、CH3及IgG1或IgG2抗體主要類型的鉸鏈區。鉸鏈區為將CH1區與CH2-CH3區結合在一起的約15個胺基酸殘基。胃蛋白酶處理產生有兩個抗原結合位點並還能交聯抗原的「F(ab』)2」片段。「Fv」為包含完全抗原識別位點和抗原結合位點的最小抗體片段。該區由一條重鏈和一條輕鏈可變域緊密的、非共價結合的二聚體組成。正是在這種構象中每個可變域的三個高變區(CDRs)相互作用確定了VH-VL二聚體表面的抗原結合位點。總之，六個高變區使抗體具有抗原結合特異性。然而，甚至單一可變區(或只包含抗原特異的三個高變區的半個Fv)有識別並結合抗原的能力，但比整個結合位點的親和力低。Fab片段也包含輕鏈的恆定區及重鏈的第一個恆定區(CH1)。「Fab』」片段通過在重鏈CH1區的羧基末端加入幾個殘基(包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸)而與Fab片段不同。F(ab』)2抗體片段最初作為在Fab』片段之間有鉸鏈胱氨酸的Fab』對而產生。也已知有抗體片段的其它化學偶聯(參見例如Hermanson，生物偶聯技術(BioconjugateTechniques)，Academic Press，1996；.US 4,342,566)「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含V及抗體的V結構域，其中這些結構域存在於單一多肽鏈中。優選地，Fv多肽在VH和VL結構域之間還包含能使scFv形成抗原結合所需要結構的多肽接頭。例如從Plückthun(單克隆抗體的藥理學(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編輯，Springer-Verlag，New York，第269-315頁(1994))，WO93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等人(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)了解了單鏈FV抗體。
本發明的免疫球蛋白也可為雙特異抗體。「雙特異抗體」為有兩個不同特異抗原結合位點的單一二價抗體(或其免疫治療有效片段)。例如第一個抗原結合位點針對血管發生受體(例如整聯蛋白或VEGF受體)，而第二個抗原結合位點針對ErbB受體(例如EGFR或Her 2)。雙特異性抗體可通過化學技術(參見例如Kranz等人(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5807)，通過「polydoma」技術(參見US 4,474,893)或通過重組DNA技術產生，所有這些技術本身是已知的。WO 91/00360，WO92/05793和WO 96/04305描述了其它方法。雙特異抗體也可從單鏈抗體進行製備(參見例如，Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。
本發明的免疫球蛋白也可為免疫偶聯物。術語「免疫偶聯物」是指抗體或免疫球蛋白或其免疫學有效片段分別地通過與非免疫學有效分子共價連接進行融合。優選該用於融合的部分為可糖基化的肽或蛋白質。所述非抗體分子可與抗體恆定重鏈的C末端或可變輕鏈和/或重鏈的N末端連接。所述用於融合的部分可通過接頭分子連接，接頭分子通常為包含3-15個胺基酸殘基的肽。根據本發明的免疫偶聯物由免疫球蛋白或其免疫治療有效片段(針對受體酪氨酸激酶、優選針對ErbB(ErbB1/ErbB2)受體和整聯蛋白拮抗肽或血管生成受體，優選整聯蛋白或VEGF受體)及TNFα或實質上由TNFα和IFNγ或另外合適細胞因子組成的融合蛋白組成，後者的N末端與所述免疫球蛋白的C末端，優選其Fc部分連接。該術語也包括包含雙特異或多特異免疫球蛋白(抗體)或其片段對應的融合構建體。
認為本發明的抗體分子作為疫苗製劑的活性(即免疫原性)組分發揮作用，其中術語「疫苗」描述了用於向受試者施用以誘導免疫反應的製劑。在本發明中免疫反應是治療目的，雖然疫苗可用作腫瘤外科切除的輔助治療或用於疾病或復發疾病的預防。
術語「T細胞表位」根據本發明的理解表示能結合MHC I類或II類，能刺激T細胞和/或也能結合(但不必是可測定地活化)T細胞與MHC I類或II類複合體的胺基酸序列。
文中及後附權利要求書中的如此處及附加的權利要求書中所用的術語「肽」為包括兩個或更多胺基酸的化合物。胺基酸通過肽鍵(其中下面進行定義)連接在一起。有20種不同的參與肽生物學產生的天然存在胺基酸，並且它們的任何數目可以任何順序連接形成肽鏈或肽環。肽的生物學產生中利用的所有天然存在胺基酸均為L-構型。合成肽可利用常規合成方法，利用L-胺基酸、D-胺基酸或兩種不同構型胺基酸的多種組合進行製備。一些肽只包含幾個胺基酸單位。短肽，例如低於十個胺基酸單位，有時稱為「寡肽」。包含大量胺基酸殘基例如達100或更多胺基酸殘基的其它肽，稱為「多肽」。按常規，「多肽」可認為是包含三個或更多胺基酸的任何肽鏈，而「寡肽」一般認為是特別類型的「短」多肽。因此，如此處所用的，可以理解任何引用的「多肽」也包括寡肽。此外，任何引用的「肽」包括多肽、寡肽和蛋白質。胺基酸的每個不同排列形成不同的多肽或蛋白質。多肽的數目及由此可形成的不同蛋白質的數目實際上是無限的。
本發明提供了一系列經修飾VH及經修飾VL序列。如以前所述，IgG類型的抗體分子包含通過二硫鍵聯合的兩個H鏈和兩個L鏈。應當理解原則上可以進行H鏈和L鏈的任何聯合併且一條途徑為在同一細胞中對有關抗體基因的共表達。對於本發明公開的多種H鏈和L鏈序列，沒有打算對任何特別的H鏈和任何特別L鏈的組合進行限制，雖然特別優選的一套組合為H鏈1與L鏈1、H鏈2與L鏈2、H鏈3與L鏈2及H鏈4與L鏈2。可考慮其它組合併例如可包括以圖3親本708V區之一為特徵的組合。
對於蛋白質衍生的抗原向MHC I類或II類分子的特異遞呈，蛋白質必需在適當的區室進行正確加工以接下來釋放和將肽遞呈給MHC I類或II類分子。本發明分子的人恆定區結構域及特別是優選的IgG1同種型的存在使蛋白質進入抗原遞呈細胞(APC)的機會增加到最大限度，在APC中蛋白質通過Fc(CD65)表面受體被攝取。一般的，如果蛋白質在細胞漿進行加工，有助於MHC I類肽的遞呈，而如果蛋白質在內體區室進行加工，有助於MHC II類的遞呈。外源蛋白質抗原經常引起較好的MHC II類介導的反應(特別是輔助性T細胞擴增)，但MHC I類介導的反應較弱。通過Fc(CD65)受體攝取代表一個特殊情況並導致均對I類和II類表位的最佳遞呈[Durrant，L.G.(2001)，出處同上]。
MHC I類和MHC II類限制的組織特異性肽如產生自CEA蛋白質及可被T細胞識別的共同特徵為它們對MHC肽結合溝的低親和力[Pardoll，D.(1998)Nat.Medicine 4525-531]。因此，這些表位在相關術語中，以低效率向APC表面遞呈並且它們的同種T細胞群不能形成對癌抗原自身肽的耐受。因此，非常需要提供在載體中可呈遞癌抗原的疫苗製劑，所述載體能將呈遞目標癌抗原的可能性達到最大並且遞呈的可能競爭性肽的數目達到最小。在這點上，對本發明的分子存在的能結合MHC II類分子的肽進行分析並在本發明的一個實施方案中對這些有能力結合MHC II類的不需要的肽序列進行改變以使所述結合相互作用不再發生。
肽結合特定MHC II類分子用於向APC表面遞呈的能力取決於許多因素，最顯著的是它的一級序列。肽一級序列會影響肽的蛋白水解習性並影響它與MHC II類分子的肽結合裂(cleft)中的結合親和力。APC表面的MHC II類肽複合體向能識別暴露的肽殘基及MHC II類分子這兩者所提供決定簇的特定T細胞受體(TCR)遞呈了一個結合面。在本領域中，有鑑別能結合MHC II類分子的合成肽的方法，包括例如用於發現廣泛反應DR限制性表位的方法[WO99/61916]，但由於加工途徑或其它現象，這些肽不能在所有情況下特別是在體內作為T細胞表位。也提供了通過計算方法對實驗確定的T細胞表位掃描而識別序列基序或備選地用計算技術預測MHC II類結合肽而檢測T細胞表位的方法。WO02/069232提供了一個實施例，該實施例講授了一個鑑別潛在結合人MHC II類DR同種異型亞型的多肽序列的計算threading方法。
本發明的特別目的是提供這樣的多肽疫苗分子，其中針對疫苗的免疫反應最大集中於目的T細胞表位組並且減少了不需要的潛在T細胞表位的數目。可能應用以前公開的任何方法[WO98/59244；WO98/52976；WO00/34317，WO02/069232]鑑定708衍生肽與MHC II類分子的結合特性。實際上，本發明具體體現的組合物來源於利用WO02/069232中概括方案的軟體工具進行了分析之後。簡而言之，該軟體在肽MHC II類結合相互作用水平上模擬抗原遞呈的生物學過程以提供任一給定肽序列的結合分值。該分值由人群中現存的許多主要MHC II類同種異型來確定。由於這個方案能檢驗任一蛋白質序列，可預測胺基酸替代、添加或缺失在肽與MHC II類結合溝相互作用的能力方面引起的後果。因此可設計包含數目降低的能與MHC II類相互作用肽並因此作為免疫原性T細胞表位的新序列組合物。
得到在此處公開的組合物的方法因此包括第一，確定不需要的MHCII類結合肽，第二，通過胺基酸替代消除不需要的MHC II類結合序列使序列不能再與MHC II類系統結合，以及第三，對經修飾序列的任何繼續結合MHCII類分子的能力或在修飾期間可能又引入的存在的任何MHC II類配體進行再分析。
因此MHC II類表位的去除涉及胺基酸替代以產生去除不需要T細胞表位的經修飾變體。胺基酸替代在預計可達到基本上降低或消除不需要T細胞表位的肽序列的適當位點進行。「適當位點」等同於MHC II類結合溝內提供的一個結合袋中胺基酸殘基的結合。最優選在肽的所謂P1或P1錨定部位處改變與MHC結合裂中第一個袋的結合。對肽的P1錨定殘基與MHC II類結合裂中第一個袋之間的結合相互作用的質認為是整個肽總體結合親和力的主要決定因素。在肽的此部位適當的替代是將其替換為較不易與袋相匹配的殘基，例如，替代為更親水的殘基。也考慮了肽中等同於在MHC結合裂中其它袋區結合位置處的胺基酸殘基並落入本發明的範圍。
如本領域技術人員清楚的，可進行多次備選替代以達到去除不需要表位的目的。然而產生的序列可與此公開的特異組合物仍有廣泛同源性並因此歸入本發明的範圍。一般得到與本發明特異序列比它們的最小同源區有約70％或更高同源性並且又保持同樣可操作性的序列。這些序列同樣歸入本發明的範圍。
本發明公開了經修飾的包含與CEA分子區有同源性序列段的V區序列。在該同源性存在處，有親本708抗體序列的本質特徵。本發明提供了708親本序列的經修飾形式並且在這方面提供了包含殘基替代的抗體構架域區序列，所述殘基替代是為了消除或降低施用於人受試者的分子的不需要免疫原性活性。不需要免疫原性活性涉及來源於親本小鼠V區的序列元件並且不包括與人CEA、人CD55或有意改造入序列的105AD7抗體元件同源的序列元件。如此處定義的不必要或不需要表位可通過不需要序列元件與MHC II類分子結合的能力進行測定或通過在MHC II類分子內遞呈刺激T細胞或與可結合人T細胞或T細胞受體複合物結合的可溶性MHCII類複合物結合的能力進行測定。
在本發明的方案下提供了4條不同的H鏈V區序列及2條不同的L鏈V區序列。本公開對可提供組合完整抗體分子的H鏈與L鏈的可能組合沒有提供限制。完整抗體分子的組合可通過重組DNA技術及本領域公知的純化和操作抗體的方法獲得。必要的技術在著作中進行了充分解釋，例如「分子克隆實驗室手冊」(「Molecular CloningA LaboratoryManual」)第二版(Sambrook等人，1989)；「寡核苷酸合成」(「Oligonucleotide Synthesis」)(M.J.Gait，編輯1984)；「動物細胞培養」(「Animal Cell Culture」)(R.I.Freshney，編輯，1987)；「酶學方法」(「Methods in Enzymology」)(Academic Press，Inc.)；「實驗免疫學手冊」(「Handbook of Experimental Immunology」)(D.M.Weir C.C.Blackwell，編輯)；「哺乳動物的基因轉移載體」(「Gene TransferVectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller M.P.Calos，編輯，1987)；「分子生物學最新方法」(「Current Protocols in Molecular Biology」)(F.M.Ausubel等人，編輯，1987)；「PCR聚合酶鏈反應」(「PCRThePolymerase Chain Reaction」)(Mullis等人，編輯，1994)；「免疫學最新方法」(「Current Protocols in Immunology」)(J.E.Coligan等人，編輯，1991)。
本發明優選的分子可通過幾個途徑中的任何一個進行製備，但最優選利用常規的重組方法進行。用在此處提供的蛋白質序列及信息推導編碼任何優選抗體V區的多核苷酸(DNA)是相對容易的方法。這可例如用計算機軟體工具諸如DNSstar軟體包[DNAstar Inc，Madison，Wl，美國]或類似工具達到。有編碼本發明優選多肽或其重要同源物能力的任何這些DNA序列均可考慮作為本發明的實施方案。
作為一般方案，任何VH或VL鏈基因可用基因合成進行製備並克隆入合適的表達載體。接下來將表達載體導入宿主細胞並對細胞進行篩選和培養。抗體分子易於從培養基進行純化並製成用於治療性施用的疫苗製劑。
通過非限制性實施例，一個此方案涉及用系列合成寡核苷酸進行基因合成的方法。基因用連接酶鏈反應(LCR)進行裝配，其中特徵為互補末端的寡核苷酸退火，然後通過用聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增和填平。PCR通過加入增高濃度的側翼寡核苷酸作為引物進行驅動。PCR產物通過來自包含5』和3』免疫球蛋白基因側翼區的載體進一步PCR裝配進全長抗體基因中並亞克隆到表達載體中用於完整抗體的表達。裝配的VH和VL基因可作為突變發生的模板並構建多個變體抗體序列諸如任何在此處公開的序列。雖然易於應用其它方法和系統，但用如Higuchi等人描述的「重疊延伸PCR」策略[Higuchi等人(1988)Nucleic Acids Res.167351]尤其方便。
包含可變區盒的全長免疫球蛋白基因用重疊PCR進行裝配。簡單地說，載體M13-VHPCR1與M13-VKPCR1[Orlandi等人(1989)，PNAS，893833-7]的DNA用作模板以產生用於每一目的VH及VL鏈的另外兩個重疊PCR片段，所述重疊PCR片段包括有小鼠重鏈免疫球蛋白啟動子並編碼前導信號肽的5』側翼序列以及包括剪接位點及內含子序列的3』側翼序列。這樣產生的用於每一VH和VL的DNA片段用所需要的側翼引物在PCR中進行聯合，以獲得全長DNA序列。
將5』和3』側翼序列完全的重鏈基因克隆入表達載體pSVgpt[Reichmann等人(1988)Nature，332323]中，所述表達載體pSVgpt包括人IgG1恆定區結構域[Takahashi等人(1982)Cell，29671]及用於在哺乳動物中選擇的gpt基因。將5』和3』側翼序列完全的輕鏈基因克隆入表達載體pSVHyg[Reichmann等人，出處同上]中，所述表達載體pSVHyg中gpt基因被潮黴素抗性基因(hyg)代替並包括人κ恆定區結構域[Heiter等人(1980)Cell，22197]。對於這兩個載體，完全裝配的VH或VL基因作為HindIII/BamHI片段進行亞克隆，所述HindIII/BamHI片段通過凝膠電泳進行純化並用公知的方法和試劑系統進行處理。
重鏈和輕鍊表達載體用電穿孔共轉染到不產生免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤NS0中，所述NS0獲自歐洲動物細胞培養物保藏中心(ECACC)。對表達gpt基因的克隆用添加10％(v/v)胎牛血清及抗生素(例如來自Gibco，Paisley，英國)及0.8μg/ml黴酚酸和250μg/ml黃嘌呤(Sigma，Poole，英國)的Dulbecco改良的Eagles培養基(DMEM)進行篩選。由轉染細胞克隆產生的人抗體通過用於人IgG的ELISA易於進行檢測[Tempest等人(1991)BioTechnology 9266]。將分泌抗體的細胞系進行擴增並將抗體通過蛋白A親和層析進行純化[Harlow E. Lane D.；出處同上]。經純化抗體的濃度用檢測目的抗體的人κ恆定區的ELISA進行確定。
根據本發明的分子可在單一療法中單獨施用或與其它藥學有效藥聯合施用。其中所述藥物可包括免疫治療劑或具有細胞毒性的有效標記放射性同位素的化學治療劑或其它細胞毒性劑如細胞毒性肽(例如細胞因子)或細胞毒性藥等。如此處所用的術語「細胞毒性劑」是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語用於包括放射活性同位素、化學治療劑以及毒素諸如細菌、真菌、植物或動物來源的酶學活性毒素或其片段。該術語也可包括細胞因子家族的成員，優選IFNγ以及也有細胞毒性活性的抗腫瘤劑。術語「化學治療劑」或「抗腫瘤劑」根據本發明的理解是指作為如上說明的「細胞毒性劑」類的成員，並包括發揮抗腫瘤作用的化學劑，即直接對腫瘤細胞例如通過抑制細胞作用或細胞毒性作用，並且不是間接通過如生物學反應修飾的機制來防止贅生性細胞的發展、成熟或擴散。根據本發明合適的化學治療劑優選天然或合成化合物，但不排除生物學分子如蛋白質、多肽等。在商業用途、臨床評估和臨床前研發中可獲得許多抗腫瘤劑，所述抗腫瘤劑在本發明中可包括通過與TNFα及如上引用的抗血管發生劑，任選與其它因子如EGF受體拮抗劑聯合治療用於治療腫瘤/瘤形成。應當指出化學治療劑可任選與上述藥聯合一起施用。化學治療劑的實例包括烷化劑，例如，氮芥、乙烯亞胺化合物、烷基磺酸酯和有烷基化活性的其它化合物如亞硝脲、順氯氨鉑、達卡巴嗪；抗代謝藥，例如，葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如，長春花屬生物鹼及鬼臼毒素衍生物；細胞毒性抗生素和喜樹鹼衍生物。優選的化學治療劑或化學治療包括阿米斯丁(氨磷汀)、順鉑、達卡巴嗪(DTIC)、更生黴素、雙氯乙基甲胺(氮芥)、鏈唑黴素、環磷醯胺、卡氮芥(BCNU)、羅氮芥(CCNU)、阿黴素(阿得利亞黴素)、阿黴素脂質體(doxil)、吉西他濱(gemzar)、柔紅黴素、柔紅黴素脂質體(daunoxome)、甲基苄肼、絲裂黴素、阿糖胞苷、依託泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、長春鹼、長春新鹼、博來黴素、紫杉醇(taxol)、多西紫杉(taxotere)、阿地白介素、天冬醯胺酶、白消安、碳鉑、克拉利平、喜樹鹼、CPT-11、10-羥基-7-乙基-喜樹鹼(SN38)、達卡巴嗪、氟尿嘧啶、氟達拉濱、羥基脲、異環磷醯胺、去甲柔毛黴素、美司鈉、α幹擾素、β幹擾素、依立替康、米託蒽醌、拓撲替康、醋酸亮丙瑞林、甲地孕酮、苯丙氨酸氮芥、巰基嘌呤、光輝黴素、鄰對滴滴涕、天門冬醯胺酶、噴司他丁、哌泊溴烷、光輝黴素、鏈唑黴素、他莫昔芬、替尼泊苷、睪內酯、硫鳥嘌呤、噻替哌、尿嘧啶芥、長春烯鹼、苯丁酸氮芥與其組合。根據本發明最優選的化學治療劑為順鉑、吉西他濱、阿黴素、紫杉醇(taxol)、博來黴素。
用經修飾的抗體組合物治療性治療人的方法是本發明的又一方面。對於個體的施用，生產的任何經修飾的抗體組合物優選至少80％純度並且不含熱原和其它汙染物。還應理解經修飾抗體蛋白質的治療性組合物可與本領域通常知道的佐劑和載體物質聯合應用。這些物質自身不提供免疫原性表位。公知的佐劑包含礦物油乳劑並且稱為弗氏佐劑，但同樣可考慮其他製劑例如EP-A-0745388、EP-A-0781559、US，5,057,540；US，5,407,684；US，5,077,284；US，4,436,728；US，5,171,568和US，4,726,947或類似製劑。疫苗製劑優選與可藥用賦形劑施用。這些賦形劑可作為稀釋劑但可包括穩定劑、溼潤及乳化劑、鹽、包封劑、緩衝劑和皮膚穿透促進劑。在Remington′s藥物科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Alfonso R.Gennaro，編輯，第18版，1990)中描述了實例。也可考慮將脂質體膠囊化作為製造用於治療用途蛋白質的方法並且該用途也可包括包含生物學反應調節劑如GM-CSF和或IL-2或其它蛋白質的治療方案。
認識到為引發免疫反應或治療CEA相關腫瘤的個體，疫苗製劑腸胃外施與個體，並可包括皮內、肌內或皮內施用。術語「癌」和「腫瘤」是指或是描述哺乳動物中以不受調節的細胞生長為顯著特徵的生理疾病。通過根據本發明的分子和藥物組合物，可對腫瘤優選CEA相關腫瘤進行治療，其中所述腫瘤諸如乳腺、心臟、肺、小腸、結腸、脾、腎、膀胱、頭和頸、卵巢、前列腺、腦、胰腺、皮膚、骨、骨髓、血液、胸腺、子宮、睪丸、子宮頸及肝臟的腫瘤。根據本發明優選結腸直腸癌、胃癌、胰腺癌、非小細胞肺癌和乳腺癌。
根據本發明的分子通過藥物組合物向個體施用。本發明的「藥物組合物」可包含降低或避免與本發明聯合治療(「輔助治療」)相關副作用的藥劑，包括，但不限於這些藥劑，例如降低抗癌藥毒性作用的藥物，例如骨吸收抑制劑、心臟保護劑。所述輔助劑預防或降低與化學治療、放射治療或手術相關的噁心和嘔吐發生率，或降低與施用骨髓抑制性抗癌藥相關的感染發生率。輔助劑是本領域公知的。
根據本發明的免疫球蛋白劑優選與佐劑如BCG和免疫系統刺激劑聯合施用。
施用的疫苗製劑的量取決於幾個因素，例如患者的疾病和施用途徑。非限制性實例劑量方案為約0.1mg至約20mg，並且劑量方案可每兩周進行四次注射，接著按需要每個月進行注射。維持劑量取決於正在治療個體的疾病和反應。
認為本發明的疫苗製劑特別用於作為癌常規外科手術的治療輔助藥並因此作為降低腫瘤再現及臨床復發的可能性。
疫苗施用的效果包括臨床試驗以確定癌的進程，例如檢測炎性指示物、乳房造影法、放射性閃爍顯象術及本領域公知的任何其它臨床手段。
特別優選確定接受本發明疫苗患者的細胞免疫反應。特別優選的測定法集中於特異性T細胞活性並包括例如測定T細胞增殖。在該測定法中，外周血單核細胞(PBMC)獲自全血樣本。細胞在存在合成肽如來自人CEA或人CD55的條件下進行培養或備選地用多種濃度的全CEA蛋白質或經輻照的CEA表達細胞進行攻擊。優選地，刺激細胞與應答細胞自體同源。刺激指數(SI)一般用3H-胸苷的摻入作為細胞增殖的標記。在此測定法中如果測定的SI值至少在2.0優選2.5或更大，則可判定陽性CEA或CD55誘導的增殖。對於此測定法，SI＝CPM試驗培養物/CPM未處理的對照培養物。
對細胞毒性T細胞形成提供「幫助」的Th1 T細胞的刺激，可通過在第8-10天的培養上清中測定γ幹擾素的產生進行測定。γ幹擾素的產生易於用商業上可獲得的基於ELISA的系統進行測定。
CEA或CD55特異性細胞毒性T細胞的活性也是特別有用的信息。該類型特別合適的測定法由Kantor等人[Kantor，J.等人(1992)Cancer Res.526917-6925 JNCI(1992)841084-1091]和Kwong等人[Kwong，Y.等人(1995)JNCI 87982-990]均有描述。該測定法涉及測定從標記的表達CEA的靶細胞釋放到培養基中的51Cr並且測定特異釋放到培養基中的51Cr與單獨培養的標記靶(陰性對照)和用去汙劑裂解靶(陽性對照)的百分比。
作為又一非限制性實例，現在描述了用於衍生本發明優選蛋白質序列的方法嵌合708的產生以前已進行描述(Durrant，L.G.，等人(2001)，Int.J.Cancer.92414-420)。用WO98/52976描述的方法對可變區蛋白質序列中不需要的T細胞表位進行檢查並設計序列變體。對人CEA蛋白質序列[Schrewe，H.等人(1990)，Mol.Cell.Biol.102738-2748]，人CD55蛋白質序列[Caras，I.W.等人(1987)Nature 325545-549]及抗體107AD5可變區序列[WO97/32021]進行另外的分析。用商業上可獲得的軟體包(例如，「DNAstar」，DNASTAR Inc，Madison，Wl，美國)進行同源性比較分析，並如在其它處描述的[WO98/59244；WO98/52976；WO00/34317；Rammensee，H.G.等人(1999)出處同上]進行表位分析。對有潛力作為MHCII類結合配體的肽序列進行分析的方案在以前已進行詳細描述[WO02/069232]。用此方法，在抗體708V區結構域中已鑑別了針對一個或多個同種異型的多個MHC II類配體。將去除了MHC II類配體的變體序列進行編輯。這通過反覆幾輪的胺基酸替代及確定表位去除的再分析達到。在圖4-9中顯示了目的組合物的蛋白質序列。
權利要求
1.衍生自親本抗獨特型抗CEA抗體並包含來自人源的恆定區及人工設計的可變區的免疫球蛋白分子或其片段，所述人工設計的可變區包含來自人腫瘤抗原CEA(癌胚抗原)的多於4個連續胺基酸殘基的一個或多個序列段。
2.根據權利要求1的免疫球蛋白分子，其中所述序列段之一包含5-20個連續胺基酸殘基。
3.根據權利要求1或2的免疫球蛋白分子，其中至少一個所述序列段為所述免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈的互補決定區(CDR)組分或與所述CDR鄰近的構架區鄰近殘基重疊。
4.根據權利要求3的免疫球蛋白分子，其中所述組分形成所述CDR的30至100％胺基酸殘基。
5.根據權利要求3或4的免疫球蛋白分子，其中所述CDR為所述免疫球蛋白重鏈的CDR。
6.根據權利要求3的免疫球蛋白分子，其中每條重鏈和/或輕鏈的至少兩個CDR完全由CEA衍生的序列段組成。
7.根據權利要求1至6中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其中所述親本抗獨特型抗體為小鼠抗體708。
8.根據權利要求1至7中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其在可變區內額外包含來自人CD55抗原或抗獨特型抗CD55抗體高變區的5至25個連續胺基酸殘基的序列段。
9.權利要求8的免疫球蛋白分子，其中所述抗獨特型抗CD55抗體為小鼠抗體105AD7。
10.根據權利要求1至9中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其中在可變區內對於針對CEA陽性人癌細胞的免疫反應沒有貢獻的其它潛在MHC II類表位已通過胺基酸替代去除。
11.根據權利要求1至10中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其在可變區內額外包含為MHC I類表位的CEA衍生序列段。
12.根據權利要求11的免疫球蛋白分子，其中所述CEA衍生序列段為TLLSVTRNDV和YLSGANLNL。
13.根據權利要求11或12的免疫球蛋白分子，其中所述CEA衍生序列段是所述免疫球蛋白輕鏈的一個或多個CDR的部分，或所述CEA衍生序列段形成所述免疫球蛋白輕鏈完整的一個或多個CDR。
14.根據權利要求1至12中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其在可變區內額外包含對CEA陽性人癌細胞的免疫反應有貢獻的MHC II類表位的CEA衍生序列段。
15.根據權利要求1至13中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其包含選自圖4至7中描述的任一序列的可變重鏈。
16.根據權利要求1至13中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其包含選自圖8或圖9描述的任一序列的可變輕鏈。
17.根據權利要求1至13中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其包含選自圖4至7中描述的任一序列的重鏈及選自圖8或圖9描述的任一序列的輕鏈。
18.根據權利要求1至11中任意一項所述的免疫球蛋白分子，其中可變重鏈和/或輕鏈包含與選自以下的序列段相同的一個或多個序列段(i)人CEA的345-354；(ii)人CEA的387-396；(iii)人CEA的571-579；(iv)人CEA的629-645；(v)人CD55的148-167。
19.藥物組合物，其包含生物學有效量的權利要求1至18中任意一項所述的免疫球蛋白分子、佐劑及任選地可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
20.上述權利要求中任意一項所述的免疫球蛋白分子或藥物組合物的用途，用於製備對患CEA陽性實體瘤或轉移瘤的人個體進行疫苗接種的藥物。
21.權利要求20的用途，其中所述疫苗接種在所述個體中引起對CD8和/或CD4陽性T細胞的刺激提高。
22.用於產生適用於治療患CEA(癌胚抗原)陽性實體瘤或轉移瘤的人個體的基於經人工設計免疫球蛋白分子的疫苗分子的方法，所述方法包括下列步驟(i)選擇非人抗獨特型抗CEA抗體，(ii)將非人恆定區用人恆定區替代，及(iii)用衍生自CEA的序列段部分或完全替代一個或多個高變區(CDR)，由此可能包括與所述CDR鄰近的構架殘基。
23.權利要求22的方法，其還包括選自以下的一個或多個步驟(iv)將可變區內的序列段用來自CD55抗原或抗獨特型抗CD55抗體高變區的序列段替代，(v)將可變區內的序列段用對CEA陽性人癌起細胞反應的MHC I類和/或MHC II類表位的序列段替代，(vi)去除可變區內對CEA陽性人癌細胞的免疫反應無貢獻的潛在MHC II類表位。
24.權利要求22或23的方法，其中所述非人抗獨特型抗CEA抗體為小鼠抗體708。
全文摘要
本發明提供了適用作針對CEA陽性腫瘤的抗獨特型疫苗的分子，優選地為經設計的免疫球蛋白。所述分子對CEA荷瘤細胞均可誘導MHC I類和MHC II類介導的免疫反應，以產生有效且持久的宿主抗腫瘤反應。本發明提供了有改進疫苗特性的抗獨特型抗－CEA抗體，優選地為小鼠抗體708的經修飾形式。該修飾涉及將來自例如CEA、CD55抗原和CEA癌特異MHC表位的序列段導入到所述抗體分子的可變區中。
文檔編號C07K16/28GK1646567SQ03807864
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月7日 優先權日2002年4月9日
發明者G·卡特, F·J·卡爾 申請人:默克專利有限公司